低产乙醛啤酒酵母菌株的高效选育方法
阅读说明：本技术 低产乙醛啤酒酵母菌株的高效选育方法 (Efficient breeding method of low-yield acetaldehyde beer yeast strain ) 是由 徐楠 赵鑫锐 尹花 李江华 陈坚 余俊红 堵国成 孙可澄 侯晓平 于 2021-01-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种低产乙醛啤酒酵母的高效选育方法,属于菌株选育的技术领域。本发明通过对啤酒酵母菌株进行ARTP诱变处理,构建突变菌株库；利用乙醇-双硫仑抗性平板和高浓度乙醛筛选平板从突变菌株库中筛选得到生长优势菌株,并利用液体驯化培养基对生长优势菌株进行驯化,建立诱变-筛选-驯化的初筛菌株；对所得初筛菌株进行发酵培养,并以乙醇脱氢酶Ⅰ、Ⅱ和乙醛脱氢酶的酶活力变化为指标进行复筛,获得乙醛产量降低50％以上的低产乙醛啤酒酵母。本发明解决了目前对低产乙醛的啤酒工业酵母筛选难度大、效率低的问题。(The invention discloses a high-efficiency breeding method of low-yield acetaldehyde beer yeast, belonging to the technical field of strain breeding. According to the invention, an ARTP mutagenesis treatment is carried out on a beer yeast strain to construct a mutant strain library; screening the mutant strain library by using an ethanol-disulfiram resistance plate and a high-concentration acetaldehyde screening plate to obtain a growth dominant strain, domesticating the growth dominant strain by using a liquid domestication culture medium, and establishing a mutagenic-screening-domesticated primary screening strain; and carrying out fermentation culture on the obtained primary screening strain, and carrying out secondary screening by using the enzyme activity changes of the ethanol dehydrogenases I and II and the acetaldehyde dehydrogenase as indexes to obtain the low-yield acetaldehyde beer yeast with the acetaldehyde yield reduced by more than 50%. The invention solves the problems of high screening difficulty and low efficiency of the beer industrial yeast with low acetaldehyde yield at present.)
技术领域
本发明属于啤酒酿造技术领域，尤其涉及一种低产乙醛啤酒酵母菌株的高效选育方法。
背景技术
与其他酒精饮料相比，啤酒因其储藏过程中老化风味物质的积累，而具有较短的货架期。这些老化风味化合物主要由低风味阈值的醛类化合物所组成。啤酒灌装时，醛类化合物主要以结合态形式存在，含量在风味阈值之下；随储酒时间的延长，醛类化合物大量释放，啤酒中老化风味突出，风味稳定性下降。乙醛(CH3CHO)是啤酒中主要的老化醛类化合物，具有较高的挥发性和反应活性，直接影响了啤酒的风味和风味稳定性。
随着饮料工业的发展，啤酒生产企业维持酒体风味稳定、延长产品货架期的愿望更加迫切。因此，研究学者相继提出了很多控制乙醛含量的工艺措施，然而多数的工艺优化没有普遍适用性，同样的措施应用于不同的菌种和工艺条件下可能会出现不同甚至相反的结果。
而啤酒酵母从根本上决定了啤酒产品中风味物质乙醛的形成和积累。一方面，酵母自身代谢产生了乙醛等老化物质；另一方面啤酒酵母具有很好的还原活性，其本身可以还原发酵液中的乙醛。因此，选育性能优良的低产乙醛啤酒酵母菌株将成为有效提升啤酒风味稳定性、解决啤酒食品安全问题的途径之一。
迄今为止，研究者为了获得低产乙醛的实验和生产菌株采取了很多技术手段，主要包括传统育种手段、同源重组手段和酵母“基因自克隆技术”。鉴于啤酒酵母应用领域的特殊性，啤酒研究者和酿造者更加倾向于采用传统育种技术选育低产乙醛啤酒酵母菌株。然而采用传统育种技术获得所需表型的概率低，性状回复突变率高。因此，研究高效、稳定和安全的育种技术在构建低产乙醛的啤酒工业酵母中具有重要的实际应用价值。
发明内容
本发明提供了一种低产乙醛啤酒酵母菌株的高效选育方法，该方法解决了目前对低产乙醛的啤酒工业酵母筛选难度大、效率低的问题。
为了达到上述目的，本发明提供了一种低产乙醛啤酒酵母菌株的高效选育方法，其特征在于，包括以下步骤：
对啤酒酵母菌株进行ARTP诱变处理，构建突变菌株库；
利用乙醇-双硫仑抗性平板和高浓度乙醛筛选平板从突变菌株库中筛选得到生长优势菌株，并利用液体驯化培养基对生长优势菌株进行驯化，建立诱变-筛选-驯化的初筛菌株；
对所得初筛菌株进行发酵培养，并以乙醇脱氢酶Ⅰ、Ⅱ和乙醛脱氢酶的酶活力变化为指标进行复筛，得到复筛菌株，即低产乙醛啤酒酵母。
作为优选，所述对啤酒酵母菌株进行ARTP诱变处理具体为：
将培养至对数中期的菌体稀释至1×106个/mL，利用氦气离子束对酵母细胞进行ARTP诱变处理。
作为优选，所述ARTP诱变处理的条件为：
氦气流速15.0L/min、输入功率100W、处理距离2mm、处理温度＜40℃和诱变时间90s。
作为优选，所述建立诱变-筛选-驯化的初筛菌株具体为：
1)对突变菌株库中的啤酒酵母菌株进行划线培养，挑取单菌落于YPD培养基中生长，离心菌体，洗涤重悬，得到细胞悬浮液；
2)对细胞悬浮液进行ARTP诱变处理，得到诱变菌液；
3)将诱变菌液分别涂布于高浓度乙醛平板和乙醇-双硫仑平板上，进行恒温培养，挑取上述平板上的生长优势菌株分别于对应上述平板的驯化培养基中进行连续驯化；
4)分别吸取适量驯化菌液重复上述步骤2)-3)至少2-6轮，且提高每一轮平板的筛选浓度和驯化培养基浓度，将最终驯化菌液分别涂布于两种平板上，得到初筛菌株。
作为优选，所述步骤1)中，菌落的生长温度为25-35℃，培养时间为6-48h；
菌体离心后洗涤重悬于含有1-20％甘油的无菌生理盐水中，并将浓度稀释至1×104-1×108个/mL。
作为优选，所述步骤2)中，细胞悬浮液的取用量为1-20μL；
ARTP诱变处理条件为：氦气流速5-45L/min、输入功率70-120W、处理距离1-4mm、处理温度低于60℃和诱变时间30-180s。
作为优选，所述步骤3)中，所述诱变菌液的吸取量为5-200μL；
所述高浓度乙醛平板为含有0.1-10g/L乙醛的YPD培养基，所述乙醇-双硫仑平板为含有0-50g/L乙醇、0-5mg/L双硫仑的基础碳源培养基；
恒温的培养温度为20-40℃，培养时间为1-5d；
所述高浓度乙醛驯化培养基为含有0.1-10g/L乙醛的YPD培养基；
所述乙醇-双硫仑驯化培养基为含有0-50g/L乙醇、0-10mg/L双硫仑的基础碳源培养基；
驯化的驯化温度为20-40℃，驯化时间为1-5d。
作为优选，以乙醇脱氢酶Ⅰ、Ⅱ和乙醛脱氢酶的酶活力变化为指标，选择三种酶活力正突变幅度总和大于65％的初筛菌株作为复筛菌株。
作为优选，在得到复筛菌株后，还包括通过实验室摇瓶水平发酵对所得复筛菌株的风味物质进行测定的步骤。
作为优选，所得低产乙醛啤酒酵母的乙醛产量降低50％以上，且主体风味与最初进行筛选的啤酒酵母菌株无显著差异。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
本发明采用啤酒工业酵母作为出发菌株，经多轮ARTP诱变育种技术构建突变菌株库，利用乙醇-双硫仑抗性平板、高浓度乙醛筛选平板及其对应驯养液完成菌株的平板筛选及驯化，形成诱变-筛选-驯化的多轮初筛体系；同时以关键酶活性变化为低产乙醛复筛标准，通过实验室摇瓶水平的啤酒模拟酿造体系，最终获得乙醛降幅在50％以上的突变菌株，且突变菌株发酵液的主体风味与出发菌株无显著差异。本发明是对生产菌株的进一步优化和改进，具有应用于啤酒工业生产的潜能。
附图说明
图1为本发明实施例提供的诱变条件确立时菌株致死率与诱变时间的函数关系图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供了一种低产乙醛啤酒酵母菌株的高效选育方法，包括以下步骤：
对啤酒酵母菌株进行ARTP诱变处理，构建突变菌株库；
利用乙醇-双硫仑抗性平板和高浓度乙醛筛选平板从突变菌株库中筛选得到生长优势菌株，并利用液体驯化培养基对生长优势菌株进行驯化，建立诱变-筛选-驯化的初筛菌株；
对所得初筛菌株进行发酵培养，并以乙醇脱氢酶Ⅰ、Ⅱ和乙醛脱氢酶的酶活力变化为指标进行复筛，得到复筛菌株，即低产乙醛啤酒酵母。
在上述方案中，所述对啤酒酵母菌株进行ARTP诱变处理具体为：
将培养至对数中期的菌体以含有5％甘油的无菌生理盐水离心洗涤3次，稀释菌体量为1×106个/mL。取10μL菌悬液于无菌金属载片(8mm)，以氦气等离子束对酵母细胞进行诱变处理。
ARTP诱变处理条件：保持氦气流速QHe＝15.0L/min，输入功率100W，处理距离2mm，处理温度＜40℃，诱变时间为90s。将金属载片置于1mL的无菌生理盐水中，振荡洗涤。
可以理解的是，上述诱变处理时，在保持氦气流速QHe＝15.0L/min，输入功率100W，处理距离2mm，处理温度＜40℃前提下，为了获得最佳的诱变条件，设置处理时间为0、50、70、90、110和130s，将金属载片置于1mL的无菌生理盐水中，振荡洗涤。将稀释菌液涂布于YPD培养基，30℃培养48h，绘制致死率曲线，确定最佳照射时间。若致死率偏低，则无法对酿酒酵母进行有效改良；若致死率偏高，易造成菌株性能的大幅改变，从而影响成品啤酒的主体风味。因此保持菌株致死率介于80-90％，选择最佳诱变时间为90s，如图1所示。
在一优选实施例中，所述建立诱变-筛选-驯化的初筛菌株具体为：
1)对突变菌株库中的啤酒酵母菌株进行划线培养，挑取单菌落于YPD培养基中生长，离心菌体，洗涤重悬，得到细胞悬浮液；
2)对细胞悬浮液进行ARTP诱变处理，得到诱变菌液；
3)将诱变菌液分别涂布于高浓度乙醛平板和乙醇-双硫仑平板上，进行恒温培养，挑取上述平板上的生长优势菌株分别于对应上述平板的驯化培养基中进行连续驯化；
4)分别吸取适量驯化菌液重复上述步骤2)-3)至少2-6轮，且提高每一轮平板的筛选浓度和驯化培养基浓度，将最终驯化菌液分别涂布于两种平板上，得到初筛菌株。
在一优选实施例中，所述步骤1)中，菌落的生长温度为25-35℃，培养时间为6-48h；菌体离心后洗涤重悬于含有1-20％甘油的无菌生理盐水中，并将浓度稀释至1×104-1×108个/mL。
在一优选实施例中，所述步骤2)中，细胞悬浮液的取用量为1-20μL；
ARTP诱变处理条件为：氦气流速5-45L/min、输入功率70-120W、处理距离1-4mm、处理温度低于60℃和诱变时间30-180s。
在一优选实施例中，所述步骤3)中，所述诱变菌液的吸取量为5-200μL；
所述高浓度乙醛平板为含有0.1-10g/L乙醛的YPD培养基，所述乙醇-双硫仑平板为含有0-50g/L乙醇、0-5mg/L双硫仑的基础碳源培养基；
恒温的培养温度为20-40℃，培养时间为1-5d；
所述高浓度乙醛驯化培养基为含有0.1-10g/L乙醛的YPD培养基；
所述乙醇-双硫仑驯化培养基为含有0-50g/L乙醇、0-10mg/L双硫仑的基础碳源培养基；
驯化的驯化温度为20-40℃，驯化时间为1-5d。
在一优选实施例中，所述步骤3)中，生长优势菌株为生长速度快、单菌落形状规则、体积较大的突变菌株。
在一优选实施例中，所述步骤4)中，所述驯化菌液使用量为10-200μL；
每一轮平板的筛选浓度和驯化培养基浓度逐步提高，具体如表1-2所示，其中，高浓度乙醛平板中乙醛浓度分别为2.0、2.2、2.4、2.6、2.8g/L，乙醇-双硫仑平板中双硫仑浓度分别为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/L；高浓度乙醛驯化培养基中乙醛浓度分别为3.0、3.2、3.4、3.6、3.8g/L，乙醇-双硫仑驯化培养基中双硫仑浓度分别为2.0、2.1、2.2、2.3、2.4mg/L。
在一优选实施例中，对所得初筛菌株进行发酵培养，并以乙醇脱氢酶Ⅰ、Ⅱ和乙醛脱氢酶的酶活力变化为指标进行复筛具体为：
a)将初筛获得的突变菌株接种于微孔细胞培养板，发酵培养；
b)离心收集酵母细胞，洗涤悬浮；破碎细胞，离心取上清液待用；
c)乙醇脱氢酶Ⅰ的测定：添加适量的细胞浸出液和缓冲溶液于微孔细胞培养板，测定吸光值。
d)乙醇脱氢酶Ⅱ的测定：添加细胞浸出液和缓冲溶液于微孔细胞培养板，测定吸光值。
e)乙醛脱氢酶的测定：添加细胞浸出液和缓冲溶液于微孔细胞培养板，测定吸光值。
f)综合三种关键酶活力的正突变幅度，获得低产乙醛复筛菌株。
在一优选实施例中，在步骤a)中，所述微孔细胞培养板为96孔细胞培养板；菌体生长温度为25-35℃，培养时间为6-20h。
在一优选实施例中，在步骤b)中，以pH 6.0-10.0，浓度为0.01-0.5mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤、重悬菌体；
以超声破碎仪破碎细胞，破2-8s，停1-10s，共计2-10min；
所述细胞浸出液于0-10℃储藏备用。
在一优选实施例中，在步骤c)中，乙醇脱氢酶Ⅰ测定时：
所述细胞浸出液添加量为10-100μL，缓冲液添加量为80-300μL；
所述缓冲液中含有0.01-0.2mol/L甘氨酸、0.01-0.2mol/L氢氧化钾、0.0001-0.01mol/L NAD+、1×10-5-1×10-3mol/L乙醛，缓冲溶液pH为7.0-11.0；
以单池时间扫描，连续2-8min，记录200-500nm处的吸光值。
在一优选实施例中，在步骤d)中，乙醇脱氢酶Ⅱ测定时：
所述细胞浸出液添加量为10-100μL，缓冲液添加量为80-300μL；
所述缓冲液中含有0.01-0.2mol/L甘氨酸、0.01-0.2mol/L氢氧化钾、0.0001-0.01mol/L NADH、0.01-1mol/L乙醇，缓冲溶液pH为7.0-11.0；
以单池时间扫描，连续2-8min，记录200-500nm处的吸光值。
在一优选实施例中，在步骤e)中，乙醛脱氢酶测定时：
所述细胞浸出液添加量为1-20μL，缓冲液添加量为80-350μL；
所述缓冲液中含有0.05-0.25mol/L磷酸钾、0.0001-0.01mol/L NAD+、1×10-6-1×10-2mol/L二硫苏糖醇溶液、1×10-5-1×10-3mol/L乙醛，缓冲溶液pH为6.0-10.0；
以单池时间扫描，连续2-8min内，记录200-500nm处的吸光值。
在一优选实施例中，在步骤f)中，以乙醇脱氢酶Ⅰ、Ⅱ和乙醛脱氢酶的酶活力变化为指标，选择三种酶活力正突变幅度总和大于65％的初筛菌株作为复筛菌株。
在一优选实施例中，在得到复筛菌株后，还包括通过实验室摇瓶水平发酵对所得复筛菌株的风味物质进行测定的步骤。具体方法如下：
p)菌株变温扩培，静置取酵泥。接种于麦汁，密封。
q)静置培养一段时间，待糖度降低，前酵结束。
r)静置发酵一段时间，后酵结束。
s)利用顶空气相色谱法，检测发酵液中的乙醛等主体风味物质含量，内标为3-庚酮。
在一优选实施例中，在步骤p)中，接种量为1×104-1×108CFU/mL；
所述密封方式为发酵栓密封，加水液封。
在一优选实施例中，在步骤q)中，所述静置培养条件为5-20℃静置培养5-15d；
所述前酵结束的标志为糖度降低至3-8°Bx。
在一优选实施例中，在步骤r)中，所述静置培养条件为0-8℃，静置培养5-15d。
在一优选实施例中，在步骤s)中，所述主体风味物质包括乙醛、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、正丙醇、异丁醇和异戊醇；
所述3-庚酮的浓度为10-50mg/L。
在一优选实施例中，所得低产乙醛啤酒酵母的乙醛产量降低50％以上，且主体风味与最初进行筛选的啤酒酵母菌株无显著差异。
实施例1诱变条件的确立
将对数期的菌体离心洗涤并稀释。取10μL菌悬液于无菌金属载片(8mm)，以氦气等离子束对酵母细胞进行诱变处理。保持氦气流速QHe＝15.0L/min，输入功率100W，处理距离2mm，处理温度＜40℃。为了获得最佳的诱变条件，设置处理时间为0、50、70、90、110和130s，将金属载片置于1mL的无菌生理盐水中，振荡洗涤。将稀释菌液涂布于YPD培养基，30℃培养48h，绘制致死率曲线，确定最佳照射时间。若致死率偏低，则无法对酿酒酵母进行有效改良；若致死率偏高，易造成菌株性能的大幅改变，从而影响成品啤酒的主体风味。因此保持菌株致死率介于80-90％，选择最佳诱变时间为90s。
实施例2初筛选育流程及效果
吸取适量诱变菌株菌悬液涂布于乙醛浓度为2.0g/L的抗性平板，30℃培养72h。挑取生长优势菌株，置于含有3.0g/L乙醛的液体培养基中驯化，30℃培养48h。洗涤驯养菌株以进行下一轮诱变，菌体诱变-平板筛选-液体驯养的流程重复三次。
吸取适量诱变菌株菌悬液涂布于以乙醇为唯一碳源，双硫仑浓度为0.2mg/L的抗性平板，30℃培养96h。挑取生长优势菌株，置于含有10g/L乙醇，2.0mg/L双硫仑的液体培养基中驯化，30℃培养72h。洗涤驯养菌株以进行下一轮诱变，菌体诱变-平板筛选-液体驯养的流程重复三次。
表1不同轮次筛选平板中的突变菌株数
注：菌落数以如下符号表示：++++(≥50)、+++(15.50个)、++(5-15个)、+(0-5个)、-(无)。
表2不同轮次驯养液的OD600
注：菌液吸光值OD600以如下符号表示：++++(≥6.0)、+++(2.0-6.0)、++(0.5-2.0)、+(0-0.5)、-(无)。
结果表明，三轮筛选后，突变菌株可在乙醛浓度为2.6g/L的抗性平板和3.6g/L的驯化溶液中生长。突变菌株可在双硫仑浓度为0.4mg/L的抗性平板和2.2mg/L的驯化溶液中生长。将第三轮驯养菌液涂布于筛选平板，共获得20株低产乙醛初筛菌株。
实施例3乙醛代谢关键酶活力的筛选
关键酶活力测定：分别测定了出发菌株及初筛菌株的乙醇脱氢酶I、II和乙醛脱氢酶三种关键酶活力，以三种酶活正突变幅度总和作为复筛指标。离心收集酵母细胞，用磷酸盐缓冲液(pH 8.0，浓度为0.05mol/L)洗涤重悬，超声破碎细胞(破4s停5s，共5min)，离心获得浸提液，4℃储藏备用。
乙醇脱氢酶Ⅰ：选用250μL酶活反应体系(0.05mol/L甘氨酸-氢氧化钾缓冲溶液(pH9.0)，0.001mol/L NAD+，1×10-4mol/L乙醛溶液)加入96孔板中。以乙醛为反应底物，添加细胞浸出液50μL。紫外分光光度采用单池时间扫描，连续5min内，记录340nm处吸光度值。
乙醇脱氢酶Ⅱ：选用250μL酶活反应体系(0.05mol/L甘氨酸-氢氧化钾缓冲溶液(pH 9.0)缓冲液，0.001mol/L NADH，0.1mol/L乙醇溶液)加入96孔板中。以乙醇为反应底物，添加细胞浸出液50μL。紫外分光光度采用单池时间扫描，连续5min内，记录340nm处吸光度值。
乙醛脱氢酶：选用300μL的酶活反应体系(0.15mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.5)，0.001mol/L NAD+，5×10-4mol/L二硫苏糖醇溶液，1×10-4mol/L乙醛溶液)加入比色皿中。以乙醛为反应底物，添加细胞浸出液10μL。紫外分光光度采用单池时间扫描，连续5min内，记录340nm处吸光度值。
340nm下NADH的吸光度值增加0.001为一个活力单位(U)。本实施例中，酶活性以总活力值除以相应的酵母泥质量表示(单位U/mg)，对初筛所得的20株酵母进行关键酶活的测定，以酶活性变化率为筛选指标。
表3关键酶活测定结果
初筛菌株关键酶活性及变化率
结果表明，初筛菌株的多种关键酶活性正突变率均达70％以上，以三种酶活正突变幅度总和高于65％的初筛菌株作为复筛菌株，共筛得3株复筛菌株。
实施例4麦汁培养基的制备
45℃时，料水比为1∶4加水投料。升温至48℃，保温30min；升温至65℃，保温40min；升温至72℃，保温10min；升温至78℃，保温10min，糖化结束。趁热过滤，煮沸1h，添加酒花(0.25‰)。调节浓度至12°P，得到澄清麦汁。
实施例5实验室摇瓶水平发酵验证
从平板上分别挑取上述3株复筛菌株的单菌落接入1mL麦汁培养基中，进行种子培养，25℃，220rpm培养12h。将上述1mL菌液转接入对应的9mL麦汁培养基中，20℃，220rpm培养12h。再将10mL菌液转接入对应的90mL麦汁培养基中，15℃，220rpm培养12h。静置取酵泥，接种于麦汁(1×106CFU/mL)。扣上发酵栓，液封。12℃静置培养8d，糖度为4°Bx左右时，前酵结束。4℃静置发酵7d，发酵成熟，后酵结束。
实施例6乙醛等主体风味物质的测定
取4.5mL啤酒发酵液，加入0.5mL 300mg/L 3-庚酮，采用顶空气相色谱仪进行测定。顶空进样器平衡温度：70℃，平衡时间：30min。传输线温度：130℃，进样时间：0.04min，进样口温度：200℃，检测器温度：250℃。色谱柱初始温度：40℃，以10℃/min程序升温至180℃。柱流量：1.2mL/min，N2流量：30mL/min，H2流量：47mL/min，空气流量：400mL/min。
表4发酵结束时酒样中的主要风味指标/(mg/L)
结果表明：突变菌株发酵液中乙醛含量均降低50％以上，且主体风味与出发菌株无显著差异。