一种携带hiv-1基因的重组流感病毒株及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种携带hiv-1基因的重组流感病毒株及其制备方法与应用 (Recombinant influenza virus strain carrying HIV-1 gene and preparation method and application thereof ) 是由 朱应 马采娇 刘实 佘应龙 于 2021-06-21 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种携带HIV-1基因的重组流感病毒株及其制备方法与应用,所述重组流感病毒株为携带HIV-1基因的流感病毒载体通过反向遗传系统在细胞中拯救出的重组流感病毒；所述HIV-1基因位于改造甲型流感病毒NS片段的开放阅读框内；所述改造甲型流感病毒NS片段的剪接位点将525-CCAGGA-530突变为525-CCCGGG-530；所述HIV-1基因片段的5’端通过连接子与甲型流感病毒NS1片段3端’连接；HIV-1基因片段的3’端通过连接子与NEP片段5’端连接。该重组流感病毒可在宿主细胞或鸡胚中稳定传代,可用于HIV-1疫苗的开发、药物的开发以及利用细胞或鸡胚作为生物反应器生产HIV蛋白。(The invention provides a recombinant influenza virus strain carrying HIV-1 gene and a preparation method and application thereof, wherein the recombinant influenza virus strain is a recombinant influenza virus rescued from cells by an influenza virus vector carrying HIV-1 gene through a reverse genetic system; the HIV-1 gene is positioned in an open reading frame of a modified influenza A virus NS segment; the splicing site of the modified influenza A virus NS segment mutates 525-CCAGGA-530 into 525-CCCGGG-530; the 5 'end of the HIV-1 gene segment is connected with the 3' end of the influenza A virus NS1 segment through a linker; the 3 'end of the HIV-1 gene fragment is connected with the 5' end of the NEP fragment through a linker. The recombinant influenza virus can be stably passaged in host cells or chick embryos, and can be used for development of HIV-1 vaccines and medicines and production of HIV proteins by using the cells or the chick embryos as bioreactors.)
技术领域
本发明属于生物
技术领域
，涉及一种携带HIV-1基因的重组流感病毒株及其制备方法与应用。背景技术
A型流感病毒(influenza A virus),属于正粘病毒科，其基因组由8个负极性RNA片段(vRNA)组成。在流感病毒中其基因组的8个RNA片段与三种聚合酶蛋白(PB2、PB1、PA)以及核蛋白(NP)结合形成了具有活性的核糖核蛋白聚合体(RNPs)。A型流感病毒感染宿主细胞时，血细胞凝集素(HA)介导病毒颗粒与宿主细胞上唾液酸受体结合。在流感病毒以膜融合的方式进入细胞后，病毒会释放出RNPs，RNPs进入细胞核后开始病毒基因组的复制与转录，8种RNA片段分别转录出信使RNA(mRNA)和互补RNA(cRNA)，mRNA经翻译合成病毒蛋白，cRNA通过复制产生vRNA，之后经过组装产生子代流感病毒。
甲型流感病毒的基因组包含8个片段。其中病毒片段聚合酶(PB2)、血细胞凝集素(HA)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)的mRNA是单顺反子。很多研究发现聚合酶PB1包含多个翻译起始位点。聚合酶(PA)则可以通过核糖体移框和多个翻译起始位点编码多种蛋白。基质蛋白(M)和非结构蛋白(NS)则会发生RNA的剪接产生多种mRNA。通过将M和NS中的RNA剪接位点突变并将其开放阅读框通过连接肽连接也可以表达相应的蛋白，拯救出的重组流感病毒在适宜条件下可以正常的复制。
流感病毒反向遗传系统目前主要包括8质粒系统和12质粒系统。目前国际上常用的为8质粒系统，因为12质粒系统所需质粒较多并且对转染效率要求更高。通过将流感病毒基因组8个vRNA的cDNA以克隆的方式正向插入到polⅡ启动子(从人巨细胞瘤病毒CMV启动子衍化而来)和终止序列(牛生长激素poly(A)信号bGH)之间，并在此表达盒之间还反向插入了人polⅠ启动子和鼠polⅠ终止序列从而形成了一个双向表达系统。将这套系统质粒转染真核细胞，就可以实现在同一个模板上由polⅠ控制合成负链vRNA，由polⅡ控制合成正链mRNA并表达蛋白质，之后通过组装产生流感病毒从而完成流感病毒的拯救。因为流感病毒反向遗传系统的开发，使得通过对流感病毒基因组改造拯救出携带有外源片段的重组流感病毒变成了可能。
近年，多种来源的2A肽的多基因载体构建策略受到广泛关注。该策略规避了多基因表达时蛋白活性不高或下游基因表达量低等缺点，具备明显的优势，是目前较为理想的多基因表达策略。在流感病毒改造中利用2A多肽也越来越常见。
人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)，即艾滋病病毒，是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒，属于逆转录病毒。根据联合国艾滋病规划署(UNAIDS)的报告，2019年全球有近3800万人感染HIV，69万人死于艾滋病。人类免疫缺陷病毒严重影响着世界各国人民的健康，而由艾滋病引起的死亡率明显高于其他性传播疾病。因此世界卫生组织定义人类免疫缺陷病毒I型为一类致癌物、人类免疫缺陷病毒II型为2B类致癌物。目前国际上广泛使用暴露前预防(PrEP)和抗逆转录病毒疗法(ART)来预防或治疗人类免疫缺陷病毒感染。尽管ART和PrEP有降低发病率的潜力，但这两种方法都需要坚持用药和持续的药物供应。因此，保护性和治疗性的人类免疫缺陷病毒疫苗制备成为了很多国家对人类免疫缺陷病毒研究的重点。
发明内容
为了解决所述技术问题，本发明提供了一种携带HIV-1基因的重组流感病毒株及其制备方法与应用，本发明首次以流感病毒为载体携带HIV-1基因，广谱性高且成本低。
在本发明的第一方面，提供了一种携带HIV-1基因的重组流感病毒株，
所述重组流感病毒株为携带HIV-1基因的流感病毒载体通过反向遗传系统在细胞中拯救出的携带HIV-1基因的重组流感病毒；其中，所述流感病毒载体包括A型流感病毒A/WSN/33或A/PR/8/34中的一种；
所述HIV-1基因位于改造过的甲型流感病毒NS片段的开放阅读框内；
所述改造过的甲型流感病毒NS片段的剪接位点进行了同义突变：将525-CCAGGA-530突变为525-CCCGGG-530；
所述HIV-1基因来源为HIV-1B亚型或CRF01_AE重组型；所述HIV-1基因片段的5’端通过连接子与甲型流感病毒NS1片段3端’连接；所述HIV-1基因片段的3’端通过连接子与甲型流感病毒NEP片段5’端连接。
进一步地，所述HIV-1基因为B亚型的V3、MPER联合优势抗原表位，所述HIV-1基因的序列如SEQ ID NO：1所示，所述携带HIV-1基因的重组流感病毒株的保藏编号为CCTCCNO:V202145，流感病毒载体具体为A型流感病毒A/WSN/33。
进一步地，所述HIV-1基因为CRF01_AE重组型的D环、V3环、CD4结合位点联合优势抗原表位，所述HIV-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述携带HIV-1基因的重组流感病毒株的保藏编号为CCTCC NO：V202146，流感病毒载体具体为A型流感病毒A/WSN/33。
进一步地，所述HIV-1基因为CRF01_AE重组型的V5环、β20/21链、β23/24链联合优势抗原表位，所述HIV-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述携带HIV-1基因的重组流感病毒株的保藏编号为CCTCC NO：V202147，流感病毒载体具体为A型流感病毒A/WSN/33。
在其他实施方式中，所述HIV-1基因还可以为CD4结合位点(CD4bs)的全基因或优势表位、或gp120蛋白第三超变区(V3)的全基因或优势表位、或gp120蛋白第五超变区(V5)的全基因或优势表位、或gp41蛋白近膜端外部区(MPER)的全基因或优势表位；或者也可以是以上多种蛋白的优势表位。
所述重组流感病毒可以在MDCK细胞、A549细胞、VERO细胞或鸡胚中进行传代和扩增；
在本发明的第二方面，所述携带HIV-1基因的重组流感病毒株在制备HIV-1疫苗中的应用以及在利用鸡胚或细胞作为生物反应器生产HIV蛋白中的应用。
进一步地，所述疫苗包括所述的携带HIV-1基因的重组流感病毒株的病毒载体疫苗或所述的携带HIV-1基因的重组流感病毒株利用鸡胚或细胞作为生物反应器所表达的HIV蛋白制备成的亚单位疫苗。
所述HIV-1疫苗为单基因、多价嵌合疫苗；所述重组流感病毒可用通用技术加工可供临床用的制剂，所述制剂包括液体制剂、冻干制剂、胶囊制剂、片剂或丸剂中的任一种。所述疫苗的接种途径包括肌肉注射、皮下注射、口服，还包括鼻腔、口腔、肛门和阴道粘膜途径。
在本发明的第三方面，提供了一种携带HIV-1基因的重组流感病毒株的制备方法，所述方法包括：
将甲型流感病毒WSN中NS片段的剪接位点进行同义突变，将525-CCAGGA-530突变为525-CCCGGG-530；
获得HIV-1基因片段；
将所述HIV-1基因片段通过Linker连接于所述NS1片段和所述NEP片段之间，获得5’-3’方向分别为NS1、自剪接肽段、HIV-1基因、自剪接肽段、NS2的重组NS质粒；
将所述重组NS质粒和WSN的其他七个质粒共转染宿主细胞，获得携带HIV-1基因的重组流感病毒株。
上述技术方案中，将NS片段525-530位的6个碱基CCAGGA同义突变为CCCGGG从而破坏了NS片段上剪接受体位点，使NS无法自然发生可变剪接。
在本发明的第四方面，提供了一种HIV-1蛋白，编码所述HIV-1蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：1-3所示序列中的一条。
在本发明的第五方面，提供了一种编码所述HIV蛋白的核酸分子，。
在本发明的第六方面，提供了一种生物材料，所述生物材料包括表达载体、包含所述表达载体的细胞系或重组菌，所述表达载体包含有所述的核酸分子，所述细胞系包括293T、COS细胞、293T、MDCK、COS和MDCK中的一种。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
1、本发明提供的一种携带HIV-1基因的重组流感病毒株及其制备方法与应用目前国内外还无有效的HIV-1疫苗，本发明以流感病毒为载体表达HIV-1抗原，有望作为HIV-1的潜在候选疫苗；
2、本发明中携带HIV-1基因的重组流感病毒接种人体后可同时产生针对流感病毒和HIV-1的抗体，具有双重疫苗的作用；
3、本发明中的携带HIV-1基因的重组流感病毒可用于HIV蛋白的大规模生产纯化与功能研究，亦可用作HSV-2亚单位疫苗或蛋白疫苗的研发；本发明中携带HIV-1基因的重组流感病毒可以采用喷雾形式经鼻腔口腔途径免疫，与传统疫苗接种方式相比更为方便快捷；
4、本发明所述携带HIV-1基因的重组流感病毒可以用作(1)HIV-1疫苗的制备；(2)HIV蛋白的功能研究；(3)利用鸡胚作为生物反应器生产HIV蛋白。
本发明的携带HIV-1基因的重组流感病毒株的保藏日期为2021年5月25日，保藏编号为CCTCC NO:V202145，名称为重组甲型流感病毒IAV-1A。保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072。
本发明的携带HIV-1基因的重组流感病毒株的保藏日期为2021年5月25日，保藏编号为CCTCC NO:V202146，名称为重组甲型流感病毒IAV-CD4。保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072。
本发明的携带HIV-1基因的重组流感病毒株的保藏日期为2021年5月25日，保藏编号为CCTCC NO:V202147，名称为重组甲型流感病毒IAV-V5。保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1左图为A型流感病毒基因组示意图；右图为改造NS片段之后的重组病毒基因组示意图；
图2所示A型流感病毒基因组中NS发生可变剪接从而产生两种mRNA，分别是NS1和NEP；
图3所示通过将NS片段进行改造，将两种自剪接多肽插入NS1和NS2的开放阅读框中之后将外源片段插入到两种自剪接多肽片段中构建全新携带有HIV-1基因的流感病毒NS片段；
图4为改造NS的具体实施方案；SD为剪接供体位点，SA为剪接受体位点；将NS片段525-530位的6个碱基CCAGGA同义突变为CCCGGG从而破坏了NS片段上剪接受体位点，使NS无法自然发生可变剪接；在NS1开放阅读框后连接自剪接多肽片段，NEP片段前引入P2A片段并将外源片段插入自剪接多肽之间并使NS1、自剪接多肽1、外源片段、自剪接多肽2处在同一开放阅读框内；
图5为含有HIV-1片段的重组流感病毒和野生型病毒感染MDCK后，提取RNA经过RT-PCR检测流感病毒NP的电泳图；
图6为含有HIV-1片段的重组流感病毒和野生型病毒感染MDCK后，提取RNA经过RT-PCR检测流感病毒NS的电泳图；
图7为含有HIV-1片段的重组流感病毒和野生型病毒感染MDCK后，提取RNA经过RT-PCR检测流感病毒中HIV-1基因的电泳图；
图8为对照组和实验组小鼠二次免疫2周后血清中IgA的含量；
图9为对照组和实验组小鼠二次免疫2周后血清中IgG的含量；
图10为对照组和实验组小鼠注射vPE16病毒1周后卵巢中病毒滴度；
图11为重组流感病毒免疫小鼠的说明图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的效果进行详细说明。如无特殊提及，以下方案中提到的分子克隆方法、蛋白表达纯化方法、细胞培养方法及各种检测方法等均为传统实验方法，可通过查询文献获得；用到的相关试剂可从对应试剂商处购买获得。
实施例1、重组NS片段的构建
1、对NS片段中RNA剪接位点进行同义突变，525-CCAGGA-530突变为525-CCCGGG-530。采用常规分子生物学方法以克隆手段或者直接合成突变后NS的策略进行突变，克隆设计两段引物通过同源重组酶同源重组即可。
在构建重组质粒时，将NS片段525-530位的6个碱基CCAGGA同义突变为CCCGGG从而破坏了NS片段上剪接受体位点，使NS无法自然发生可变剪接。
2、通过基因合成手段分别合成获得HIV蛋白基因片段：
(1)所述HIV-1基因为B亚型的V3、MPER联合优势抗原表位，所述HIV-1基因的序列如SEQ ID NO：1所示，所述携带HIV-1基因的重组流感病毒株的保藏编号为CCTCC NO:V202145；
(2)所述HIV-1基因为CRF01_AE重组型的D环、V3环、CD4结合位点联合优势抗原表位，所述HIV-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
(3)所述HIV-1基因为CRF01_AE重组型的V5环、β20/21链、β23/24链联合优势抗原表位，所述HIV-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
3、将突变后的NS片段根据NS1和NEP的开放阅读框通过自剪接多肽与外源HIV蛋白基因连接得到重组NS片段，如图4所示，获得5’-3’方向分别为NS1、P2Alinker、HIV-1基因、T2Alinker、NEP的重组NS质粒；
具体来说，我们选择在NS1和NEP片段中间插入合成的表达HIV-1蛋白的基因，两段用T2A和P2A这两种自剪接连接子连接。所以，该重组基因片段在细胞内表达时也会发生剪接现象，从而表达不同大小的蛋白(NS1、HIV-1、NEP、NS1-HIV-1、HIV-1-NEP、NS1-HIV-1-NEP)。
具体步骤为：将T2Alinker、P2Alinker、NS连同PHW2000质粒克隆下来，呈线性，引物为：
1A-NEP-F：attggctgtggtatataaaagctactaacttcagcctgct(如SEQ ID NO：4所示)；
NS1-1A-R：ggtcttgtacaattagggccgggattctcctc(如SEQ ID NO：5所示)；
退火温度为65℃，延伸50s，跑胶，进行胶回收。
CD4-NEP-F：tgtaatgcacagttttaatgctactaacttcagcctgctgaag(如SEQ ID NO：6所示)；
NS1-CD4-R：cgtgaaattgtcagacatagggccgggattctcctc(如SEQ ID NO：7所示)；
退火温度为66℃，延伸50s，跑胶，进行胶回收。
V5-NEP-F：ggtgcaaagagaaaaagctactaacttcagcctgctgaag(如SEQ ID NO：8所示)；
NS1-V5-R：ttcctacttcctgcatagggccgggattctcctc(如SEQ ID NO：9所示)；
退火温度为66℃，延伸50s，跑胶，进行胶回收。
将上述HIV-1基因(整个片段均采用基因合成手段合成)克隆下来。引物为：
1A-F：aattgtacaagacccaacaacaatacaa(如SEQ ID NO：10所示)；
1A-R：ttttatataccacagccaatttgttatgt(如SEQ ID NO：11所示)；
退火温度为55℃，延伸10s，跑胶，进行胶回收。
CD4-F：atgtctgacaatttcacgaacaatgct(如SEQ ID NO：12所示)；
CD4-R：attaaaactgtgcattacaatttctgggtc(如SEQ ID NO：13所示)；
退火温度为58℃，延伸10s，跑胶，进行胶回收。
V5-F：atgcaggaagtaggaaaagcaatgtatg(如SEQ ID NO：14所示)；
V5-R：tttttctctttgcaccactcttctctttg(如SEQ ID NO：15所示)；
退火温度为59℃，延伸10s，跑胶，进行胶回收。
将两个回收片段用同源重组酶进行同源重组，转化，提质粒。
4、构建好的3个重组质粒经测序鉴定，片段大小与预期完全一致，并且无基因突变。
实施例2、重组流感病毒的拯救
将流感病毒野生型PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M以及重组质粒共转染293T或COS细胞，也可以转染293T或COS与MDCK的共培养细胞系，6h后换成含有TPCK胰酶的DMEM培养基。TPCK胰酶终浓度1ug/ml。在37℃，5％CO2环境下，培养48h，收集上清。收集的上清经过澄清感染MDCK细胞。48-72h后收集上清进行空斑纯化，三轮空斑纯化后在MDCK中扩增病毒最后获得携带HIV-1基因的流感病毒疫苗株。
实施例3、空斑纯化流感病毒
病毒吸附前，消化MDCK细胞，将其铺入6孔板中，每孔细胞数为106。MDCK贴壁后并长成单层细胞后吸去培养基用PBS洗两遍。用含有0.3％BSA的PBS溶液对收集到的含有病毒的上清进行10倍稀释并按照每孔400ul的量加入六孔板中，每个梯度应适量设置副孔。吸附时间为1h，吸附结束后用PBS洗去残留上清。将2×DMEM与已经融化好的低熔点琼脂糖1:1混合并加入TPCK胰酶，终浓度1ug/ml。每孔中加入2ml混合物，待其冷却凝固后放入37℃培养箱中培养。第二天后开始观察空斑生长情况。待空斑长出来，用枪头挑斑，同样以吸附感染的方式感染新的MDCK细胞，24-48h后提取细胞RNA，RT-PCR检测NP，NS和外源片段。
实施例4、重组流感病毒的鉴定
用移液枪吸去细胞上清并用PBS洗两遍。将适量的RNAiso Plus加入六孔板，溶解细胞。细胞中RNA的提取参照说明书进行操作。提取的RNA用通用引物和随机引物做引物进行逆转录。对获得的cDNA进行PCR鉴定。用不同的引物分别鉴定重组病毒的NP、NS以及外源片段。结果如图5、6、7所示。
由图5-图7可知，本发明实施例的重组病毒包装成功。
实施例5、重组病毒作为HIV-1疫苗的应用
8周龄SPF级BALB/c小鼠分为四组：对照组、实验组1、实验组2、实验组3，每组5只小鼠。用WSN(H1N1)重组流感病毒通过滴鼻感染小鼠进行第一次免疫，六周后用X31(H3N2)加强免疫。第二次免疫两周后对小鼠取血，通过ELISA测定小鼠血清中IgA、IgG，结果如图8、9所示。
由图8-图9可知，在所有接种过重组病毒的小鼠中均可检测到特异性IgA、IgG抗体，说明三种重组病毒都引发了HIV特异性IgA、IgG反应。
第二次免疫四周后对小鼠腹腔注射表达HIV-1全长gp160蛋白的重组痘苗病毒vPE16，六天后取小鼠的卵巢检测vPE16病毒滴度，结果如图10所示。整个实验流程如图11所示。
由图10可知，事先接种过重组流感病毒的小鼠卵巢中的HIV-1病毒载量明显低于空白组，说明重组病毒免疫后的小鼠对vPE16的攻击完全有保护作用。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 一种携带HIV-1基因的重组流感病毒株及其制备方法与应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 231
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aattgtacaa gacccaacaa caatacaaga aaaagaatcc gtatccagag aggaccaggg 60
agagcatttg ttacaatagg aaaaatagga aatatgagac aagcacattg taacattagt 120
ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggcagcg gcggcgaatt agataaatgg 180
gcaagtttgt ggaattggtt taacataaca aattggctgt ggtatataaa a 231
<210> 2
<211> 309
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtctgaca atttcacgaa caatgctaaa accataatag tacagctgaa agaatctgta 60
gaaattaatt gtacaagacc caacaacaat acaagaaaaa gtatacatat aggaccaggg 120
agagcatttt atactacagg agaaataata ggagatataa gacaagcaca ttgtaacatt 180
agtagagcaa aatggaatga cactttaaaa cagatagtta taaaattaag agaacaattt 240
gagaataaaa caatagtctt taatcactcc tcaggagggg acccagaaat tgtaatgcac 300
agttttaat 309
<210> 3
<211> 252
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgcaggaag taggaaaagc aatgtatgcc cctcccatca gaggacaaat tagatgttca 60
tcaaatatta cagggctgct attaacaaga gatggtggta ttaatgagaa tgggaccgag 120
atcttcagac ctggaggagg agatatgagg gacaattgga gaagtgaatt atataaatat 180
aaagtagtaa aaattgaacc attaggagta gcacccacca aggcaaagag aagagtggtg 240
caaagagaaa aa 252
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
attggctgtg gtatataaaa gctactaact tcagcctgct 40
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggtcttgtac aattagggcc gggattctcc tc 32
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgtaatgcac agttttaatg ctactaactt cagcctgctg aag 43
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgtgaaattg tcagacatag ggccgggatt ctcctc 36
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggtgcaaaga gaaaaagcta ctaacttcag cctgctgaag 40
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttcctacttc ctgcataggg ccgggattct cctc 34
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aattgtacaa gacccaacaa caatacaa 28
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttttatatac cacagccaat ttgttatgt 29
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atgtctgaca atttcacgaa caatgct 27
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
attaaaactg tgcattacaa tttctgggtc 30
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atgcaggaag taggaaaagc aatgtatg 28
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tttttctctt tgcaccactc ttctctttg 29
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