荧光化合物及其制备方法、及在交互印证定位肝肿瘤病灶组织中的应用
阅读说明：本技术 荧光化合物及其制备方法、及在交互印证定位肝肿瘤病灶组织中的应用 (Fluorescent compound, preparation method thereof and application thereof in interactive evidence positioning of liver tumor focus tissues ) 是由 陈笛笛 李民 毛慧灵 董宇平 于 2020-12-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物传感与成像技术领域,尤其是涉及一种荧光化合物及其制备方法、及在交互印证定位肝肿瘤病灶组织中的应用。本发明的荧光化合物A,能够在复杂的肝肿瘤微环境中对正常肝细胞产生选择性荧光点亮响应,而对肝肿瘤微环境中的肝肿瘤细胞不响应。本发明的荧光探针组合物,荧光化合物A和荧光化合物B能够分别点亮正常肝细胞和肝肿瘤细胞,实现交互印证定位肝肿瘤病灶组织中的正常肝细胞和肝肿瘤细胞,提高检测识别的精确度。(The invention relates to the technical field of biosensing and imaging, in particular to a fluorescent compound, a preparation method thereof and application thereof in interactive evidence positioning of liver tumor focus tissues. The fluorescent compound A disclosed by the invention can generate selective fluorescent lighting response on normal liver cells in a complex liver tumor microenvironment, and does not respond to liver tumor cells in the liver tumor microenvironment. According to the fluorescent probe composition, the fluorescent compound A and the fluorescent compound B can respectively lighten normal liver cells and liver tumor cells, so that the normal liver cells and liver tumor cells in liver tumor focus tissues can be positioned by interactive evidence, and the detection and identification accuracy is improved.)
技术领域
本发明涉及生物传感与成像技术领域，尤其是涉及一种荧光化合物及其制备方法、及在交互印证定位肝肿瘤病灶组织中的应用。
背景技术
无论是原发性的还是继发性的癌症，均已成为目前严重威胁全球人类健康的第二位重要疾病。其中，原发性肝癌是最常见、发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤之一，五年存活率仅为14％。由于肿瘤与肿瘤微环境是一个不可分割的整体，这为肿瘤诊断和治疗带来极大的困难。所以，对于医生来说，能否在简单快速精确定位肉眼不可见的肿瘤病灶区域成为关键因素。
目前多采用荧光探针的方式针对肿瘤病灶具有点亮荧光标记作用的方式实现成像识别等。但由于肿瘤微环境特殊且复杂，如果能在复杂的肿瘤微环境区分肿瘤病灶及正常组织，能够进一步提高定位精准性，势必可大大提高肝肿瘤诊断和治疗等的精确度，推动我国肝肿瘤研究的发展。(S.L.Topalian,J.M.Taube,R.A.Anders,D.M.Pardoll,Mechanism-driven biomarkers to guide immune checkpoint blockade in cancertherapy.Nat Rev Cancer,2016,16,275-287；J.D.Yang,P.Hainaut,G.J.Gores,A.Amadou,A.Plymoth,L.R.Roberts,A global view of hepatocellular carcinoma:trends,risk,prevention and management.Nat Rev Gastro hepat,2019,16,589-604；M.R.deGalarreta,A.Lujambio.Hepatocellular carcinoma:killing one bird with twostones.Gut,2019,68,gutjnl-2019-318649.)
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种荧光化合物，能够选择性对肝肿瘤微环境中的正常肝细胞产生荧光点亮响应，而对肝肿瘤微环境中的肝肿瘤细胞不响应。
本发明的第二目的在于提供荧光化合物的制备方法。
本发明的第三目的在于提供荧光探针组合物，能够交互印证定位肝肿瘤病灶组织中的肝肿瘤细胞和正常肝细胞，提高检测识别的精确度。
本发明的第四目的在于提供荧光探针组合物在交互印证定位肝肿瘤病灶组织中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
荧光化合物，具有如下结构通式A：
其中，R1和R2各自独立的选自烷基。
在本发明的
具体实施方式
中，R1和R2各自独立的选自碳数为1～6的烷基，优选为碳数为1～3的烷基。如可以为甲基、乙基、丙基或异丙基等。
在本发明的具体实施方式中，R1和R2为相同的基团。
在本发明的具体实施方式中，R1和R2为甲基。
本发明还提供了上述荧光化合物的制备方法，包括如下步骤：
(a)4-甲酰基苯硼酸和二苯乙炔在醋酸钯和碳酸银的作用下，于保护气氛下加热反应得到中间体；
(b)所述中间体与2-氰基乙酸烷基酯在有机碱的作用下反应。
具体的合成路线可以如下：
在实际操作中，步骤(a)中，加热反应的温度为90～120℃，加热反应的时间为0.5～2h；步骤(a)中，4-甲酰基苯硼酸和二苯乙炔的摩尔比为1﹕(0.8～1.2)，优选为1﹕1。
在本发明的具体实施方式中，步骤(a)中还包括溶剂，所述溶剂包括正丙醇和水。
在本发明的具体实施方式中，步骤(a)中，加热反应后，还包括后处理；所述后处理包括：将反应后的物料过滤，收集滤液并蒸干，得到粗产物，将所述粗产物进行柱层析分离，得到中间体。
在实际操作中，步骤(b)中，反应的温度为55～65℃，反应的时间为2～4h；步骤(a)中，中间体与2-氰基乙酸烷基酯的摩尔比为1﹕(2～3)，如1﹕2.4。所述有机碱包括哌啶。
在本发明的具体实施方式中，所述2-氰基乙酸烷基酯包括2-氰基乙酸甲酯和2-氰基乙酸乙酯中的任一种。
在本发明的具体实施方式中，步骤(b)中还包括溶剂，所述溶剂包括甲醇。
在本发明的具体实施方式中，步骤(b)中，反应后，还包括后处理；所述后处理包括：将反应后的物料过滤，收集固体，采用不良溶剂如正己烷洗涤所述固体，得到化合物A。
本发明还提供了荧光探针组合物，包括所述荧光化合物A和配合使用的荧光化合物B，荧光化合物B的结构通式如下：
其中，R3和R4各自独立的选自烷基。
在本发明的具体实施方式中，R3和R4各自独立的选自碳数为1～6的烷基，优选为碳数为1～3的烷基。如可以为甲基、乙基、丙基或异丙基等。
在本发明的具体实施方式中，R3和R4为相同的基团。
在本发明的具体实施方式中，R3和R4为甲基。
本发明还提供了一种非诊断和治疗目的的交互印证定位肝肿瘤细胞和正常肝细胞的方法，应用上述任意一种所述的荧光探针组合物。
在本发明的具体实施方式中，所述方法包括如下步骤：
采用含荧光化合物A的染色液和含荧光化合物B的染色液分别对待测样品进行染色处理后，于365～543nm的波长下进行荧光成像检测。
或者，在本发明的具体实施方式中，所述方法包括如下步骤：
采用含荧光化合物A和荧光化合物B的染色液对待测样品进行共同染色处理后，于365～543nm的波长下进行荧光成像检测。
在本发明的具体实施方式中，所述待测样品包括细胞或组织切片。其中，组织切片可以为经过冷冻处理的组织切片，或新鲜组织切片，或石蜡包埋处理的组织切片。
在本发明的具体实施方式中，所述染色处理的方法包括：溶解荧光化合物A和荧光化合物B得到染色液，将染色液加入待测样品中染色5～10min后，去除溶液并洗涤。
本发明还提供了上述荧光探针组合物在制备用于肝肿瘤病灶检测试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的荧光化合物，能够在复杂的肝肿瘤微环境中对正常肝细胞产生选择性荧光点亮响应，而对肝肿瘤微环境中的肝肿瘤细胞不响应；
(2)本发明的荧光探针组合物，荧光化合物A和荧光化合物B能够分别点亮正常肝细胞和肝肿瘤细胞，实现交互印证定位肝肿瘤病灶组织中的正常肝细胞和肝肿瘤细胞，提高检测识别的精确度；
(3)本发明的荧光探针组合物能够对肝肿瘤病灶实现快速精准识别，能够实时点亮肿瘤病灶组织中的正常肝细胞和肝肿瘤细胞，且相较于临床使用的苏木精和曙红染色方法操作更便捷，耗时短。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的荧光化合物B1在肝肿瘤细胞及正常肝细胞中的荧光成像图；
图2为本发明的荧光化合物A1在肝肿瘤细胞及正常肝细胞中的荧光成像图；
图3为本发明的荧光化合物A1和荧光化合物B1在冷冻组织切片中的荧光成像图；其中(A)为荧光化合物B1在切片中的荧光成像图，(B)为荧光化合物A1在切片中的荧光成像图。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
荧光化合物，具有如下结构通式A：
其中，R1和R2各自独立的选自烷基。
本发明的荧光化合物A，在同时含有肝肿瘤细胞和正常肝细胞的体系中，能够快速选择性识别定位正常肝细胞，且不受体系中其他成分的干扰。
在本发明的具体实施方式中，R1和R2各自独立的选自碳数为1～6的烷基，优选为碳数为1～3的烷基。
如在不同实施方式中，R1和R2可以各自独立的为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、异戊基、新戊基或己基等等，优选为甲基、乙基、丙基或异丙基。
在本发明的具体实施方式中，R1和R2为相同的基团。
在本发明的具体实施方式中，R1和R2为甲基。
本发明还提供了上述荧光化合物的制备方法，包括如下步骤：
(a)4-甲酰基苯硼酸和二苯乙炔在醋酸钯和碳酸银的作用下，于保护气氛下加热反应得到中间体；
(b)所述中间体与2-氰基乙酸烷基酯在有机碱的作用下反应。
在实际操作中，步骤(a)中，加热反应的温度为90～120℃，加热反应的时间为0.5～2h；步骤(a)中，4-甲酰基苯硼酸和二苯乙炔的摩尔比为1﹕(0.8～1.2)，优选为1﹕1。
在本发明的具体实施方式中，步骤(a)中还包括溶剂，所述溶剂包括正丙醇和水。
在本发明的具体实施方式中，步骤(a)中，加热反应后，还包括后处理；所述后处理包括：将反应后的物料过滤，收集滤液并蒸干，得到粗产物，将所述粗产物进行柱层析分离，得到中间体。
在实际操作中，步骤(b)中，反应的温度为55～65℃，反应的时间为2～4h；步骤(a)中，中间体与2-氰基乙酸烷基酯的摩尔比为1﹕(2～3)，如1﹕2.4。所述有机碱包括哌啶。
在本发明的具体实施方式中，所述2-氰基乙酸烷基酯包括2-氰基乙酸甲酯和2-氰基乙酸乙酯中的任一种。
在本发明的具体实施方式中，步骤(b)中还包括溶剂，所述溶剂包括甲醇。
在本发明的具体实施方式中，步骤(b)中，反应后，还包括后处理；所述后处理包括：将反应后的物料过滤，收集固体，采用不良溶剂如正己烷洗涤所述固体，得到化合物A。
本发明还提供了荧光探针组合物，包括所述荧光化合物A和配合使用的荧光化合物B，荧光化合物B的结构通式如下：
其中，R3和R4各自独立的选自烷基。
本发明的荧光探针化合物，采用荧光化合物A和荧光化合物B配合使用，二者可以混合使用，也可以配套使用。其中，荧光化合物A和荧光化合物B能够在无外靶向基团修饰的前提下，荧光化合物A选择性定位正常肝细胞，荧光化合物B选择性定位肝肿瘤细胞，可实现快速精准的从正常肝细胞中甄别与定位肝肿瘤细胞，从而精准定位肝肿瘤病灶组织区域，且毒副作用低、耗时短、成本低等。
在本发明的具体实施方式中，R3和R4各自独立的选自碳数为1～6的烷基，优选为碳数为1～3的烷基。
如在不同实施方式中，R1和R2可以各自独立的为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、异戊基、新戊基或己基等等，优选为甲基、乙基、丙基或异丙基。
在本发明的具体实施方式中，R3和R4为相同的基团。
在本发明的具体实施方式中，R3和R4为甲基。
本发明还提供了一种非诊断和治疗目的的交互印证定位肝肿瘤细胞和正常肝细胞的方法，应用上述任意一种所述的荧光探针组合物。
本发明的荧光探针组合物可用于定位待测体系中的肝肿瘤细胞和正常肝细胞，待测体系为肝组织体系，可以是肝肿瘤组织、肝硬化结节、非典型增生结节、肝腺瘤、正常肝组织、脂肪肝组织中的任一种或多种。
在本发明的具体实施方式中，所述肝肿瘤细胞包括人肝肿瘤细胞。进一步的，所述人肝肿瘤细胞包括HepG2、Hep3B、SMMC7721中的任一种或多种。所述正常肝细胞包括人正常肝细胞。进一步的，所述人正常肝细胞包括LO2和QSG7701中的任一种或两种。
在本发明的具体实施方式中，所述方法包括如下步骤：
采用含荧光化合物A的染色液和含荧光化合物B的染色液分别对待测样品进行染色处理后，于365～543nm的波长下进行荧光成像检测。
或者，在本发明的具体实施方式中，所述方法包括如下步骤：
采用含荧光化合物A和荧光化合物B的染色液对待测样品进行共同染色处理后，于365～543nm的波长下进行荧光成像检测。
如在不同实施方式中，所述波长可以为365nm、405nm、488nm、543nm等等。
在本发明的具体实施方式中，所述待测样品包括细胞或组织切片。其中，组织切片可以为经过冷冻处理的组织切片，或新鲜组织切片，或石蜡包埋处理的组织切片。
在本发明的具体实施方式中，所述染色处理的方法包括：溶解荧光化合物A和荧光化合物B得到染色液，将染色液加入待测样品中染色5～10min后，去除溶液并洗涤。
在本发明的具体实施方式中，采用有机溶剂溶解荧光化合物A和荧光化合物B。进一步的，所述有机溶剂包括DMSO。
在本发明的具体实施方式中，所述染色液中，所述荧光化合物A和所述荧光化合物B的浓度分别为1×10-8mol/L～1×10-4mol/L。
如在不同实施方式中，所述荧光化合物A和所述荧光化合物B的浓度可以分别为1×10-8mol/L、1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L、1×10-4mol/L等等，可根据实际需求亮度进行调节。本发明的荧光化合物A和荧光化合物B的荧光强度高，在较低的浓度下即可实现清晰成像。
在本发明的具体实施方式中，所述染色液的制备方法包括：采用有机溶剂溶解荧光化合物A和荧光化合物B后，采用稀释液进行稀释。进一步的，所述稀释液包括高糖DMEM培养基、1640培养基、生理盐水、磷酸盐缓冲液和灭菌水中的任一种或多种。
在本发明的具体实施方式中，所述有机溶剂与所述稀释液的体积比为1﹕(1～106)。有机溶剂的稀释液的比例可根据实际需求进行调整，在保证荧光化合物溶解的情况下，适当降低有机溶剂的用量，以保证低毒或无毒性。
本发明还提供了上述荧光探针组合物在制备用于肝肿瘤病灶检测试剂中的应用。
本发明的荧光探针组合物，能够对细胞或切片中的正常肝细胞和肝肿瘤细胞进行点亮，可以快速精准的从细胞或切片中甄别和定位肝肿瘤细胞，并为后续的肝肿瘤切除手术创面、肝肿瘤病灶的实时动态荧光成像的应用提供了基础。
本发明具体实施方式中采用的部分试剂和仪器信息可以如下：
高糖DMEM培养基：细胞培养级别，康宁(CORNING，美国)公司；
磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)：细胞培养级别，康宁(CORNING，美国)公司；
多聚甲醛：分析纯，国药集团化学试剂公司；
二甲基亚砜：细胞培养级别，康宁(CORNING，美国)公司；
激光共聚焦显微镜：TCS SP5，德国徕卡仪器有限公司；
细胞培养皿的直径为2.5cm。
在本发明的具体实施方式中，共培养的条件采用常规细胞培养条件，如可以为：在细胞培养箱中的培养，温度为37℃，CO2的体积分数为5％。
本发明具体实施方式中采用的荧光化合物B以荧光化合物B1为例，结构式如下：
其合成步骤如下：
(1)将2.00mmol的4-甲酰基苯硼酸、2.00mmol二苯乙炔、0.05mmol醋酸钯、2.00mmol碳酸银以及5mL正丙醇和水的混合溶剂加入到25mL的三口瓶中，通入氮气，在搅拌下，于95℃反应120min，将三口瓶中悬浊液加入离心管中离心15min后，上层清液通过减压抽滤除去催化剂，下层沉淀用二氯甲烷洗涤，再次离心后减压抽滤，得到澄清溶液。将抽滤后得到的滤液，通过薄层色谱层析，以二氯甲烷和石油醚的混合液作为洗脱剂，分离得到亮黄色的固体粉末；
(2)将0.1mmol步骤(1)所得到亮黄色的固体粉末加入到100mL两口圆底烧瓶中，加入110μL的2-氰基乙酸甲酯，加入20mL乙腈和0.03mL哌啶，在搅拌下于70℃反应3 h，蒸发除去溶剂后得到橙红色固体粉末粗产物，通过薄层色谱层析，以二氯甲烷和石油醚的混合液作为洗脱剂，得到橙红色固体粉末，通过结构表征即为化合物B1。
实施例1
本实施例提供了荧光化合物A1，其结构式如下：
所述荧光化合物A1的制备方法包括如下步骤：
(1)将2.00mmol的4-甲酰基苯硼酸、2.00mmol二苯乙炔、0.05mmol醋酸钯、2.00mmol碳酸银以及5mL正丙醇和水(v/v＝9﹕1)的混合溶剂加入到25mL的三口瓶中，通入氮气，在搅拌下，于95℃反应120min后，将三口瓶中悬浊液加入离心管中离心15min后，上层清液通过减压抽滤除去催化剂，下层沉淀用二氯甲烷洗涤，合并除去催化剂后的上层清液和洗涤液，再次离心后减压抽滤，得到澄清溶液。向得到的澄清溶液中加入适量无水硫酸钠，震荡静置除水10min，抽滤除去硫酸钠。将抽滤后得到的滤液，通过薄层色谱层析，以二氯甲烷和石油醚的混合液(v/v＝3﹕1)作为洗脱剂，分离得到亮黄色的固体粉末。
(2)称量0.1mmol步骤(1)所得到亮黄色的固体粉末加入到100mL两口圆底烧瓶中，加入110μL的2-氰基乙酸甲酯，加入20mL乙腈和0.03mL哌啶，在搅拌下于70℃反应3h后，蒸发除去溶剂后得到橙红色固体粉末粗产物，通过薄层色谱层析，以二氯甲烷和石油醚的混合液(v/v＝3:1)作为洗脱剂(收集Rf值约为0.3～0.8的部分)，得到橙红色固体粉末，即为化合物A1。
对制备得到的荧光化合物A1进行表征，数据如下：
核磁共振氢谱，1H NMR：(400MHz,CDCl3,δ):8.16(s,2H),7.73(s,2H),7.71(s,2H),7.203-7.039(m,14H),6.992-6.866(m,10H),3.910(s,6H).
核磁共振碳谱，13C-NMR(100MHz,CDCl3,δ):163.12,154.61,149.21,142.67,140.36,131.22,130.59,128.04,127.61,115.78,101.92,52.53.
上述结构表征结果表明制备得到的是荧光化合物A1。
荧光化合物A2、荧光化合物A3、荧光化合物A4的结构式分别如下：
荧光化合物A2、荧光化合物A3、荧光化合物A4的制备方法参考荧光化合物A1的制备方法，区别仅在于：将步骤(2)中的2-氰基乙酸甲酯分别替换为2-氰基乙酸乙酯、2-氰基乙酸异丙酯、2-氰基乙酸正丙酯。
实施例2
本实施例提供的荧光探针组合物包括荧光化合物A1和荧光化合物B1。
采用所述荧光探针组合物对肝肿瘤病灶进行交互印证定位的方法，包括如下步骤：
(1)将荧光化合物A1溶解于DMSO中配制成荧光化合物A1的浓度为1×10-2mol/L的溶液I1；用高糖DMEM培养基稀释溶液I1配制成荧光化合物A1的浓度为1×10-5mol/L的溶液I2。将荧光化合物B1溶解于DMSO中配制成荧光化合物B1的浓度为1×10-2mol/L的溶液II1；用高糖DMEM培养基稀释溶液II1配制成荧光化合物B1的浓度为1×10-5mol/L的溶液II2。
(2)用4％的多聚甲醛溶液分别使人肝肿瘤细胞系(HepG2 cell、Hep3B cell、SMMC7721 cell)及人正常肝细胞系(LO2 cell、QSG7701 cell)失活；向培养皿中加入1mL步骤(1)中制得的溶液II2共培养5min(同时细胞核用商业染核染料DAPI标记)后，除去溶液，用pH＝7.4的PBS洗涤2～3次，在培养皿中加入1mL的pH＝7.4的PBS，将细胞浸没，在激光共聚焦显微镜(激发波长为488nm)可以观察到当细胞失活后，仅肝肿瘤细胞HepG2 cell、Hep3B cell、SMMC7721 cell中有较强的绿色荧光，而正常细胞LO2 cell和QSG7701 cell中没有明显荧光，荧光成像图如图1所示。
(3)另取未染色的、用4％的多聚甲醛溶液分别使人肝肿瘤细胞系(HepG2 cell、Hep3B cell、SMMC7721 cell)及人正常肝细胞系(LO2 cell、QSG7701 cell)失活的细胞；向培养皿中加入1mL步骤(1)中制得的溶液I2共培养5min(同时细胞核用商业染核染料DAPI标记)后，除去溶液，用pH＝7.4的PBS洗涤2～3次，在培养皿中加入1mL的pH＝7.4的PBS，将细胞浸没，在激光共聚焦显微镜(激发波长为488nm)可以观察到仅正常细胞LO2 cell和QSG7701 cell中有较强的绿色荧光，而癌细胞HepG2 cell、Hep3B cell、SMMC7721 cell中无明显荧光标记，荧光成像图如图2所示。
实施例3
本实施例提供的荧光探针组合物包括荧光化合物A1和荧光化合物B1。
采用所述荧光探针组合物对肝肿瘤病灶进行交互印证定位的方法，包括如下步骤：
(1)将荧光化合物A1溶解于DMSO中配制成荧光化合物A1的浓度为1×10-4mol/L的溶液I3；用生理盐水稀释溶液I3配制成荧光化合物A1的浓度为1×10-8mol/L的溶液I4。将荧光化合物B1溶解于DMSO中配制成荧光化合物B1的浓度为1×10-4mol/L的溶液II3；用生理盐水稀释溶液II3配制成荧光化合物B1的浓度为1×10-8mol/L的溶液II4。
(2)用4％的多聚甲醛溶液分别使人肝肿瘤细胞系(HepG2 cell、Hep3B cell、SMMC7721 cell)及人正常肝细胞系(LO2 cell、QSG7701 cell)失活；向培养皿中加入1mL步骤(1)中制得的溶液II4共培养5min(同时细胞核用商业染核染料DAPI标记)后，除去溶液，用pH＝7.4的PBS洗涤2～3次，在培养皿中加入1mL的pH＝7.4的PBS，将细胞浸没，在激光共聚焦显微镜(激发波长为488nm)可以观察到当细胞失活后，仅肝肿瘤细胞HepG2 cell、Hep3B cell、SMMC7721 cell中有较强的绿色荧光，而正常细胞LO2 cell和QSG7701 cell中没有明显荧光。
(3)另取未染色的、用4％的多聚甲醛溶液分别使人肝肿瘤细胞系(HepG2 cell、Hep3B cell、SMMC7721 cell)及人正常肝细胞系(LO2 cell、QSG7701 cell)失活的细胞；向培养皿中加入1mL步骤(1)中制得的溶液I4共培养5min(同时细胞核用商业染核染料DAPI标记)后，除去溶液，用pH＝7.4的PBS洗涤2～3次，在培养皿中加入1mL的pH＝7.4的PBS，将细胞浸没，在激光共聚焦显微镜(激发波长为488nm)可以观察到仅正常细胞LO2 cell和QSG7701 cell中有较强的绿色荧光，而癌细胞HepG2 cell、Hep3B cell、SMMC7721 cell中无明显荧光标记。
实施例4
本实施例提供的荧光探针组合物包括荧光化合物A1和荧光化合物B1。
采用所述荧光探针组合物对肝肿瘤病灶进行交互印证定位的方法，包括如下步骤：
(1)将荧光化合物A1溶解于DMSO中配制成荧光化合物A1的浓度为1×10-3mol/L的溶液I5；用灭菌水稀释溶液I5配制成荧光化合物A1的浓度为1×10-6mol/L的溶液I6。将荧光化合物B1溶解于DMSO中配制成荧光化合物B1的浓度为1×10-3mol/L的溶液II5；用灭菌水稀释溶液II5配制成荧光化合物B1的浓度为1×10-6mol/L的溶液II6。
(2)用4％的多聚甲醛溶液分别使人肝肿瘤细胞系(HepG2 cell、Hep3B cell、SMMC7721 cell)及人正常肝细胞系(LO2 cell、QSG7701 cell)失活；向培养皿中加入1mL步骤(1)中制得的溶液II6共培养5min(同时细胞核用商业染核染料DAPI标记)后，除去溶液，用pH＝7.4的PBS洗涤2～3次，在培养皿中加入1mL的pH＝7.4的PBS，将细胞浸没，在激光共聚焦显微镜(激发波长为488nm)可以观察到当细胞失活后，仅肝肿瘤细胞HepG2 cell、Hep3B cell、SMMC7721 cell中有较强的绿色荧光，而正常细胞LO2 cell和QSG7701 cell中没有明显荧光。
(3)另取未染色的、用4％的多聚甲醛溶液分别使人肝肿瘤细胞系(HepG2 cell、Hep3B cell、SMMC7721 cell)及人正常肝细胞系(LO2 cell、QSG7701 cell)失活的细胞；向培养皿中加入1mL步骤(1)中制得的溶液I6共培养5min(同时细胞核用商业染核染料DAPI标记)后，除去溶液，用pH＝7.4的PBS洗涤2～3次，在培养皿中加入1mL的pH＝7.4的PBS，将细胞浸没，在激光共聚焦显微镜(激发波长为488nm)可以观察到仅正常细胞LO2 cell和QSG7701 cell中有较强的绿色荧光，而癌细胞HepG2 cell、Hep3B cell、SMMC7721 cell中无明显荧光标记。
实施例5
本实施例提供的荧光探针组合物包括荧光化合物A1和荧光化合物B1。
采用所述荧光探针组合物对肝肿瘤病灶进行交互印证定位的方法，包括如下步骤：
取一肝组织冷冻切片，加入5mL的4％多聚甲醛溶液处理，静置10min，用pH＝7.4的PBS冲洗3次，加入5mL实施例2中得到的溶液II2，染色5min移除溶液，用pH＝7.4的PBS冲洗3次，在激光共聚焦显微镜(激发波长为488nm)下可以观察到切片中肿瘤细胞区域呈现出较强的绿色荧光，如图3中的(A)所示。
另取一肝组织冷冻切片，加入5mL的4％多聚甲醛溶液处理，静置10min，用pH＝7.4的PBS冲洗3次，加入5mL实施例2中得到的溶液I2，染色5min后移除溶液，用pH＝7.4的PBS冲洗3次，激光共聚焦显微镜(激发波长为488nm)下可以观察到切片中非肿瘤细胞区域呈现出较强的绿色荧光，而肿瘤病灶区未呈现明显荧光，如图3中的(B)所示。
说明了，本发明的荧光探针组合物中，荧光化合物B1对正常肝细胞区域无明显荧光标记，且组织中血红细胞、血小板、白细胞、脂肪块等均对成像结果无明显干扰，其可用于肝肿瘤病灶组织的活检快速定位，为后续的新鲜肝组织切片成像提供了实验基础。而荧光化合物A1仅对肝占位(FNH)组织切片中病变(lesion)区域、邻近正常组织以及正常肝组织切片有特异性染色，而对肿瘤病灶区域无荧光反应，可作为辅助工具为后续肝肿瘤病灶组织的活检快速定位提供双重有效保障。
实施例6
本实施例提供的荧光探针组合物包括荧光化合物A1和荧光化合物B1。
采用所述荧光探针组合物对肝肿瘤病灶进行交互印证定位的方法，包括如下步骤：
取一新鲜肝组织切片，加入5mL的4％多聚甲醛溶液处理，静置10min，用生理盐水冲洗3次，加入8mL实施例3中得到的溶液II4，染色10min移除溶液，用生理盐水冲洗3次，在激光共聚焦显微镜(激发波长为488nm)下可以观察到切片中肿瘤细胞区域呈现出较强的绿色荧光，而对正常肝细胞区域无明显荧光标记，为后续的肝肿瘤切除手术创面、肝肿瘤病灶的实时动态荧光成像的应用提供了实验基础。
另取一新鲜肝组织切片，加入5mL的4％多聚甲醛溶液处理，静置10min，用生理盐水冲洗3次，加入8mL实施例3中得到的溶液I4，染色10min后移除溶液，用生理盐水冲洗3次，激光共聚焦显微镜(激发波长为488nm)下可以观察到切片中正常肝细胞区域呈现出较强的绿色荧光，而肿瘤病灶区未呈现明显荧光。说明了本发明的荧光化合物A1可以与荧光化合物B1配合使用，组成交互印证点亮型荧光探针以用于提高肝肿瘤切除手术创面、肝肿瘤病灶的实时动态荧光成像的精确度。
实施例7
本实施例提供的荧光探针组合物包括荧光化合物A1和荧光化合物B1。
采用所述荧光探针组合物对肝肿瘤病灶进行交互印证定位的方法，包括如下步骤：
取一石蜡包埋的肝组织切片，加入5mL的4％多聚甲醛溶液处理，静置10min，用灭菌水冲洗3次，加入8mL实施例4中得到的溶液II6，染色10min移除溶液，用灭菌水冲洗3次，在激光共聚焦显微镜(激发波长为488nm)下可以观察到切片中肿瘤细胞区域呈现出较强的绿色荧光，而对正常肝细胞区域无明显荧光标记。
另取一石蜡包埋的肝组织切片，加入5mL的4％多聚甲醛溶液处理，静置10min，用灭菌水冲洗3次，加入8mL实施例4中得到的溶液I6，染色10min后移除溶液，用灭菌水冲洗3次，激光共聚焦显微镜(激发波长为488nm)下可以观察到切片中正常肝细胞区域呈现出较强的绿色荧光，而肿瘤病灶区未呈现明显荧光。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：四环三萜类衍生物的合成及应用