具体实施方式

为了使本发明目的实现、功能特点及优点更加清楚明白，以下将结合实施例，对本发明做进一步详细说明。这些实施例只是为了解释本发明，并不是对本发明的限制。

本发明提供一种磷酸化扁藻胞外多糖的制备方法。在一实施例中，该方法包括以下步骤：

步骤S10，将三聚磷酸钠和三偏磷酸钠与水按照预置比例溶解制得磷酸化试剂；

步骤S20，在所述磷酸化试剂中加入扁藻胞外多糖PEPs，制得扁藻胞外多糖溶液；

步骤S30，在所述扁藻胞外多糖溶液中加入催化剂，加热进行磷酸化反应制得混合溶液，并调节混合溶液的PH值直至其达到目标PH值，制得半成品溶液；

步骤S40，将半成品溶液依次进行透析、冻干，从而制得磷酸化扁藻胞外多糖pPEPs。

本发明实施例中，三聚磷酸钠和三偏磷酸钠可以按质量配比，比例可选择为4∶3、5∶2或6∶1等。本发明实施例中，催化剂可以选择为硫酸钠，混合溶液的目标PH值8至10。

本发明实施例中，磷酸化反应的反应时间为4小时至8小时，反应温度为80℃至100℃。

在一较佳实施例中，在将半成品溶液进行透析干燥之前还包括：

在半成品溶液中加入2-3倍体积的95％乙醇溶液；

将半成品溶液与乙醇溶液离心混合后置于45±3℃的环境下2～3小时，以去除残留的乙醇，得到醇沉多糖。

在一较佳实施例中，前述将半成品溶液进行透析的步骤包括：

将所述醇沉多糖冷冻干燥，再加入超纯水，在50℃下水浴复溶，置于截留分子量为800-1200的透析袋，透析24h以上，透析1次以上，收集截留液，制得磷酸化扁藻胞外多糖溶液。

在一实施例中，将半成品溶液进行冻干的步骤包括：将所述磷酸化扁藻胞外多糖溶液真空冷冻干燥，制得磷酸化扁藻胞外多糖。

在一较佳实施例中，磷酸化试剂为三聚磷酸钠和三偏磷酸钠按质量比6∶1与水混合而成，所述混合溶液PH为8，所述反应温度为100℃，反应时间为6小时。

实施例1：磷酸化扁藻胞外多糖的制备。

用100ml超纯水溶解7g磷酸化试剂(6g三聚磷酸钠+1g三偏磷酸钠)和5g的无水硫酸钠，溶解后加入1g精制的扁藻胞外多糖PEPs，用NaHCO3调节溶液的pH为9，在80℃条件下反应6h，再往所得半成品溶液中加入3倍体积的95％乙醇溶液，静置沉淀24h，离心，收集沉淀，置于45℃的环境下2h，去除残留的乙醇，冷冻干燥，再在50℃下水浴复溶，置于截留分子量为800-1200的透析袋，透析24h以上，透析1次以上，收集截留液，冷冻干燥，即制得磷酸化扁藻胞外多糖pPEPs。

实施例2：磷酸化扁藻胞外多糖修饰程度的检测

磷酸根标准曲线测定(钼蓝比色法)：

Tris缓冲溶液的配制：称取3.6g三羟甲基氨基甲烷和120mgMgCl₂·6H₂O溶解于超纯水中，再加入超纯水稀释至300ml，再用1mol/L的HCl调节pH为7，得到Tris缓冲溶液。

定磷试剂的配置：分别取质量分数为20％的VC水溶液、3mol/L的H₂SO₄溶液和质量分数为3％的钼酸铵水溶液等体积混合均匀，得到定磷试剂。

磷酸盐标准溶液的配制：精密称取1g磷酸二氢钾溶于溶解于超纯水中，使用100mL容量瓶定容至刻度，再稀释100倍，得到0.1mg/mL的磷酸根标准溶液。

标准曲线的绘制：精确吸取磷酸根标准溶0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5mL，分别移入20mL试管中，各管加超纯水补充至5mL，加入Tris缓冲溶液3mL，摇匀后加入3mL定磷试剂，在45℃恒温水浴锅中水浴加热30min，取出后在580nm处测定吸光度，以磷酸根浓度为横坐标(x)，相应吸光度为纵坐标(y)，绘制标准曲线。

所得标准曲线y＝0.0963x+0.0214，相关系数0.9876，参见图2，显示相关性良好。

磷酸根测定：

采用钼蓝比色法，取0.1g样品于烧杯中，加入1mL浓硫酸和1mL浓硝酸，加热至冒烟，冷却后加入1mL30％的H₂O₂溶液，再缓慢加热，重复以上步骤直至烧杯内不再冒烟，溶液呈无色透明或淡黄色。冷却后加入1mL 6mol/L的盐酸，加热使酸彻底分解，转移至50mL容量瓶中定容。取5mL上述溶液，按照标准曲线操作方法测定吸光度，根据以下公式计算磷酸根含量。

磷酸根质量分数w(PO₄ ^3-)计算公式：

式中：m为样品在580nm处测得的吸光度对应的磷酸根质量，单位为mg；m₀为样品的质量，单位为g。

红外光谱测定：取干燥的扁藻胞外多糖及磷酸化扁藻胞多糖分别与干燥的溴化钾颗粒研磨均匀，取少许混合物进行压片，设置红外波长测量范围4000-500cm^-1，将压片后的样品进行红外光谱分析。

扁藻胞外多糖及其磷酸化衍生物的红外扫描结果分别见图3、图4。

参见图3，对扁藻胞外多糖进行红外吸光度检测，结果可见3414.00cm^-1处存在吸收峰，为-OH特征吸收峰；1620.21cm^-1处存在吸收峰，为C＝O特征吸收峰，并且存在氢键；在1134.14cm^-1处存在吸收峰，为C-O特征吸收峰；在999.13cm^-1处的相关吸收峰为吡喃环上C-O-C的特征吸收峰，因此可推断该多糖为吡喃型多糖。

参见图4，对第9组磷酸化扁藻胞外多糖中的化学键进行检测。可见3456.44cm^-1处存在吸收峰，为-OH特征吸收峰，较未磷酸化多糖吸收峰强度弱，推测由于磷酸化后同质量的多糖，-OH的含量减少所致；1654.92cm^-1处存在吸收峰，为C＝O特征吸收峰，较未磷酸化多糖吸收峰强度弱，推测磷酸化多糖的-OH浓度改变所致；在1099.43cm^-1处存在吸收峰，为C-O特征吸收峰。与未磷酸化扁藻胞外多糖相比，磷酸化扁藻胞外多糖仍含有扁藻多糖的特征性吸收峰，说明多糖的主体结构未发生明显变化。除此之外，磷酸化后在1265.30cm^-1处出现特征性吸收峰是P＝O伸缩振动吸收峰，891.11cm^-1处的吸收峰应该是P-O-C键的吸收峰，因此可推断该扁藻胞外多糖成功磷酸化修饰，并且仍然保留有吡喃型多糖结构。三聚磷酸钠和三偏磷酸钠在480-550cm^-1范围内有其特征性吸收峰[PO₃]，由图1和图2的对比，磷酸化后的扁藻胞外多糖红外光谱中，在505cm^-1有明显的吸收峰，而在未磷酸化的多糖红外光谱中未出现过，说明经磷酸化后，多糖分子结合上了磷酸基团。

实施例3：磷酸化扁藻胞外多糖的正交试验。

按照上述制备方法，采用正交试验设计方法，选取磷酸化实验中磷酸化试剂比例(A)、温度(B)、时间(C)和pH(D)为考察因素，每个因素选取三个水平(见表1)，选用L₉(3⁴)正交表进行正交实验。正交实验设计及结果见表2：

表1正交实验因素与水平

表2正交实验及结果

本正交试验我们以产率和磷酸根含量这两个值作为评价指标，对磷酸化试剂比例、反应温度、反应时间和pH值这四个条件进行筛选。以产率为指标的极差分析结果显示，影响因素B＞A＞D＞C，即反应温度对产率影响最大，其次是磷酸化试剂比例，再其次是pH值，最后是反应时间。以磷酸根含量为指标的极差分析结果显示，影响因素B＞D＞A＞C，即反应温度对磷酸根含量影响最大，其次是pH值，再其次是磷酸化试剂比例，最后是反应时间。综合两个指标的影响，我们确定当磷酸化试剂比例为6∶1，反应温度为100℃，反应时间为6h，反应pH值为8时，为最佳的反应条件。

实施例4：MTT法检测细胞增殖活性

用胰酶消化处于对数生长期、状态良好的鼠巨噬细胞Raw264.7，然后重悬。接种于96孔培养板内使每孔细胞密度为1×10⁴个，置于5％CO₂、37℃培养箱中培养16h使其贴壁，正常细胞对照组加等量细胞和培养液正常培养，空白对照组加等量培养基但不加细胞，给药组给予扁藻胞外多糖和磷酸化扁藻胞外多糖(质量浓度分别为50、100、150、200、250μg/ml)，每个浓度设置5个复孔，药物与细胞作用24h，每孔加入20μL的MTT溶液(5mg/ml)，并继续放到培养箱中培养4h；培养结束后弃去上清，每个复孔加入150μL的DMSO溶液，用锡纸包裹避光，于摇床上震荡10min使结晶彻底溶解。采用酶标仪检测570nm处各孔吸光度值(Optical density，OD)。并利用公式计算细胞存活率：Cell viability/％＝(OD_样品-OD_空白)/(OD_对照-OD_空白)×100。实验结果采用Graphpad Prism8软件进行数据处理及统计分析。

使用不同浓度梯度的PEPs和pPEPs分别作用于细胞，其对Raw264.7细胞的增殖能力的影响如图5所示。与空白对照组相比，PEPs组在100μg/mL时对Raw264.7细胞的增殖具有显著的抑制作用(p＜0.05)。pPEPs组在50μg/mL时即对Raw264.7细胞的增殖具有显著的抑制作用(p＜0.05)；且与PEPs组相比，在药物浓度为150μg/mL时两组对于Raw264.7增殖的抑制作用有极显著差异(p＜0.01)，在200、250μg/mL时具有显著性差异(p＜0.05)。

本发明从扁藻胞外多糖提取、纯化到磷酸化多糖的制备，操作快捷高效，产品纯度高，磷酸化剂使用量较少，磷酸化反应时间较短，磷酸化多糖稳定性高，生物学效价高。

本发明还提出一种磷酸化扁藻胞外多糖，其由上述磷酸化扁藻胞外多糖的制备方法制备得到，该磷酸化扁藻胞外多糖稳定性高，具有调节免疫细胞活性及抑制肿瘤细胞生长的作用，具有较高的药用价值。

应当说明的是，本发明的各个实施例的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域的技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当人认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。