螺环哌啶酮类衍生物
阅读说明：本技术 螺环哌啶酮类衍生物 (Spirocyclic piperidone derivatives ) 是由 盛春泉 陈龙 董国强 武善超 陈树强 黄亚辉 何世鹏 于 2021-04-21 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医药技术领域,具体涉及螺环哌啶酮类衍生物：药理实验表明,本发明所述的衍生物或盐,对KRAS-PDEδ蛋白蛋白相互作用具有很强的抑制活性,而且具有较强的体外抗肿瘤活性。本发明还提供了上述衍生物及其药学上可接受的盐的制备方法,以及在制备KRAS-PDEδ抑制剂和抗肿瘤药物中的应用。(The invention relates to the technical field of medicines, in particular to a spirocyclic piperidone derivative:)
技术领域
本发明涉及医药
技术领域
，具体涉及一类具有抗肿瘤活性的 KRAS-PDEδ蛋白蛋白相互作用(PPIs)抑制剂及其药学上可接受的 盐类，以及制备方法，以及化合物抗肿瘤活性，可用于治疗KRAS依 赖型的相关癌症。背景技术
胰腺癌恶性程度极高，早期病程难以发现，是全球致死率最高 的实体瘤之一。KRAS基因的突变对胰腺癌的发生发展有重要的影 响。然而靶向KRAS蛋白的药物研发进展缓慢，先后有多种靶向 KRAS的药物在临床试验阶段失败。近期，KRASG12C共价结合抑制 剂显示了优秀的治疗效果，但是KRAS基因在胰腺癌细胞系中主要 的突变形式为KRASG12D，因此并没有给胰腺癌的治疗带来变革。
KRAS-PDEδ蛋白-蛋白相互作用是靶向KRAS蛋白的新靶点， 对KRAS依赖的肿瘤株有效，有望为胰腺癌提供新的治疗策略。小分 子抑制剂通过阻断两者的相互作用，抑制PDEδ蛋白对KRAS蛋白的 转运，干扰KRAS在细胞膜上的正确定位，从而实现对KRAS信号 通路的阻断。然而，现有的KRAS-PDEδ小分子抑制剂存在代谢和选 择性等问题，因此需要进一步筛选发现全新结构类型的小分子抑制 剂，丰富抑制剂的结构类型，从而发现体内活性好，成药性佳的全新 小分子抑制剂。
发明内容
1.要解决的技术问题
本发明的目的是为了解决现有技术中的问题，而提出的螺环哌啶 酮类衍生物。
2.技术方案
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
螺环哌啶酮类衍生物，
优选地，其中X是苯环、脂肪环或氢原子。
优选地，其中R1表示：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、 异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基或正己基；三氟甲基、三 氟甲氧基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基或丁氧基；氢、腈基、 低级卤代烷基、低级烷基、低级羟基烷基、低级烷氧基、低级烷基氨 基、低级卤代烷基氨基、低级环烷基氨基、低级链炔基氨基、酰胺基、 低级环烷基酰胺基、低级酰胺基烷基、苯基或取代苯基、苄基或取代 苄基。
优选地，R2表示：各类饱和烷基，包括但不限于甲基、乙基、丙 基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基或 正己基、环丙基及取代环丙基、环丁基及取代环丁基、环戊基及取代 环戊基、环己基及取代环己基；优选为环丙甲基；氢、低级烷基、低 级卤代烷基、低级羟基烷基、苯环或取代苯环、苄基或取代苄基。
优选地，所述的“低级”是指含1至6个碳原子的直链或支链饱和 脂肪烃基团；所述的环烷基是指含3至7个碳的环。
优选地，上述通式的化合物药学上可接受的盐类是有机酸盐或无 机酸盐。所述的无机酸包括(但不限于)盐酸、硫酸、磷酸、二磷酸、 氢溴酸或硝酸等；所述的有机酸包括(但不限于)乙酸、马来酸、富 马酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、对甲苯磺酸、水杨酸或草酸等。
本发明还提供了上述化合物的制备方法，该方法如下；
Scheme 1
Reagent and conditions:(a)AcOH,rt,2.5h；(b)98％H2SO4,rt.,18h； (c)DMF-DMA,MeOH,55℃,16h；(d)NaBH4,MeOH,rt.,2h；(e)H2, 20％Pd(OH))2,MeOH,rt.,overnight；(f)4-Chlorobutyryl chloride,TEA, DCM,rt.,2h；(g)18,TEA,KI,Acetonitrile,90℃,24h.
Scheme 2
Reagents and conditions:(h)MgSO4,NaBH4,MeOH,rt.,overnight；(i)γ-butyro- lactone,trimethylaluminum,toluene,80℃,12h；(j)DMP,DCM,rt.,2h；(k)18,MgSO4,NaBH4,MeOH,rt.,overnight.
具体步骤
化合物23系列的制备
A.化合物14的制备
苯胺、1-苄基哌啶-4-酮、三甲基硅乙腈置于冰醋酸中常温反应4 小时，得目标中间体。
B.化合物15的制备
中间体14在浓硫酸中常温反应18小时，经氨水淬灭后得目标产 物。
C.化合物16系列的制备
以甲醇做溶剂，将化合物15、DMA在55℃下反应16小时得目 标产物。
D.化合物17-18系列的制备
以甲醇做溶剂，用NaBH4常温下还原化合物16反应2小时得中间 体17，在20％Pd(OH)2和氢气催化下脱去苄基得目标产物。
化合物23系列的制备
A.化合物22a-22e制备
不同的伯胺和4-氯丁酰氯反应，以三乙胺为缚酸剂，二氯甲烷为 溶剂，常温下反应得化合物22a-22e。
B.化合物23a-23e制备
以乙腈为溶剂，将中间体22a、18和碘化钾在90℃油浴中回流反 应。2小时后再次加入22a，并继续反应24小时得目标产物。
化合物G系列的制备
以取代的醛31和苯胺通过还原氨化反应制得仲胺中间体33，随后 33与丁内酯反应得到伯醇中间体34，经戴斯马丁试剂氧化得到化 合物35，最后，中间体35和18经还原氨化反应制得36系列化合 物。
本发明的化合物可进一步制备药学上可接受的盐。
本发明的化合物可通过手性柱拆分的方法制备d-型或l-型异构体。
本发明的第三方面，是提供了上述一类螺环哌啶酮衍生物，包括 消旋体、d-型或l-型异构体、及其在药学上可接受的盐在KRAS-PDEδ 蛋白蛋白相互作用抑制剂方面的应用。将目标产物进行PDEδ蛋白亲 和力的测试。测试方法采用荧光偏振法。具体实验方法和实验结果 参照实施例X。
本发明还提供了上述的一类螺环哌啶酮衍生物，包括其消旋体、 d-型或l-型异构体，及其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应 用。
所述的肿瘤为KRAS依赖型肿瘤珠，如胰腺癌等。
(1)对本发明的化合物进行了肿瘤细胞增殖抑制试验，试验方 法采用常规的CCK8法,细胞株选用MiaPaCa-2(人胰腺导管癌细胞)。 培养液为DMEM+10％FBS+2.5％HS+双抗。以上实验结果表明，本发 明的化合物具有良好的抗肿瘤活性，部分化合物的抗肿瘤活性优于阳 性药，同时表现出KRAS依赖型肿瘤珠的选择性。因此本发明化合物 及其盐类可以用于制备抗肿瘤药物。
附图说明
图1为化合物36l在小鼠胰腺癌PDX模型中的体内药效结果。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不 仅限于此。本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
以下实施例所涉化合物对应通式Ⅰ的化学结构式、1H-NMR和MS 数据详见表1。
表1：本发明部分优选化合物的1H-NMR和MS数据
实施例1：1-苄基-4-(苯氨基)哌啶-4-腈(14)
称取化合物11(3.0g,15.8mmol)和12(1.48g,15.8mmol)溶 于20mL冰醋酸，而后转移至冰浴，冷却后缓慢滴加化合物13(4.7 g,47.4mmol)。加入完毕转移至常温反应。4小时后反应结束，加入 2N NaOH溶液淬灭反应，并调节pH至10。而后DCM萃取(30 mL×3)，合并有机相并用饱和食盐水洗涤后旋干并用乙醚打浆得产 物。白色固体，2.8g，收率60.9％。
实施例2：1-苄基-4-(苯氨基)哌啶-4-羧酰胺(15)
称取化合物14(2.8g,9.6mmol)溶于14mL浓硫酸，而后常温反应。18小 时后反应结束，将反应液逐滴加入冰浴的25％氨水溶液80mL，加入完毕调节pH 至10以上。过滤，保留固体并烘干，而后甲醇打浆得产物。白色固体，2.2g， 收率94.2％。
实施例3：1-苄基-4-(苯氨基)哌啶-4-羧酰胺(16)
称取化合物15(2.16g,7mmol)溶于15mL甲醇，超声助溶后转移至55℃下 搅拌，缓慢滴加DMA(2.5g,21mmol)，之后继续在55℃下反应。16小时停 止反应并旋干反应液，粗品用乙醚打浆得产物。白色固体，1.53g，收率68.6％。
实施例4：1-苯基-1,3,8-三氮螺环[4.5]癸-4-酮(18)
称取化合物16(1.5g,4.76mmol)溶于25mL甲醇，超声助溶后转移至冰 浴下搅拌，缓慢加入NaBH4(0.23g,5.95mmol)，之后在常温下反应。4小时停 止反应并加水1mL淬灭反应。旋干反应液，粗品用DCM 50mL溶解并用水(20 mL×2)洗涤。保留有机相，减压除去溶剂得17。化合物17用30mL甲醇溶解， 滴加少量甲酸，加入20％Pd(OH)2(0.3g,20％)并在氢气保护下常温反应。48 小时后停止反应并用硅藻土过滤，保留滤液，加入硅胶拌样并用柱层析纯化 (DCM:MeOH＝100:7,含0.1％TEA)。白色固体，0.65g，收率59.1％。
实施例5：4-氯-N-苯基丁酰胺(22a)
将原料苯胺21a(470mg,1eq,5mmol)、TEA(850mg,1.2eq,6mmol)溶 于20mL DCM，冰水浴下逐滴加入4-氯丁酰氯(1.01g,2eq,10mmol)，之后常 温反应。2小时后加水淬灭并用饱和Na2CO3溶液洗涤，保留有机相并旋干得粗 品。快速柱色谱纯化(PE:EA＝75:25)得产物。化合物22b-22e合成参考中间 体22a的合成方法。
实施例6：4-(4-氧-1-苯基-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸-8基)-N-苯基丁酰胺(23a)
将中间体22a(400mg,2eq,2mmol)、18(230mg,1eq,1mmol)和碘化钾 (17mg,0.1eq,0.1mmol)溶于10mL乙腈，而反应瓶置于90℃油浴中回流反 应。2小时后再次加入22a(200mg,1eq,1mmol)并继续反应24小时。反应结 束后，将反应液倒入清水20mL并加入乙酸乙酯(30mL×3)萃取。合并有机 相，饱和NaCl溶液洗涤后并旋干得粗品。快速柱色谱纯化(DCM:MeOH＝ 100:7)得目标产物。化合物23b-23e合成参考中间体22a的合成方法。
实施例7：N-(2-氟苄基)-4-羟基-N-苯基丁酰胺(34a)
将仲胺33a(600mg,1eq,3mmol)溶于干燥的甲苯10mL，而后体系密闭 并用氮气保护。冰浴下缓慢加入三甲基铝的甲苯溶液(2M in toluene,2eq,3 mL)，加入完毕在常温下活化2小时。取γ-丁内酯(510mg,2eq,6mmol)加入 上述反应体系并将反应瓶转移至65℃反应24小时。反应结束后，转移至冰浴 并加入甲醇、饱和酒石酸钾钠溶液淬灭反应。反应体系缓慢倒入乙酸乙酯溶液， 有机相依次用清水、饱和食盐水洗涤。保留有机相，旋干得粗品。快速柱色谱纯 化(PE:EA＝40:60～0:100)得中间体34a。34b-34o均按此法制得。
实施例8：N-(2-氟苄基)-4-氧代-N-苯基丁酰胺(35a)
取伯醇34a(145mg,1eq,0.5mmol)溶于干燥的DCM 15mL，冰浴下缓慢 加入戴斯马丁试剂(425mg,2eq,1mmol)，加入完毕转移至常温下反应1小时。 反应结束后，加入饱和硫代硫酸钠溶液和饱和Na2CO3溶液淬灭反应。水相用 DCM(10mL×3)洗涤。合并有机相并旋干得粗品。快速柱色谱纯化(PE:EA ＝75:25)得中间体35a。35b-35o的制备参照35a的合成路线。
实施例9：N-(2-氟苄基)-4-(4-氧代-1-苯基-1,3,8-三氮杂螺[4.5]癸-8基)-N-苯基 丁酰胺(36a)
取中间体35a(142mg,1eq,0.5mmol)、18(115mg,1eq,0.5mmol)和无 水MgSO4(300mg,2.5mmol)置于25mL圆底烧瓶，加入甲醇10mL溶解并在 常温反应过夜。冰浴下缓慢加入NaBH4(12mg,0.3mmol)，而后转移至常温反 应2小时。反应结束，加入清水淬灭反应并用硅藻土过滤。旋干滤液得产物粗 品。C18快速柱色谱纯化(H2O(0.1％TFA):MeOH＝40:60～80:20)得目标产物。 终产物36b-36o参照36a的合成方法制备纯化。
实施例10：本发明化合物荧光偏振法测定KRAS-PDEδ蛋白结合抑 制活性
实验材料：
阿托伐他汀荧光探针(Atrovastatin-PEG3-FITC)，缓冲液(0.1 M PBS,0.05％chaps,0.5％DMSO)，PDEδ蛋白，黑色96孔板
1.FITC探针与PDEδ蛋白的结合常数测定
a.取黑色96孔板1块，平衡至室温；
b.用缓冲液将阿托伐他汀荧光探针稀释至100nM；
c.用缓冲液稀释PDEδ蛋白，蛋白浓度依次为1000nM、500nM、 250nM、125nM、62.5nM、31.25nM、15.63nM、7.81nM、3.90 nM、1.85nM；
d.三复孔测量，在96孔板中1-10孔依次加入配好的PDEδ蛋白 溶液50uL，1-11孔中加入稀释的探针溶液50uL(11孔为空白对照，) 用缓冲液补充每孔溶液体积至200uL，加毕30℃下避光孵育2小 时；
e.用Biotek Synergy H2酶标仪读取荧光各向异性值(激发波长： 485，检测波长535)，探针与PDEδ蛋白的结合常数根据荧光各向异 性值的非线性回归拟合得到Mathamatica 9(Wolfram Research Inc.)， 公式如下：
公式中，F为荧光探针(Atrovastatin-PEG3-FITC)结合比例，A 为荧光偏振各向异性测量值，Q值是指探针与浓度最高组蛋白结合的 荧光强度同自由状态的荧光强度的比值，AB值为结合状态下的探针 各向异性值，AF值为自由状态下的探针的各向异性值，LST为荧光探 针浓度，Rt为蛋白浓度，KD1为FITC探针的蛋白结合常数。
根据曲线确定测量化合物结合常数时选定的蛋白浓度为160 nM，探针浓度为100nM
2.化合物与PDEδ蛋白的结合常数测定
a.取黑色96孔板1块，平衡至室温；
b.用缓冲液分别将阿托伐他汀荧光探针和PDEδ蛋白稀释至100 nM和160nM；
c.用DMSO溶解化合物，并用含0.2％Tween-80的缓冲液稀释化 合物浓度依次为10uM、5uM、2.5uM、1.25uM、0.625uM、312.5 nM、156.3nM、78.12nM、39.1nM、19.5nM；
d.三复孔测量，在96孔板中1-1孔依次加入PDEδ蛋白溶液50 uL，1-12孔中加入FITC探针溶液50uL，1-10孔分别加入配好的化 合物溶液100uL，其余孔用缓冲液补充每孔溶液体积至200uL，加 毕30℃下避光孵育10小时；
e.用Biotek Synergy H2酶标仪读取荧光各向异性值(激发波长： 485，检测波长535)，化合物与蛋白的结合常数根据荧光各向异性 值的非线性回归拟合得到Mathamatica9(Wolfram Research Inc.)，公 式如下：
d＝KD1+KD2+LST+LT-RT；
e＝(LT-RT)×KD1+(LST-RT)×KD2+KD1×KD2；
f＝-KD1×KD2×RT；
公式中，F为荧光探针(Atrovastatin-PEG3-FITC)结合比例，A 为荧光偏振各向异性测量值，Q值是指探针与浓度最高组蛋白结合的 荧光强度同自由状态的荧光强度的比值，AB值为结合状态下的探针 各向异性值，AF值为自由状态下的探针的各向异性值，LST为荧光探 针浓度，Rt为蛋白浓度，KD1为FITC探针的蛋白结合常数，KD2为 化合物的蛋白结合抑制常数。
实施例11：本发明化合物体外抗肿瘤活性测试：
1、试验细胞株
Mia PaCa-2(人胰腺癌细胞)，购自中科院上海生化细胞所。
培养液为DMEM+10％FBS+2.5％HS+双抗。
2、仪器
5％CO2培养箱、96孔板(WHB)、Biotek Synergy H2酶标仪
3、试验方法
受试化合物样品液配制：用DMSO(Merck)溶解后，加入含FBS 的培养基溶液配成100μM的溶液或均匀的混悬液，然后用 0.1％DMSO的培养基稀释，最终浓度分别为100μM、33.3μM、11.1 μM、3.70μM、1.23μM、0.41μM。
将文献报道的KRAS-PDEδ抑制剂Deltazinone(DZ)以同样的条 件配成对照品溶液。
本实验方法采用的是CCK8法。为96孔板每孔加入浓度为7×104个/mL的细胞悬液100μL，即5000个细胞/孔，置37℃、5％CO2培 养箱内。24小时后，去除上层培养液，分别加入受试化合物样品液 和对照品液，100μL孔，37℃作用72小时。每孔加入10mg/mL的 CCK8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑 单钠盐)溶液10μL，作用2小时后用酶标仪测570nm OD值，计算 半数抑制浓度IC50。
抑制率＝(空白对照孔OD值-给药孔OD值)/空白对照孔OD值 ×100％。根据各个浓度的IC％值，用GraphPad软件进行非线性回归， 算出各化合物抑制50％细胞生长的浓度，即IC50。
化合物的抗肿瘤活性详见下表，其中，样品是指相应实施例中制 备的二氢喹唑啉酮类化合物。
阳性药选取文献报道的KRAS-PDEδ抑制剂Deltazinone(DZ)作 为对照。
体外抗肿瘤实验结果显示，大部分化合物表现对KRAS依赖型肿 瘤株有较强的抑制活性特点，部分发明的化合物结果优于对照药 Deltazinone。
实施例12：本发明化合物在裸鼠胰腺癌PDX模型中显著抑制肿瘤生 长：
利用胰腺癌的PDX模型进一步评价36l的体内药效。基于此，首 先筛选敏感临床原代细胞系。选择4种不同的原代胰腺癌细胞株进 行筛选，分别为0001、0037、0034和0043。以CCK8法分别测定细 胞在不同浓度的36l作用后生长曲线。化合物36l能够呈浓度依赖地 抑制原代细胞的生长，且对0001、0037及0034的抑制作用较0043 细胞株更为敏感。相比之下，阳性对照2对4株细胞系均没有显著的 抑制活性
根据原代细胞的体外抗肿瘤活性结果，选择敏感细胞株0034进行 PDX模型的构建。在肿瘤体积至100mm3左右开始给药。化合物36l 按照50mg/kg的剂量，腹腔给药，一天给药一次。鉴于化合物2体 内代谢稳定性差，阳性对照选择胰腺癌的一线药物吉西他滨，按10mg/kg的剂量尾静脉给药，每三天给药一次。实验结果(图1A-C) 表明，化合物36l显著抑制PDX肿瘤的生长，其抑瘤率达到57.3％。 从肿瘤重量和体积变化来看，药物组和空白组有显著的差异(P< 0.05。)尽管化合物36l的抑瘤率不如吉西他滨，但36l是现有的KRAS- PDEδ抑制剂中抑瘤率最高的，而且也是在胰腺癌PDX模型中唯一有 效的KRAS-PDEδ抑制剂。这个结果进一步验证KRAS-PDEδ相互作 用的成药潜力，对发掘KRAS-PDEδ抑制剂的临床应用具有十分重要 的意义。
为进一步验证药物对肿瘤组织的作用，将体内实验的PDX肿瘤 制成组织切片，并进行染色分析。首先用苏木素-伊红染色 (hematoxylin and eosin stain,H&E stain)来评价肿瘤组织的病理学变 化。如图1所示，36l组与和空白组相比，肿瘤组织中有明显的透明 质变增多的现象，证明化合物36l在体内诱导肿瘤细胞的老化和死亡。 进一步用Ki-67免疫组化染色检测肿瘤组织中增殖细胞的数量，以评 价不同组肿瘤增殖能力的强弱。结果显示(图1D-E)，36l的用药组 的肿瘤切片中能够明显增殖细胞数量的减少，而吉西他滨组的肿瘤切 片也能观察到同样的抑制作用。组织切片染色结果进一步证明化合 物36l能够在体内显著抑制胰腺癌的增殖。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并 不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范 围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都 应涵盖在本发明的保护范围之内。