成熟脑源性神经营养因子的抗体及其应用和诊断试剂盒
阅读说明：本技术 成熟脑源性神经营养因子的抗体及其应用和诊断试剂盒 (Antibody of mature brain-derived neurotrophic factor, application thereof and diagnostic kit ) 是由 郭炜 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种成熟脑源性神经营养因子的抗体及其应用和诊断试剂盒,涉及抗体技术领域。本发明公开的成熟脑源性神经营养因子的抗体其具有SEQ ID NO.1-3所示的重链互补决定区和SEQ ID NO.4-6所示的轻链互补决定区。该抗体可特异性识别成熟的脑源性神经营养因子,具有较高的特异性和灵敏度。(The invention discloses an antibody of a mature brain-derived neurotrophic factor, an application thereof and a diagnostic kit, and relates to the technical field of antibodies. The antibody of the mature brain-derived neurotrophic factor disclosed by the invention has a heavy chain complementary determining region shown in SEQ ID NO.1-3 and a light chain complementary determining region shown in SEQ ID NO. 4-6. The antibody can specifically recognize mature brain-derived neurotrophic factor, and has high specificity and sensitivity.)
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种成熟脑源性神经营养因子的抗体及其应用和诊断试剂盒。
背景技术
作为中枢神经系统中最广泛分布的神经营养因子(BDNF)，BDNF的功能和水平与多种神经疾病密切相关，例如阿尔茨海默病(Allen et al.,2011)。针对阿尔茨海默病(AD)及其早期症状MCI患者的样本研究显示，患者海马、皮层等脑区的BDNF水平较正常人体样品有不同程度的降低(Peng et al.,2005)。由于BDNF可以部分穿过血脑屏障，因此脑脊液中BDNF的水平与其外周水平高度相关。近年来关于AD与外周BDNF水平的研究逐渐增多。Qin等人在2017年发表的荟萃分析(Meta analysis)显示，相比于正常组，AD患者的外周血BDNF水平显著偏低，且MCI患者也表现出外周BDNF水平降低的趋势(Qin et al.,2017)。这进一步证明了BDNF水平的降低与AD的病情发展紧密相关。但是，由于样品(如血清、血浆)的处理方式存在差异，更重要的是BDNF存在前体BDNF(ProBDNF)和成熟BDNF(mBDNF)两种形态，而目前缺乏特异性高的针对mBDNF的抗体。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供成熟脑源性神经营养因子的抗体及其应用和诊断试剂盒，本发明提供的抗体可特异性识别成熟的脑源性神经营养因子，具有较高的特异性和灵敏度，可用于检测成熟脑源性神经营养因子。
本发明是这样实现的：
一方面，本发明提供一种成熟脑源性神经营养因子的抗体或其抗原结合片段，所述抗体具有重链互补决定区和轻链互补决定区，其中，所述重链互补决定区包括：SEQ IDNO.1所示的CDR1、SEQ ID NO.2所示的CDR2和SEQ ID NO.3所示的CDR3，所述轻链互补决定区包括：SEQ ID NO.4所示的CDR1、SEQ ID NO.5所示的CDR2和SEQ ID NO.6所示的CDR3。
在本发明中所用术语“抗体”也称为“免疫球蛋白(Ig)”，并且其为通过选择性作用于抗原而参与生物免疫的蛋白质的通用术语。在自然界中发现的完整抗体通常由两对轻链(LC)和重链(HC)(其每个是由若干结构域组成的多肽)组成，或两对HC/LC作为基本单元。构成哺乳动物抗体的重链有五种类型，其用希腊字母表示：α、δ、ε、γ和μ，并且不同类型的重链分别构成不同类型的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM T。构成哺乳动物抗体的轻链有两种类型，其用λ和κ表示。
根据氨基酸序列的可变性，抗体的重链和轻链在结构上分为可变区和恒定区。根据抗体的类型，重链的恒定区由三个或四个重链恒定区组成，例如CH1、CH2和CH3(IgA、IgD和IgG抗体)和CH4区(IgE和IgM抗体)，而轻链由一个恒定区CL组成。重链或轻链的可变区分别由重链可变结构域(VH)或轻链可变结构域(VL)组成。轻链和重链由一个共价二硫键连接，而其可变区和恒定区平行排列，并且两个重链分子(其与轻链连接)通过两个共价二硫键相互连接，从而形成完整的抗体。整个抗体通过重链和轻链的可变区特异性结合抗原。整个抗体由两对重链和轻链(HC-LC)组成，因此一个完整的抗体分子具有二价单特异性，其中一个完整的抗体分子通过两个可变区与两个相同的抗原结合。
含有抗体的抗原结合位点的可变区被分成骨架区(FR，具有低序列可变性)和互补决定区(CDR，其为具有高序列可变性的高变区)。在VH和VL中，三个CDR和四个FR以从N端到C端的方向以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的顺序排列。在抗体的可变区中具有最高序列可变性的CDR是与抗原直接结合的位点，并且其在抗体的抗原特异性中至关重要。
本发明提供的抗体具有如上所述氨基酸序列的重链互补决定区和轻链互补决定区，通过该互补决定区，该抗体可特异性识别成熟的脑源性神经营养因子，可用于检测成熟脑源性神经营养因子，具有较高的特异性和灵敏度；其也可应用于以成熟脑源性神经营养因子为标志物的神经疾病的诊断。
可选的，本发明的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.7所示。
可选的，本发明的一些实施方案中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.8所示。
可选的，本发明的一些实施方案中，所述抗原结合片段选自所述抗体的Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv和Fv中的任意一种。
可选的，本发明的一些实施方案中，所述抗体的恒定区可以是任意哺乳动物来源例如小鼠等的抗体恒定区。
Fab片段是抗体的抗原结合片段，并且其由重链和轻链中的每一个的一个可变区和一个恒定区组成。F(ab')2是通过胃蛋白酶水解抗体产生的片段，并且F(ab')2具有两个Fab片段在重链铰链区由二硫键连接的形式。F(ab')是将重链铰链加入到通过还原F(ab')2片段的二硫键分离得到的Fab上的单体抗体片段。Fv(可变片段)是仅由重链和轻链的各个可变区组成的抗体片段。scFv(单链可变片段)是重组抗体片段，其中重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过柔性肽接头连接彼此。
本发明的抗原结合片段不受其结构或形式的限制，只要其保留与成熟脑源性神经营养因子的结合特异性即可。
另一方面，本发明提供如上任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备以成熟脑源性神经营养因子为标志物的相关疾病的诊断试剂盒中的应用。
可选的，本发明的一些实施方案中，所述相关疾病为神经系统疾病或代谢系统疾病或生殖系统疾病。
可选的，本发明的一些实施方案中，所述神经系统疾病为阿尔茨海默病、抑郁症、精神分裂症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、亨廷顿病、创伤后应激障碍、脑卒中或脑外伤。
可选的，本发明的一些实施方案中，所述代谢系统疾病为肥胖症。
可选的，本发明的一些实施方案中，所述生殖系统疾病为卵巢早衰。
只要是以成熟脑源性神经营养因子为标志物进行诊断的疾病均属于本发明的相关疾病，本发明提供的抗体均可以应用于此类疾病的检测和诊断。
另一方面，本发明提供一种疾病的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒含有如上任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
可选的，本发明的一些实施方案中，所述疾病为神经系统疾病或代谢系统疾病或生殖系统疾病。
可选的，本发明的一些实施方案中，所述神经系统疾病为阿尔茨海默病、抑郁症、精神分裂症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、亨廷顿病、创伤后应激障碍、脑卒中或脑外伤。
可选的，本发明的一些实施方案中，所述代谢系统疾病为肥胖症。
可选，本发明的一些实施方案中，所述生殖系统疾病为卵巢早衰。
另一方面，本发明提供一种检测成熟脑源性神经营养因子的试剂盒，所述试剂盒含有如上任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
本发明上述的试剂盒例如可以是ELISA试剂盒，其用于使用与酶结合的抗体检测或定量分析目标物质，并且ELISA试剂盒通常以夹心EILSA的形式制备以减少非特异性反应并提高抗原敏感性和结合特异性。夹心ELISA使用两种类型的特异性结合目标物质的抗体以检测目标物质。将一抗(捕获抗体)附着于反应容器的表面，并将与用于显色反应的酶连接的二抗(检测抗体)包含在反应溶液中。首先，将样品加入到固定有一抗的反应容器中，并进行温育以使目标物质与一抗结合，然后再次与二抗温育，从而形成抗体(捕获)-目标物质-抗体(检测)的夹心型复合物。最后，将与二抗连接的酶的底物加入反应容器中以进行酶的显色反应，并测量显色水平以研究样品中含有的目标物质存在与否及浓度。随着样品中目标物质的浓度变高，形成更多的抗体(捕获)-目标物质-抗体(检测)的复合物，并且更多能够进行显色反应的二抗存在于反应容器中。因此，显色程度和目标物质的浓度具有正相关性。为了研究目标物质的浓度，使用不同浓度的目标物质进行ELISA反应以根据浓度产生显色的标准曲线，并通过将通过样品的ELISA反应测量的显色水平与标准曲线相匹配，推导出样品中标准物质的浓度。
可选的，本发明的一些实施方案中，上述试剂盒中的抗体或其抗原结合片段具有可被检测的检测标记。
检测标记(label)可选自酶、荧光材料、配体、发光材料、微粒、氧化还原分子和放射性同位素，但不限于此。当酶用作检测标记时，可用酶的实例包括但不限于，β-葡萄糖醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化物酶或碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶和鸟苷二磷酸酶(GDPase)、核糖核酸酶、葡萄糖氧化酶和荧光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶、磷酸烯醇丙酮酸脱羧酶、β-内酰胺酶等。荧光材料的实例可以包括但不限于，荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛、荧光胺等。配体的实例包括但不限于，生物素衍生物等。发光材料的实例包括但不限于，吖啶酯、萤光素、萤光素酶等。微粒的实例包括胶体金、有色乳胶等，但不限于此。氧化还原分子的实例可以包括但不限于，二茂铁、钌络合物、紫罗碱、醌、Ti离子、Cs离子、二酰亚胺、1,4-苯醌、对苯二酚、K4W(CN)8、[Os(bpy)3]2+、[RU(bpy)3]2+、[MO(CN)8]4-等。放射性同位素的实例可以包括但不限于，3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re等。
另一方面，本发明提供一种检测成熟脑源性神经营养因子的方法，其包括：
将如上所述的抗体或其抗原结合片段与样品接触；
检测所述的抗体或其抗原结合片段。
本领域技术人员可以适当地选择通过使用抗体检测蛋白质的已知方法，并可制备适合于上述检测方法的样品。此外，样品可以是细胞、组织、血液、全血、血清、血浆、唾液、脑脊液等。使用抗体的蛋白质检测方法包括但不限于，例如，蛋白质印迹(western blot)、免疫印迹(immune blot)、斑点杂交、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定法、竞争性结合测定和免疫沉淀法等。
另一方面，本发明提供一种分离的核酸分子，其编码如上任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
在本发明中所使用的术语“核酸分子”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的载体，优选核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。
另一方面，本发明提供一种重组载体，其含有编码如上任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核酸序列。
本发明中所使用的术语“重组载体”是指这样的一种遗传载体，包含特定的核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，重组载体的形式不受特别限制，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种，优选质粒和病毒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。病毒很容易转染到受体细胞中。本领域技术人员可以根据需要进行选择。对于用于构建重组细胞的重组载体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。
另一方面，本发明提供一种重组细胞，其含有如上所述的重组载体。
另一方面，本发明提供一种制备如上任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：培养如上所述的重组细胞，从培养产物中分离纯化得到所述抗体或其抗原结合片段。
可以通过本领域已知方法及其他本领域熟知方法生产上述抗体或其抗原结合片段，例如将本发明上述的重组载体(其可表达所述抗体或其抗原结合片段)导入细胞获得重组细胞，通过培养重组细胞以产生上述抗体或抗原结合片段，从培养产物中分离纯化得到该抗体或抗原结合片段。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为mBDNF的ELISA检测标准曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
抗mBDNF抗体的筛选
所用抗原mBDNF的氨基酸序列(SEQ ID NO.11)如下：
HSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR。
采用以上mBDNF蛋白作为免疫用抗原以及筛选用抗原。免疫动物选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，注射抗原，并采用特殊佐剂快速免疫两周左右。免疫动物以后，检测抗体效价，待抗体滴度足够高，使用异氟烷麻醉动物后处死，取淋巴节，消化后待与骨髓瘤融合。使用DMEM培养sp2/0骨髓瘤细胞，待细胞状态良好，活细胞率百分之八十以上，与淋巴细胞通过聚乙二醇融合。然后采用HAT筛选培养基培养，期间换液两次。在HAT培养基中，原始骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA，最终死亡，只有融合的杂交瘤细胞能在HAT培养基中存活和增殖。杂交瘤细胞在HAT培养基中增殖后，利用ELISA以及NFAT进行抗体亲和力与活性的初筛。将阳性孔细胞转移，通过有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。ProteinA/G beads亲和纯化抗体，进一步通过ELISA，NFAT，Biacore等assay全面分析鉴定抗体的亚类，特异性，亲和力识别抗原的表位等，通过5’RACE技术分析抗体序列，及时冻存较好的细胞株。
测序结果显示得到的抗mBDNF的抗体的氨基酸序列(SEQ ID NO.)如下表1所示：
表1
重链可变区如下(SEQ ID NO.7)，下划线依次为CDR1-CDR3(根据kabat规则)：
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFNNYWMNWVRQSPGKGLEWVAQIRLDSDNYATHYAESVIGRFTISSDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTAFDYAMDYWGQGTSVTVSS。
编码上述重链可变区的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.9)：
gaagtgaagcttgaggagtctggaggaggcttggtgcaacctggaggatccatgaaactctcctgtgttgcctctggattcactttcaataactactggatgaactgggtccgccagtctccagggaaggggcttgagtgggttgctcaaattagattggattctgataattatgcaacacattatgcggagtctgtgatagggaggttcaccatctcaagtgatgattccaaaagtagtgtctacctgcagatgaacaacttaagggctgaagacactggaatttattactgcacagcctttgattatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca。
轻链可变区如下(SEQ ID NO.8)，下划线依次为CDR1-CDR3(根据kabat规则)：
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGSAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPNRFTGSGSGTDFTLTISNVHSEDLADYFCQQYSSYPLTFGSRTKLEIK。
编码上述轻链可变区的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.10)：
gacattgtgatgacccagtctcacaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcatcacctgcaaggccagtcaggatgtgggttctgctgttgcctggtatcaacagaaaccagggcaatctcctaaattactgatttactgggcatccacccggcacactggagtccctaatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccattagcaatgtgcactctgaagacttggcagattatttctgtcagcaatatagcagctatcctctcacgttcggctcgaggacaaagttggagataaaa。
实施例2
抗mBDNF抗体的纯化
将以上测得抗体基因序列经过密码子优化，合成并接入到pcDNA3.4的载体中，Fc区域采用原本的抗体亚型IgG2b的序列。将构建好的表达载体转入大肠杆菌进行扩增表达并纯化出表达质粒，质粒通过电转转染293细胞，经过2天的培养，提取上清中的抗体蛋白，使用Protein A的亲和柱进行抗体纯化，并使用HPLC-SEC和SDS-Page进行鉴定，确定其浓度和纯度。经检测，抗体浓度为0.862mg/ml，纯度达到98％。
实施例3
抗mBDNF抗体的特异性检测
抗原样品：mBDNF(氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示)或ProBDNF采用ELISA法进行检测：
1)包被：用50μl浓度2μg/ml的mBDNF或者proBDNF蛋白4℃过夜包被96孔板，浓度见表2，然后用PBST(Tween 0.05％)洗板三次，拍干。
2)封闭：配置的封闭液，加入200μl封闭液(含1％BSA的PBST溶液)于96孔板中，室温封闭1小时，洗板四次，拍干。
3)加入50μl样品(上述实施例2的纯化抗体)，室温孵育1小时，洗板四次，拍干。
4)二抗孵育：二抗(1:2000)用封闭液配置，每孔加入100μl二抗，室温孵育1小时，洗板四次，拍干。
5)100μl TMB室温反应10分钟，50μl盐酸终止反应。
6)使用Cytation BioTek酶标仪测量450nm吸光值。
结果如下表2所示：
表2
上述结果显示，本发明实施例提供的抗mBDNF抗体可以特异性结合mBDNF，与ProBDNF不发生反应，说明本发明实施例提供的抗mBDNF抗体具有较高的特异性；且在抗原浓度低至1.95ng/ml的情况下，也能将抗原检测出，说明本发明实施例提供的抗mBDNF抗体灵敏度也较高。
实施例4
抗mBDNF抗体的ELISA标准曲线测定。
使用BDNF的通用抗体2.5μg/ml对96孔板进行4℃包被过夜；第二天使用PBST(Tween 0.05％)清洗三遍并拍干；加入含1％BSA的PBS溶液封闭板子，150μl/well，37℃2h；封闭结束，弃去封闭液，拍干；加入检测原(夹心蛋白)，蛋白设置4个浓度梯度分别为500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.91、1.95、0.98、0ng/mL，100μl/well，37℃1h；取出板子，弃去反应溶液，洗板4次，拍干；加入Biotin标记的如上实施例1提供的抗mBDNF抗体1μg/ml，100μl/well，37℃1h；取出板子，弃去反应溶液，洗板4次，拍干；加入SA-HRP，1/5000加入100μl/well，37度反应10min，取出板子，弃去反应溶液，洗板4次，拍干；加入显色液，100μl/well，25℃15min；加入1M HCl终止反应，读取OD450值。根据浓度和OD450绘制的标准曲线见图1，R2达到0.988。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳清华大学研究院
<120> 成熟脑源性神经营养因子的抗体及其应用和诊断试剂盒
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Asn Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Gln Ile Arg Leu Asp Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Ile Gly
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Phe Asp Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ser Ala Val Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Ile Arg Leu Asp Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Ile Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Ala Phe Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asn Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val His Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Arg Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc 60
tcctgtgttg cctctggatt cactttcaat aactactgga tgaactgggt ccgccagtct 120
ccagggaagg ggcttgagtg ggttgctcaa attagattgg attctgataa ttatgcaaca 180
cattatgcgg agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gtgatgattc caaaagtagt 240
gtctacctgc agatgaacaa cttaagggct gaagacactg gaatttatta ctgcacagcc 300
tttgattatg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354
<210> 10
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgggt tctgctgttg cctggtatca acagaaacca 120
gggcaatctc ctaaattact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctaat 180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tgtgcactct 240
gaagacttgg cagattattt ctgtcagcaa tatagcagct atcctctcac gttcggctcg 300
aggacaaagt tggagataaa a 321
<210> 11
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile
1 5 10 15
Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser
20 25 30
Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln
35 40 45
Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr
50 55 60
Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys
65 70 75 80
Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys
85 90 95
Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr
100 105 110
Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg
115