一种抗鼠伤寒沙门氏菌的纳米抗体及应用
阅读说明：本技术 一种抗鼠伤寒沙门氏菌的纳米抗体及应用 (Anti-salmonella typhimurium nano antibody and application thereof ) 是由 王妍入 张翠 任亚荣 王建龙 季艳伟 于 2020-12-31 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体ST-Nb9,所述的抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体ST-Nb9的氨基酸序列包括四个框架区FR1、FR2、FR3和FR4,还包括三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；所述的FR1的序列为SEQ NO:1所示序列,所述的FR2的序列为SEQ NO:2所示序列,所述的FR3的序列为SEQ NO:3所示序列,所述的FR4的序列为SEQ NO:4所示序列；所述的CDR1的序列为SEQ NO:5所示序列,所述的CDR2的序列为SEQ NO:6所示序列,所述的CDR3的序列为SEQ NO:7所示序列。本发明提供的抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体,具有独特的可变区序列,使得所述抗体对肠炎沙门氏菌具有特异的识别和结合能力。本发明提供的抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体,具有易于表达和表达效率高的优点。(The invention provides an anti-salmonella typhimurium nano antibody ST-Nb9, wherein the amino acid sequence of the anti-salmonella typhimurium nano antibody ST-Nb9 comprises four framework regions FR1, FR2, FR3 and FR4, and also comprises three complementary determining regions CDR1, CDR2 and CDR 3; the sequence of FR1 is shown as SEQ NO. 1, the sequence of FR2 is shown as SEQ NO. 2, the sequence of FR3 is shown as SEQ NO. 3, and the sequence of FR4 is shown as SEQ NO. 4; the sequence of the CDR1 is shown as SEQ NO. 5, the sequence of the CDR2 is shown as SEQ NO. 6, and the sequence of the CDR3 is shown as SEQ NO. 7. The anti-salmonella typhimurium nano antibody provided by the invention has a unique variable region sequence, so that the antibody has specific recognition and binding capacity on salmonella enteritidis. The anti-salmonella typhimurium nano antibody provided by the invention has the advantages of easiness in expression and high expression efficiency.)
技术领域
本发明属于分子生物学领域技术领域，一种抗鼠伤寒沙门氏菌的纳米抗体及应用。
背景技术
沙门氏菌是一种全球性的食源性致病。人体摄入含菌食物后会出现腹泻、呕吐、发热，伤寒、免疫力低下的儿童则会出现败血症、脱水、酸中毒、无尿、心力衰竭等症状，急救不及时将会危及生命。沙门氏菌已知有2000多种血清型，临床中常见的血清型主要是鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等。良好规范的生产操作过程和危害分析与关键点控制(HACCP)等管理体系的应用可以很大程度上减少食源性致病菌的发生。
目前，检测沙门氏菌的方法主要有生化培养法、免疫学检测方法、分子检测方法。传统的生化培养法是检测沙门氏菌的国标方法，尽管灵敏可靠，但因其需要多步富集，分离，筛选和生化鉴定步骤，不能适应快速检测的需求：分子检测方法有传统PCR、实时荧光定量PCR(RT-PCR)、环介导等温扩增(LAMP)。
但上述方法都具有检测成本高、对检测人员技术要求较高的问题。酶联免疫吸附测定方法(ELISA)凭借其高灵敏度、低成本和高通量的压倒性优势而广泛用于临床，环境监测和学术研究。然而目前大多数免疫技术通常依赖于单克隆抗体(mAb)或者多克隆抗体(pAb)，它们都不能耐受极端环境，例如高温、有机溶剂和强离子。且单克隆抗体在细胞融合时失败率较高，前期的筛选过程冗长且复杂，产生高质量的单克隆抗体有幸运因素的存在，而多克隆抗体普遍存在特异性差的弊端，这极大地限制了传统IgG抗体在分析和研究中的广泛应用。
纳米抗体技术，是在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术研发得到，是目前已知最小的可结合抗原的抗体分子。最初有比利时科学家Hamers R在骆驼血液中发现，普通的抗体蛋白由两条重链和两条轻链组成，而从骆驼血液中发现的新型抗体天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的重链抗体，克隆其可变区得到只由一个重链可变区组成的单域抗体，称为单域重链抗体(Variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH)，又称为纳米抗体(nanobody，Nb)。纳米抗体与多克隆抗体和单克隆抗体相比，还具有以下优点：
1)纳米抗体稳定性高、水溶性好。
2)具有更长的CDR3区，且CDRs区和自身的另一些结构域不存在成对互补关系，故具有更多的柔韧性和凸面性，加之小体积(12～15kD，2×2×4nm)，使其能更好的和抗原表面的裂缝和腔隙相结合，从而提高纳米抗体的抗原特异性和亲和力。对于表面结构较复杂的细菌或大分子蛋白等，纳米抗体则更有利于克服表面结构的位阻效应从而与表面抗原高效识别。
3)可在微生物系统中大量合成表达，为纳米抗体低成本、高效率的生产创造了条件。
4)目前针对鼠伤寒沙门氏菌的纳米抗体尚未见报道，因此针对鼠伤寒沙门氏菌高亲和力、高特异、成本低的纳米抗体的开发，有利于进一步提高鼠伤寒沙门氏菌免疫学检测的灵敏度和特异性，以达到现场检测的要求。
发明内容
针对上述现有技术不足与缺陷，本发明的目的在于，提供一种抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体及其应用，解决现有技术中的抗体对肠炎沙门氏菌特异的识别和结合能力弱、不易于表达和表达效率低的问题。
为了达到上述目的，本申请采用如下技术方案予以实现：一种抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体ST-Nb9，所述的抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体ST-Nb9的氨基酸序列包括四个框架区FR1、FR2、FR3和FR4，还包括三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；
所述的FR1的序列为SEQ NO:1所示序列，所述的FR2的序列为SEQ NO:2所示序列，所述的FR3的序列为SEQ NO:3所示序列，所述的FR4的序列为SEQ NO:4所示序列；
所述的CDR1的序列为SEQ NO:5所示序列，所述的CDR2的序列为SEQ NO:6所示序列，所述的CDR3的序列为SEQ NO:7所示序列。
本发明还具有如下技术特征：
所述的抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体ST-Nb9的氨基酸序列如SEQ NO:8所示。
所述的抗鼠伤寒沙门氏菌的纳米抗体ST-Nb9用于食品中鼠伤寒沙门氏菌检测的应用。
所述的食品包括饮用水、牛奶和果汁。
一种鼠伤寒沙门氏菌检测试剂盒，所述的试剂盒中含有所述抗鼠伤寒沙门氏菌的纳米抗体ST-Nb9。
一种多核苷酸，编码所述的抗鼠伤寒沙门氏菌的纳米抗体的氨基酸序列。
本发明与现有技术相比，有益的技术效果是：
(Ⅰ)本发明提供的抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体，具有独特的可变区序列，使得所述抗体对肠炎沙门氏菌具有特异的识别和结合能力。
(Ⅱ)本发明提供的抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体，具有易于表达和表达效率高的优点。
(Ⅲ)本发明提供的抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体，具有亲和力高，特异性强的优点。
(Ⅳ)本发明提供的抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体，具有稳定性强的优点。
附图说明
图1是淘选阳性克隆间接ELISA鉴定结果。
图2是以纳米抗体ST-Nb9与噬菌体展示纳米抗体建立的夹心ELISA标准曲线，线性范围为5×104-3×108CFU/mL，R2＝0.99，LOD为5.1×104CFU/mL。
图3是纳米抗体ST-Nb9的特异性分析。
图4是纳米抗体ST-Nb9的热稳定性分析。
以下结合附图和实施例对本发明的具体内容作进一步详细解释说明。
具体实施方式
以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。
本发明采用灭活的鼠伤寒沙门氏菌免疫双峰驼，从经免疫的双峰驼的外周血淋巴细胞中提取其RNA，特异性扩增骆驼单链抗体可变区基因，从而构建纳米抗体基因库，分析其库容量及多样性。通过用噬菌体展示技术，从纳米抗体库中筛选能与鼠伤寒沙门氏菌特异性结合的纳米抗体，构建纳米抗体表达载体，对其进行原核表达、纯化与鉴定，即得到所需要的纳米抗体。
实施例1：
噬菌体展示纳米抗体免疫文库的构建
1)骆驼免疫：取5mL稀释至108CFU/mL灭活后的鼠伤寒沙门氏菌菌液与等体积弗氏完全佐剂乳化后，对一只健康双峰驼进行皮下多点注射，此后每隔两周免疫一次，共免疫五次，第二次至第五次免疫使用弗氏不完全佐剂进行抗原乳化，四免后开始采血检测。在第四次免疫后7～10天加强免疫，而后在加强免疫一周后用采血管颈静脉采血20mL，同时轻柔颠倒采血管避免血液凝固，再用LeukoLOCK RNA(Invitrogen)试剂盒中的滤器处理血液，然后依次用3mL磷酸盐缓冲液和3mL RNAlater缓冲液冲洗滤器，淋巴细胞会截留在滤器里，最后将滤器密封保存4℃，以备提RNA用。
2)提取骆驼血液中白细胞总RNA：取70μL pH调节缓冲液与2.5mL裂解液混合；将密封的过滤器打开，在室温下融化，用注射器将滤器内剩余的少量RNAlater缓冲液冲去；用3mL注射器吸取现配制的裂解液2.5mL，收集流出液；加入2.5mL无核酸酶的ddH2O，混匀后，加入25μL蛋白酶K，将离心管在室温下以250rpm震荡5min；将RNA结合磁珠混匀，取50μL加入到上述裂解液中，混匀后，加入2.5mL异丙醇，室温轻轻震荡5min；2000g、3min离心使磁珠沉淀，小心移除上清；向磁珠中加入600μL洗液1，用移液器混匀后转移至1.5mL离心管；将离心管16000g离心30～60s，使磁珠聚集，弃掉上清；加入750μL洗液2/3，涡旋15s使聚集的磁珠再次分散开，于16000g离心30s，收集磁珠；室温下，将离心管敞口2min，配制TURBO DNase混合液，取4μL加入到296μL LeukoLOCK DNase缓冲液中，混匀、加到上述离心管中，并涡旋混匀；加入300μL裂解液(不用加pH调节缓冲液)和300μL异丙醇，混匀后16000g离心30s，去除上清，加入750μL洗液2/3，涡旋15～30s，于16000g离心30s收集磁珠，重复用洗液2/3冲洗磁珠一次；将离心管敞口是问放置3min挥发掉管内溶液；加入两个30μL洗脱液溶解磁珠，再16000g离心2min，上清即为提取的RNA，将其转移至无RNase离心管，4℃保存备用。
3)cDNA的合成：以RNA为模板合成cDNA。取3个200μL PCR管，分别加入1μL dNTPmix、1μL的oligo(dT)以及8μL的RNA；将混合物65℃水浴5min，打开模板二级结构，立即置于冰上冷却1min，使模板RNA变性；然后在离心管中配置反应混合液，反应体系为：
10×RT buffer
6μL
25mM MgCl<sub>2</sub>
12μL
0.1M DTT
6μL
RNaseOUT(40U/μL)
3μL
SuperScript 3RT(200U/μL)
3μL
反应混合液进行加热，先50℃、50min，再85℃、5min终止反应；然后迅速置于冰上冷却。每管分别加入1μL RNase，混匀；37℃加热20min，完成cDNA第一链合成，分装保存于-20℃。
4)VHH基因的扩增；采用巢氏PCR方法扩增重链抗体VHH的基因，两轮PCR使用的引物序列如下：
CALL001：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
CALL002：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
F：5’-GGCCCAGGCGGCCGAGTCTGGRGGAGG-3’
R：5’-GGCCGGCCTGGCCGGAGACGGTGACCWGGGT-3’。
第一轮PCR：以cDNA为模板，利用引物CALL001和引物CALL002进行第一轮PCR扩增，反应体系为：
10×PCR buffer
5μL
50mM MgSO<sub>4</sub>
1.5μL
10mM dNTP
1μL
引物CALL001(10μM)
1μL
引物CALL002(10μM)
1μL
ddH<sub>2</sub>O
40.3μL
DNA聚合酶
0.2μL
反应条件：94℃，2min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min，30个循环；72℃，5min。4℃保存。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，切取700bp附近的目的条带，用天根胶回收试剂盒按照说明书操作步骤回收PCR产物，测定回收产物的浓度用于下一步实验。
第二轮PCR：以第一轮PCR胶回收产物(700bp附近的条带)为模板，用引物VHH-SfiI-For和VHH-SfiI-Back扩增VHH基因片段，反应体系为：
10x PCR buffer
5μL
50mM MgSO<sub>4</sub>
1.5μL
10mM dNTP
1μL
引物VHH-SfiI-For(10μM)
1μL
引物VHH-SfiI-Back(10μM)
1μL
ddH<sub>2</sub>O
40.3μL
DNA聚合酶
0.2μL
反应条件：94℃，2min；94℃，30s；55℃，30s；68℃，1min，30个循环；68℃，5min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，切取目的条带(400bp附近)，用天根胶回收试剂盒按照说明书操作步骤回收PCR产物，测定回收产物的浓度用于下一步实验。
噬菌体展示纳米抗体文库的构建和鉴定：
1)载体和插入片段的酶切反应：采用SfiI酶(Thermo Scientific)50℃过夜酶切pComb3Xss噬菌粒载体和VHH片段，酶切反应体系如下：
ddH<sub>2</sub>O
15μL
17μL
10×Fast Digest buffer
2μL
2μL
DNA
2μL pComb3X Plasmid DNA
10μL PCR products
Fast Digest enzyme
1μL
1μL
1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否完全，采用PCR产物纯化试剂盒(天根)纯化回收酶切产物。
2)载体和插入片段的连接：用T4连接酶(Thermo Scientific)在16℃下连接过夜，具体连接体系如下：
pComb3X酶切产物
1.4μg
VHH基因片段
0.495μg
10x T4 DNA Ligase buffer
20μL
T4连接酶
10μL
ddH2O
补足200μL
按照PCR产物纯化试剂盒(天根)操作说明将连接产物进行纯化，用30μL ddH2O洗脱连接产物，并使用Nanodrop测定DNA浓度，后保存于-20℃备用。
3)连接产物的电转化
取3μL连接产物加至50μL感受态细胞E.coli ER2738中，充分混匀，冰上放置1min。转入1mm的电击杯中电击转化，电转化条件为：1.8kV，200Ω，25μF，立即向电击杯中加入950μL LB培养基，37℃，250rpm培养1h。将菌液涂布于LB-Amp平板，37℃倒置培养过夜。
4)初始文库的救援
将电转后的菌液全部加入至200mL SB培养基中，培养至OD600达0.6～0.8；加入辅助噬菌体(Thermo Scientific)，37℃，250rpm培养2h后加入卡那霉素至终浓度为50μg/mL，37℃培养过夜；次日，4℃、8000rpm离心15min，取上清；加入1/4体积的5×PEG-NaCl溶液，冰上静置2h；4℃、12000rpm离心20min，弃上清，沉淀用1mL含0.5％BSA的PBS重悬；取10μL测定库容，其余加入终浓度50％甘油，-80℃保存。
实施例2：纳米抗体的亲和淘选及鉴定
1)纳米抗体的亲和淘选：首先，用PBS(pH7.4)将灭活的鼠伤寒沙门氏菌稀释至108CFU/mL，4℃包被过夜。第二天用0.05％PBST洗涤3次后，加入3％脱脂奶粉37℃封闭1小时。然后用PBST洗涤3次，每孔加入150μL驼源单域重链抗体库，37℃孵育1小时。弃去未结合的噬菌体，用PBST手动洗板10次，加入100μL的Glycine-HCl(0.2M，pH2.2)洗脱8min后，立即用4μL Tris-HCl(1M，pH9.1)中和。取10μL洗脱噬菌体测定滴度，其余的用于感染培养至对数期的E.coli ER2738菌株进行扩增。第三天用PEG/NaCl沉淀扩增后的噬菌体，并测定噬菌体的滴度。
在第二、第三轮的淘选过程中，为去除非特异性吸附，分别使用3％BSA和3％OVA封闭，其余步骤同上。每轮淘选噬菌体富集结果如下：
淘选次数
扩增滴度(pfu/mL)
洗脱液滴度(pfu/mL)
第一轮
1.94×10<sup>12</sup>
1.5×10<sup>7</sup>
第二轮
5.6×10<sup>12</sup>
1.36×10<sup>9</sup>
第三轮
6.9×10<sup>12</sup>
1.49×10<sup>9</sup>
2)阳性噬菌体克隆的鉴定：从第二轮和第三轮淘选后测定噬菌体滴度的平板上随机挑取10个克隆，进行噬菌体的扩增，采用酶联免疫吸附检测方法进行阳性噬菌体克隆的鉴定。具体方法为：首先，将灭活的鼠伤寒沙门氏菌用PBS(pH7.4)稀释至108CFU/mL，4℃包被过夜。第二天用PBST(10mM PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，加入300μL的3％脱脂奶粉，37℃封闭1小时；弃封闭液，PBST洗涤3次后，加入100μL噬菌体扩增液，以PBS作为阴性对照，37℃孵育1小时；加入1：5000倍稀释的HRP标记抗M13噬菌体二抗(Santa CruzBiotechnology)100μL，37℃孵育1小时；加入100μL TMB底物溶液，避光37℃显色15min；加入50μL终止液(2M H2SO4)终止反应；用酶标仪(Thermo Scientific Multiskan FC)测定450nm处的吸收值。选取OD450大于阴性对照2倍的噬菌体克隆为阳性克隆，共得到10株阳性克隆(附图1所示)。
实施例3：纳米抗体编码基因的测序及其氨基酸序列的确定
将10株阳性克隆进行DNA测序，DNA测序结果用Bioedit软件对测序结果进行分析，得到一种抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体ST-Nb9，确定抗体序列的框架区和互补决定区。
抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体ST-Nb9框架区FR1氨基酸序列如SEQ NO:1所示；
抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体ST-Nb9框架区FR2氨基酸序列如SEQ NO:2所示；
抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体ST-Nb9框架区FR3氨基酸序列如SEQ NO:3所示；
抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体ST-Nb9框架区FR4氨基酸序列如SEQ NO:4所示；
抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体ST-Nb9互补决定区CDR1氨基酸序列如SEQ NO:5所示；
抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体ST-Nb9互补决定区CDR2氨基酸序列如SEQ NO:6所示；
抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体ST-Nb9互补决定区CDR3氨基酸序列如SEQ NO:7所示；
抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体ST-Nb9的氨基酸序列如SEQ NO:7所示。
实施例4：纳米抗体的制备
提取ST-Nb9克隆的质粒，将重组表达载体转入大肠杆菌Top10’感受态中。从转化平板上挑一单菌落接种于2mL SB液体培养基中，37℃，250r/min振荡培养过夜，将过夜培养物按1：100接种量接种于200mL的SB/Amp培养基中，37℃，250r/min振荡培养；当培养物菌体浓度OD600达到0.6-0.8时，向培养物中加入终浓度为0.1mM的IPTG，37℃，250r/min振荡过夜培养；将培养物于4℃，8000rpm，离心15min收集菌体沉淀。称重离心后的细胞，用B-PER细胞裂解液将管中的沉淀进行裂解，每克菌体约加入4mL B-PER细胞裂解液，震荡混匀使沉淀溶解，于室温静置15-20min后，10000rpm离心30min取上清，将上清进行亲和层析纯化，即得表达的纳米抗体ST-Nb9。
实施例5：标准曲线的建立
采用双抗体夹心ELISA的方法进行灵敏度的鉴定，具体方法为：将ST-Nb9用PBS(pH7.4)稀释至5μg/mL，4℃包被过夜，第二天用PBST(10mM PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，加入300μL的3％脱脂奶粉，37℃封闭1小时；将鼠伤寒沙门氏菌从108cfu/mL以三倍梯度稀释至103cfu/mL，PBS做阴性对照，37℃孵育1小时；而后加入100μL稀释至4×1010pfu/mL的噬菌体展示检测抗体，37℃孵育1小时；加入1：5000稀释HRP标记的M13噬菌体二抗100μL，37℃孵育1小时；加入100μL TMB底物溶液，避光显色15min，测定OD450，绘制标准曲线(附图2所示)，线性范围为5×104-3×108CFU/mL，线性关系为R2＝0.99，最低检测限为5×104CFU/mL，表现出较好的灵敏度。
实施例6：抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体ST-Nb9的特异性分析及热稳定性检测
1)抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体ST-Nb9的特异性分析，具体方法为：用PBS(pH7.4)将灭活的鼠伤寒沙门氏菌稀释至108cfu/mL，同时将白色念珠菌(C.albicans)、弯曲杆菌(C.coli)、大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)、哈达尔沙门氏菌(S.Hadar)、伦敦沙门氏菌(S.London)和乙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi)八种常见食源性致病菌分别稀释至108cfu/mL，4℃包被过夜；用PBST(10mM PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，加入300μL的3％脱脂奶粉，37℃封闭1小时；用PBST(10mM PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，分别加入100μL抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体ST-Nb9，37℃孵育1小时；用PBST(10mM PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，加入HRP标记的抗HA抗体100μL，37℃孵育1小时；用PBST(10mM PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤6次后，加入100μL TMB底物溶液，避光显色15min，加入50μL 2M H2SO4终止液终止反应后，测定吸光度值OD450。结果见图3，ST-Nb9与白色念珠菌(C.albicans)、弯曲杆菌(C.coli)、大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)、哈达尔沙门氏菌(S.Hadar)、伦敦沙门氏菌(S.London)和乙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi)均无交叉反应，表明所淘选抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体ST-Nb9表现出较好的特异性。
2)抗鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体ST-Nb9的热稳定性检测：将鼠伤寒沙门氏菌用PBS(pH7.4)稀释至108CFU/mL，4℃包被过夜；第二天用PBST(10mM PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，加入300μL的3％脱脂奶粉，37℃封闭1小时；PBST(10mM PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次；将纳米抗体用PBS稀释至5μg/mL，一种单克隆抗体(实验室自制)以1：10000稀释，分别置于4，20，40，60，75，85，95℃水浴5min，恢复到室温后，再分别取100μL加入处理好的板孔中，37℃孵育1小时；加入1：5000稀释HRP标记的抗HA抗体100μL，37℃孵育1小时；加入100μL TMB底物溶液，避光显色15min，测定OD450。比较不同温度处理条件下的吸光度值与4℃下吸光度值的百分比，结果如图4所示，随着温度的升高，纳米抗体的结合百分比没有明显的下降，在95℃加热5min后性能依然稳定在75％，但单克隆抗体在60℃加热后有明显的下降，表明纳米抗体相较于单克隆抗体具有突出的热稳定性。
核苷酸序列表电子文件
<110>西北农林科技大学
<120>一种抗鼠伤寒沙门氏菌的纳米抗体及应用
<160>8
<210>1
<211>17
<212>PRT
<213>骆驼（Bactrian camel）
<220>抗鼠伤寒沙门氏菌的纳米抗体ST-Nb9的氨基酸序列框架区FR1
<400>1
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
<210>2
<211>16
<212> PRT
<213>骆驼（Bactrian camel）
<220>抗鼠伤寒沙门氏菌的纳米抗体ST-Nb9的氨基酸序列框架区FR2
<400>2
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile
<210>3
<211>37
<212>PRT
<213>骆驼（Bactrian camel）
<220>抗鼠伤寒沙门氏菌的纳米抗体ST-Nb9的氨基酸序列框架区FR3
<400>3
Glu Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Gly Ala Lys Asn Thr LeuAsn Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Pro Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala
<210>4
<211>10
<212>PRT
<213>骆驼（Bactrian camel）
<220>抗鼠伤寒沙门氏菌的纳米抗体ST-Nb9的氨基酸序列框架区FR4
<400>4
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
<210>5
<211>13
<212>PRT
<213>骆驼（Bactrian camel）
<220>抗鼠伤寒沙门氏菌的纳米抗体ST-Nb9的氨基酸序列互补决定区CRD1
<400>5
Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Thr Tyr Asn Met Ala
<210>6
<211>14
<212>PRT
<213>骆驼（Bactrian camel）
<220>抗鼠伤寒沙门氏菌的纳米抗体ST-Nb9的氨基酸序列互补决定区CRD2
<400>6
Arg Lys Asp Gly Ser Thr Ala Tyr Ala
<210>7
<211>20
<212>PRT
<213>骆驼（Bactrian camel）
<220>抗鼠伤寒沙门氏菌的纳米抗体ST-Nb9的氨基酸序列互补决定区CRD3
<400>7
Asp Arg Ser Trp Trp Leu Leu Ser Gly Pro Gln Asn Tyr Arg Tyr
<210>8
<211>127
<212>PRT
<213>骆驼（Bactrian camel）
<220>抗鼠伤寒沙门氏菌的纳米抗体ST-Nb9的氨基酸序列
<400>8
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu 15
Ser Cys Ala Val Ser Arg Ala Thr Asp Thr Arg Tyr Cys Met Gly 30
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val Ala Val 45
Ile Arg Lys Asp Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Glu Ser Val Arg Gly 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Gly Ala Lys Asn Thr Leu Asn Leu 75
Gln Met Asn Ser Leu Asn Pro Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys 90
Ala Ala Asp Arg Ser Trp Trp Leu Leu Ser Gly Pro Gln Asn Tyr 105
Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 117
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成
<220>PCR扩增VHH正向引物CALL001
<400>9
5’-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3’
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成
<220>PCR扩增VHH反向引物CALL002
<400>10
5’- GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’
<210>11
<211>27
<212>DNA
<213>人工合成
<220>PCR扩增VHH正向引物CAM-FOR
<400>11
5’-GGCCCAGGCGGCCGAGTCTGGRGGAGG-3’
<210>12
<211>31
<212>DNA
<213>人工合成
<220>PCR扩增VHH反向引物CAM-BACK
<400>12
5’- GGCCGGCCTGGCCGGAGACGGTGACCAGGGT-3’。