一种肺炎球菌多糖的纯化工艺
阅读说明：本技术 一种肺炎球菌多糖的纯化工艺 (Purification process of pneumococcal polysaccharide ) 是由 马可 朱卫华 胡国伟 李爽 林彦斌 王瑞峰 杜琳 于 2021-01-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种离子交换层析纯化肺炎球菌多糖的工艺。步骤包括：肺炎球菌经发酵培养、灭活、澄清、超滤浓缩等步骤得到肺炎球菌多糖粗提溶液,通过离子交换层析工艺,去除不同血清型的肺炎球菌荚膜多糖纯化过程的杂质,得到符合要求的肺炎球菌多糖。(The invention discloses a process for purifying pneumococcal polysaccharide by ion exchange chromatography. The method comprises the following steps: the pneumococcus is subjected to fermentation culture, inactivation, clarification, ultrafiltration concentration and other steps to obtain a pneumococcus polysaccharide crude extract solution, and impurities in the purification process of pneumococcus capsular polysaccharide of different serotypes are removed through an ion exchange chromatography process to obtain the desired pneumococcus polysaccharide.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种肺炎球菌多糖的纯化工艺。
背景技术
层析技术是生物大分子分离纯化最有效的手段之一,具有多种不同的分离机理如离子交换、疏水、反相、金属鳌合、亲和、凝胶过滤等,可以实现很高的分离度,且设备简单,便于自动化控制,不会在分离过程中出现发热、相变等效应,因此在实际的生物大分子分离纯化中的应用越来越广泛。离子交换层析是以离子交换剂为固定相,以特定的含离子的溶液为流动相,利用离子交换剂对需要分离的生物大分子结合的差异,而将混合物中各种物质进行分离的层析技术。
肺炎球菌荚膜多糖是制备肺炎球菌相关疫苗的有效抗原。肺炎球菌荚膜多糖经细菌发酵培养后，现有的肺炎球菌多糖的纯化工艺是苯酚抽提和乙醇分级沉淀纯化得到。然而苯酚对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经或损害肝、肾功能，对环境水体和大气都可造成污染。乙醇是易燃易爆危险化学品，对生产厂房设计要求极高，对生产成本影响很大。并且有毒、有害和污染严重的有机化剂的使用对工作人员和环境造成危害，所以研制创新性的、安全和有效的纯化工艺是迫切需要的。
本发明的纯化工艺，是指肺炎球菌经发酵培养、灭活、澄清、超滤浓缩等步骤得到粗纯肺炎球菌多糖，然后经离子交换层析去除蛋白和核酸等杂质，最终得到肺炎球菌荚膜多糖。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肺炎球菌多糖的纯化工艺。
本发明主要是针对层析过程，层析使用的介质为阴离子交换介质，不同血清型的肺炎球菌荚膜多糖的性质，使用不同稀释液，达到去除杂质的目的；针对不同血清型的肺炎球菌荚膜多糖的性质，使用不同上样量，提高了层析的效率；并优化了层析介质的清洗程序，延长了层析介质使用寿命。
现有方法制备得到的肺炎球菌多糖，纯度比较低，为粗纯多糖。本发明对粗纯多糖作进一步层析纯化，得到纯度更高的肺炎球菌荚膜多糖。
具体的，本发明所述的肺炎球菌多糖的纯化工艺，包括以下步骤：
(1)配制层析平衡液为0.01mol/L至0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液，pH值范围为6.0至7.6。
(2)将肺炎球菌粗纯多糖溶液超滤浓缩，超滤膜包截留分子量为10到100Kd，使用层析平衡液透析，透析后收集超滤浓缩液。
(3)用层析平衡液平衡层析柱。
(4)上样，使用平衡缓冲液洗脱，监测206nm的紫外吸收峰，收集流穿峰。
其中，层析使用的离子交换介质为离子交换介质DEAE Sepharose FF。
其中，肺炎球菌粗纯多糖，可以在市场上购买到，也可以根据常规方法制备得到。
此处，列举一种肺炎球菌粗纯多糖的制备方法，当然还可以根据其他方法制备得到。
其中，肺炎球菌粗纯多糖的制备步骤为：
24个血清型中的任一个肺炎链球菌血清型进行发酵，肺炎球菌灭活，发酵液澄清，发酵液进行超滤浓缩，加CTAB使其与多糖形成沉淀，离心收集沉淀，再经过氯化钠解聚，离心收集上清，超滤浓缩和缓冲液置换，层析纯化多糖，注射用水超滤除盐，冻干，最终得到肺炎球菌粗纯多糖。
本发明所述的纯化工艺，适用于肺炎链球菌血清型为1型、2型、3型、4型、5型、6A型、6B型、7F型、8型、9N型、9V型、12F型、10A型、11A型、12F型、14型、15B型、17F型、18C型、19A型、19F型、20型、22F型、23F型和33F型。
肺炎链球菌血清分为24个血清型，根据不同型的血清，本发明采用不同的纯化工艺。
本发明将24个血清型进行筛选，根据其缓冲液浓度和上样体积分为6组，对应6种不同的纯化方法，具体筛选方法在实施例中详细说明。
第1组，针对肺炎链球菌血清型2型、9N型、9V型、10A型、12F型、14型、15B型、17F型、18C型、20型、22F型和23F型的粗纯多糖，其纯化工艺，包括以下步骤：
(1)配制层析平衡液：为0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液，检测平衡液电导值，范围在20±2mS/cm；检测平衡液pH值，范围为7.50±0.10；
(2)将粗纯多糖溶液超滤浓缩，超滤膜包截留分子量为100Kd，使用层析平衡液透析至电导一致，透析结束后收集超滤浓缩液；
(3)用层析平衡液平衡层析柱，至电导率稳定；
(4)层析上样量不超过0.25柱体积(以下简写为CV)，使用平衡缓冲液洗脱流穿峰，监测206nm的紫外吸收峰，收集流穿峰，即肺炎多糖层析组分。
第2组，针对肺炎链球菌血清型4型、8型、19A型和19F型的粗纯多糖，其纯化工艺，包括以下步骤：
(1)层析平衡液为0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液，检测透析液电导值，范围在40±4mS/cm；检测透析液pH值，范围为7.50±0.10；
(2)将粗纯多糖溶液超滤浓缩，超滤膜包截留分子量为100Kd，使用层析平衡液透析至电导一致，透析结束后收集超滤浓缩液；
(3)用层析平衡液平衡层析柱，至电导率稳定；
(4)层析平衡液的上样量不超过0.25CV，使用层析平衡液洗脱流穿峰，监测206nm的紫外吸收峰，收集流穿峰，即肺炎多糖层析组分。
第3组，针对肺炎链球菌血清型6A型和6B型的粗纯多糖，其纯化工艺，包括以下步骤：
(1)配制层析平衡液为0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液，检测平衡液电导值，范围在20±2mS/cm，检测平衡液pH值，范围为7.50±0.10；配制层析洗脱液为0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液，检测洗脱液电导值，范围在40±4mS/cm，检测洗脱液pH值，范围为7.50±0.10；
(2)将粗纯多糖溶液超滤浓缩，超滤膜包截留分子量为100Kd，使用层析平衡液透析至电导一致，透析结束后收集超滤浓缩液；
(3)用层析平衡液平衡层析柱，至电导率稳定。
(4)上样量不超过0.25CV，保持流速，使用层析平衡液洗脱1CV，再使用层析洗脱液洗脱2CV，监测206nm的紫外吸收峰，收集洗脱峰，即肺炎多糖层析组分。
第4组，针对肺炎链球菌血清型1型、5型、7F型和33F型的粗纯多糖，其纯化工艺，包括以下步骤：
(1)配制层析平衡液：为0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液，检测平衡液电导值，范围在20±2mS/cm；检测平衡液pH值，范围为7.50±0.10；
(2)将粗纯多糖溶液超滤浓缩，超滤膜包截留分子量为100Kd，使用层析平衡液透析至电导一致，透析结束后收集超滤浓缩液；
(3)用层析平衡液平衡层析柱，至电导率稳定；
(4)层析上样量不超过0.5CV，使用平衡缓冲液洗脱流穿峰，监测206nm的紫外吸收峰，收集流穿峰，即肺炎多糖层析组分。
第5组，针对肺炎链球菌血清型3型粗纯多糖，其纯化工艺，包括以下步骤：
(1)层析平衡液为0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液，检测透析液电导值，范围在40±4mS/cm；检测透析液pH值，范围为7.50±0.10；
(2)将粗纯多糖溶液超滤浓缩，超滤膜包截留分子量为100Kd，使用层析平衡液透析至电导一致，透析结束后收集超滤浓缩液；
(3)用层析平衡液平衡层析柱，至电导率稳定；
(4)层析平衡液的上样量不超过4CV，使用层析平衡液洗脱流穿峰，监测206nm的紫外吸收峰，收集流穿峰，即肺炎多糖层析组分。
第6组，针对肺炎链球菌血清型11A型粗纯多糖，其纯化工艺，包括以下步骤：
(1)层析平衡液为0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液，检测透析液电导值，范围在40±4mS/cm；检测透析液pH值，范围为7.50±0.10；
(2)将粗纯多糖溶液超滤浓缩，超滤膜包截留分子量为100Kd，使用层析平衡液透析至电导一致，透析结束后收集超滤浓缩液；
(3)用层析平衡液平衡层析柱，至电导率稳定；
(4)层析平衡液的上样量不超过0.5CV，使用层析平衡液洗脱流穿峰，监测206nm的紫外吸收峰，收集流穿峰，即肺炎多糖层析组分。
对制备的多糖进行检测，蛋白质含量和核酸含量检测方法参见《中国药典》。
本发明相对于现有的纯化工艺，本发明的纯化工艺，更加安全有效，针对不同血清型，使用不同上样量，优化了层析的效率。
附图说明
图1为实施例1中7F型肺炎球菌多糖层析图谱。
图2为实施例2中6A型肺炎球菌多糖层析图谱。
图3为实施例3中8型肺炎球菌多糖层析图谱。
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为本发明的限制。
以下实施例中涉及的主要仪器及设备：
FE30型电导仪购自METTLER TOLEDO公司；超滤膜包购自MILLIPORE公司；层析系统为AKTA PURE购自GE公司。
实施例1：肺炎链球菌血清型7F型粗纯多糖的纯化方法
以肺炎链球菌血清型7F型粗纯多糖500ml进行纯化，包括如下步骤：
(1)配制0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液为平衡液，检测其电导值为20.46mS/cm，pH值为7.53。
(2)取肺炎链球菌血清型7F型层析前样品500ml超滤浓缩至100ml，维持该体积，使用层析平衡液透析，透析结束后收集超滤浓缩液100ml。
(3)用平衡液平衡层析柱，监测电导率稳定在20.52mS/cm。
(4)层析上样5ml，流速5ml/min，保持流速，使用0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液洗脱流穿峰，监测206nm的紫外吸收峰，收集流穿峰。
(5)收集样品经注射用水超滤除盐后冻干检测，检测结果见表1。
表1 7F型肺炎球菌多糖回收率和理化指标情况：
实施例2：肺炎链球菌血清型6A型粗纯多糖的纯化方法
以肺炎链球菌血清型6A型粗纯多糖500ml进行纯化，包括如下步骤：
(1)配制0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液为平衡液，检测其电导值20.46mS/cm，pH值为7.53。
(2)配制0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液为洗脱液，检测其电导值40.33mS/cm，pH值为7.50。
(3)超滤膜包截留分子量为100Kd，将肺炎链球菌血清型6A型粗糖500ml料液浓缩至100ml，维持该体积使用平衡液透析，透析结束后收集超滤浓缩液100ml。
(4)用平衡液平衡层析柱，监测电导率稳定在20.39mS/cm。
(5)层析上样浓缩液5ml，流速5ml/min，保持流速，先用0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液洗脱25ml，再使用0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液洗脱，监测206nm的紫外吸收峰，收集洗脱峰。
(6)收集样品经注射用水超滤除盐后冻干检测，检测结果见表2。表2 6A型肺炎球菌多糖回收率和理化指标情况：
实施例3：肺炎链球菌血清型8型粗纯多糖的纯化方法
以肺炎链球菌血清型8型粗纯多糖500ml进行纯化，包括如下步骤：
(1)配制0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液为平衡液，检测电导值为40.46mS/cm，pH值为7.50。
(2)将肺炎链球菌血清型7F型粗糖500ml，超滤浓缩至100ml，维持该体积，使用层析平衡液透析，透析结束后收集超滤浓缩液100ml。
(3)用0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液平衡层析柱，监测电导率稳定在40.52mS/cm。
(4)层析上样5ml，流速5ml/min，保持流速，使用0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液洗脱，监测206nm的紫外吸收峰，收集流穿峰。
(5)收集样品经注射用水超滤除盐后冻干检测，检测结果见表3。
表3 8型肺炎球菌多糖回收率和理化指标情况：
试验例1、平衡缓冲液和洗脱缓冲液的筛选
本发明对24个血清型的多糖，分别用不同浓度的缓冲液作为平衡缓冲液和洗脱缓冲液，进行纯化，筛选不同血清型的多糖层析缓冲液浓度：肺炎链球菌血清型1型、2型、5型、7F型、9N型、9V型、10A型、12F型、14型、15B型、17F型、18C型、20型、22F型,23F型和33F型平衡和上样用0.1mol/L磷酸盐缓冲液，用0.1mol/L磷酸盐缓冲液洗脱；3型、4型、11A型、19A型和19F型平衡和上样用0.2mol/L磷酸盐缓冲液，用0.2mol/L磷酸盐缓冲液洗脱；6A型和6B型平衡和上样用0.1mol/L磷酸盐缓冲液，用0.2mol/L磷酸盐缓冲液洗脱。
具体筛选过程，以肺炎链球菌血清型33F型为例，33F型粗纯多糖500ml进行纯化，包括如下步骤：
(1)分别配制10mmol/L、50mmol/L、75mmol/L、0.1mol/L和0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液作为层析平衡液，检测电导分别为2.09mS/cm、10.93mS/cm、15.02mS/cm、20.46mS/cm、和40.33mS/cm。
(2)将肺炎链球菌血清型33F型粗糖500ml料液超滤浓缩至100ml，维持该体积，使用10mmol/L磷酸盐缓冲溶液透析，透析结束后收集超滤浓缩液100ml。
(3)将超滤浓缩液分别调整与不同的层析平衡液电导一致。
(4)分别上样层析，各样品使用对应的层析平衡液洗脱。
(5)监测206nm的紫外吸收峰，除10mmol/L磷酸盐缓冲溶液没有流穿峰出现，其他4种样品均收集流穿峰。
(6)每种不同层析样品的流穿峰收集后，分别经注射用水超滤除盐后冻干检测，检测结果见表4。
结果表明，0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液作为层析平衡液层析回收率最高，蛋白含量和核酸含量最低。对于33F型，优选的，使用0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液作为层析平衡液和洗脱液。其他血清型均使用类似方法对洗脱缓冲溶液进行优化筛选。
表4、33F型肺炎球菌多糖回收率和理化指标情况
试验例2、上样量筛选
本发明对24个血清型的多糖上样量进行筛选，以达到最佳层析效率：肺炎链球菌血清型2型、4型、6A型、6B型、8型、9N型、9V型、12F型、10A型、12F型、14型、15B型、17F型、18C型、19A型、19F型、20型、22F型和23F型层析上样体积不大于0.25CV；1型、5型、7F型、11A型和33F型上样体积不大于0.5CV；3型上样体积不大于4CV。
具体筛选过程，以肺炎链球菌血清型11A型为例，粗纯多糖500ml进行纯化，包括如下步骤：
(1)配制0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液，检测其电导值为40.46mS/cm，pH值为7.50。
(2)取肺炎链球菌血清型11A型粗糖的500ml，经超滤浓缩至100ml，维持该体积，使用层析平衡液透析，透析结束后收集超滤浓缩液100ml。
(3)用0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液平衡层析柱，监测电导率稳定。
(4)按不同上样量所占柱体积(CV)的比例，分别记为0.25CV、0.5CV、0.75CV、1CV。
(5)保持相同流速，使用0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液洗脱，监测206nm的紫外吸收峰，收集流穿峰。
(6)流穿峰经注射用水超滤除盐后冻干检测，检测结果见表5。
结果表明，上样量1CV时蛋白含量不合格，上样量0.75CV时蛋白含量虽然合格，但相比上样量0.25CV和上样量0.5CV蛋白含量有较大升高，优选的，确定11A型最大上样量不大于0.5CV。其他血清型均使用类似方法对上样体积进行优化筛选。
表5 11A型肺炎球菌多糖回收率和理化指标情况
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