转基因水稻mfb-MH3301的外源插入片段全序列及其旁侧序列
阅读说明：本技术 转基因水稻mfb-MH3301的外源插入片段全序列及其旁侧序列 (Complete sequence of exogenous insertion fragment of transgenic rice mfb-MH3301 and flanking sequence thereof ) 是由 苗朝华 董美 高进 宛煜嵩 刘卫晓 王迪 梅英婷 王�锋 金芜军 于 2020-12-16 设计创作，主要内容包括：本发明在专利CN103667476A的基础上公开了转基因水稻mfb-MH3301的外源插入片段全序列及其旁侧序列。本发明通过hiTAIL-PCR和LA-PCR扩增的方法获得外源插入片段和水稻序列连接区的3’端旁侧序列,其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；本发明进一步公开了外源插入片段全序列,其核苷酸为SEQ ID No.2所示；本发明提供的分子特征为转基因水稻mfb-MH3301及其衍生品种检测方法的建立提供了基础。(The invention discloses a complete sequence of an exogenous insertion fragment of transgenic rice mfb-MH3301 and a flanking sequence thereof on the basis of a patent CN 103667476A. The invention obtains the flanking sequence of the 3' end of the connecting region of the exogenous insert fragment and the rice sequence by means of hitAIL-PCR and LA-PCR amplification, and the nucleotide sequence is shown in SEQ ID No. 1; the invention further discloses a complete sequence of the exogenous insertion fragment, and the nucleotide of the complete sequence is shown in SEQ ID No. 2; the molecular characteristics provided by the invention provide a foundation for establishing a detection method of the transgenic rice mfb-MH3301 and derived varieties thereof.)
技术领域
本发明涉及转基因水稻的侧翼序列，尤其涉及转基因水稻及其旁侧序列，属于转基因水稻分子特征检测领域。
背景技术
自从1996年第一个转基因产品获得批准，转基因技术的应用呈指数增加，转基因作物进入市场的数量持续增长。国际农业生物技术组织(ISAAA)报道， 2014年28个种植生物技术作物国家的种植面积达1.815亿公顷。随着转基因技术在发展和应用，已经有多个转基因水稻品系进行了环境释放，并申请商业化种植。
转基因植物的外源插入片段的旁侧序列是转基因植物品系最重要的分子特征之一，因此，外源插入片段的旁侧序列是建立转基因植物品系特异性检测方法的重要技术资料。确定转基因生物的外源插入片段全序列、插入位点、旁侧序列等信息，可以为转基因生物的安全评价提供分子特征方面的依据，也是转化体之间进行比较研究，定性定量检测方法建立的基础。
发明内容
发明的目的之一是是获取转基因水稻mfb-MH3301外源插入片段和水稻序列连接区的3’端旁侧序列；
本发明的目的之二获取转基因水稻mfb-MH3301外源插入片段全序列；
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
根据专利CN103667476A中提供的序列信息，外源插入片段位于水稻9 号染色体上，在此段染色体序列上设计嵌套特异引物，利用hiTAIL-PCR和 LA-PCR的方法向5’端未知序列步移；以专利CN103667476A中提供的序列信息，在序列末端设计嵌套特异引物，利用hiTAIL-PCR和LA-PCR的方法向 3’端未知序列步移；最终两个方向获得的序列重叠，得到3’端旁侧序列及外源插入片段全序列；利用LA-PCR扩增技术，进一步验证外源插入片段及其在染色体上位置的正确性。
附图说明
图1 3’端hiTAIL-PCR扩增结果：1，3，5，7，为第二轮扩增产物；2， 4，6，8为第三轮扩增产物。
图2 3’端旁侧序列验证扩增结果：1、mfb-MH3301；2、明恢86。
图3长片段扩增验证结果：1，3，5、明恢86；2，4，6、mfb-MH3301。
具体实施方式
实施例1转基因水稻mfb-MH3301外源插入片段和水稻序列连接区的3’端旁侧序列的获得
一、实验材料
1、植物材料：转基因水稻mfb-MH3301，明恢86
2、酶与试剂
Takara的Ex TaqTMVersion 2.0plus dye和LA TaqTMVersion 2.0plus dye，天根生化科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒，引物由上海生工合成，BIOWEST公司的琼脂糖。
3、实验仪器
分光光度计：Thermo ND-1000；
离心机：Thermo Bioguge Primo R；
PCR仪：ABI Veriti；
凝胶成像仪：BioRad T2A；
其他仪器包括水浴锅、精密天平、通风柜、生物安全柜、电泳仪等。
二、实验方法
1.水稻DNA提取与检测
采用植物基因组DNA提取试剂盒DP305(天根生化科技有限公司)进行植物材料DNA提取和纯化，提取方法如下：
1)取200mg水稻粉末样品；
2)加入800μL 65℃预热的GP1缓冲液，迅速颠倒混匀，将离心管放在65℃水浴1h，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。
3)加入等体积酚：氯仿(1:1)，充分混匀，12000rpm离心10min。
4)转移上清至一新离心管，加入等体积氯仿，充分混匀，12000rpm离心10min。
5)取上清，加入等体积GP2，充分混匀。
6)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃掉废液(吸附柱容积700μL，可分次加入离心)。
7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
9)重复步骤8。
10)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3至于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加入 60μL 0.1×TE缓冲液，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
采用紫外分光光度计检测DNA浓度与纯度时，DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260/OD280比值应为1.7-1.9。
2.3’端旁侧序列的扩增
根据专利CN103667476A中提供的序列信息，得到5’端旁侧序列2000bp，该序列包括水稻基因组序列，位于水稻第9号染色体(GeneBank ID:NC-008402.2)的7709771-7710270位，其核苷酸序列与1-500位的核苷酸序列完全相同，因而在7710270位之后的核苷酸序列上设计嵌套特异引物，与简并引物进行三轮扩增，引物序列见表1。
表1 3’端旁侧序列的获得所用引物
表2 hiTAIL-PCR反应体系
表3 hi TAIL-PCR扩增程序
3.PCR产物测定
第二轮和第三轮PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析(图1)，挑选适合的第三轮PCR扩增产物用于序列测定。
4.3’端旁侧序列验证
在上述PCR产物测序结果上设计上游引物，在水稻第9号染色体7710270 位之后的核苷酸序列上设计下游引物，进行PCR扩增并测序。PCR反应体系为：总体积为25.0μL，其中，Ex Taq Mix缓冲液12.5μL，10μmol/L的上下游引物各1μL，25ng/μL DNA模板2μL，用去离子水补至25μL。PCR扩增的条件为：94℃变性5min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃延伸7min。电泳图见附图2。
3和4测序结果拼接构成完整的3’端旁侧序列，其核苷酸序列如序列表 SEQ IDNo.1所示。
实施例2转基因水稻mfb-MH3301外源插入片段全序列的获得
一、实验材料
同实施例1
二、实验方法
1.水稻DNA提取与检测
同实施例1
2.外源插入片段全序列的扩增
根据专利CN103667476A中提供的转化载体pCDMARUBb-Hyg的T-DNA 区域结构示意图，进行构建特异性实验，测序，并与已知序列进行拼接，得到5’-3’端部分序列，绘制构建线性如下，所用引物序列见表4。
表4构建特异性实验所用引物
在此拼接序列的基础上和本专利中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列设计嵌套特异引物，结合简并引物，从两个方向进行多次hiTAIL-PCR和LA-PCR 扩增，最终两个方向获得的序列重叠，得到外源插入片段全序列，所用引物序列见表5。
LA-PCR反应体系为：总体积为25.0μL，其中，LA Taq Mix缓冲液12.5μL， 10μmol/L的上下游引物各1μL，25ng/μL DNA模板2μL，用去离子水补至 25μL。PCR扩增的条件为：94℃变性5min；94℃，30s，66℃，1kb/min，30 个循环；72℃延伸10min。
表5外源插入片段全序列的扩增
3.全部测序结果：全部的连接区序列包括外源插入片段和两侧的水稻染色体序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2，绘制构建线性如图。
4.长片段扩增验证获得的整合结构
设计长片段扩增引物，对获得的整合结构进行验证。所用引物序列见表，扩增结果见图3。
表6全序列验证引物
。
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 转基因水稻mfb-MH3301的外源插入片段全序列及其旁侧序列
<141> 2020-12-10
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1898
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tactttgcca tctttcacaa agatgttgct gtctcccagg tcgccgtggg aaaagacaag 60
ttcctcttcg ggcttttccg tctttaaaaa atcatacagc tcgcgcggat ctttaaatgg 120
agtgtcttct tcccagtttt cgcaatccac atcggccaga tcgttattca gtaagtaatc 180
caattcggct aagcggctgt ctaagctatt cgtataggga caatccgata tgtcgatgga 240
gtgaaagagc ctgatgcact ccgcatacag ctcgataatc ttttcagggc tttgttcatc 300
ttcatactct tccgagcaaa ggacgccatc ggcctcactc atgagcagat tgctccagcc 360
atcatgccgt tcaaagtgca ggacctttgg aacaggcagc tttccttcca gccatagcat 420
catgtccttt tcccgttcca catcataggt ggtcccttta taccggctgt ccgtcatttt 480
taaatatagg ttttcatttt ctcccaccag cttatatacc ttagcaggag acattccttc 540
cgtatctttt acgcagcggt atttttcgat cagttttttc aattccggtg atattctcat 600
tttagccatt tattatttcc ttcctctttt ctacagtatt taaagatacc ccaagaagct 660
aattataaca agacgaactc caattcactg ttccttgcat tctaaaacct taaataccag 720
aaaacagctt tttcaaagtt gttttcaaag ttggcgtata acatagtatc gacggagccg 780
attttgaaac cggtgatcac aggcagcaac gctctgtcat cgttacaatc aacatgctac 840
cctccgcgag atcatccgtg tttcaaaccc ggcagcttag ttgccgttct tccgaatagc 900
atcggtaaca tgagcaaagt ctgccgcctt acaacggctc tcccgctgac gccgtcccgg 960
actgatgggc tgcctgtatc gagtggtgat tttgtgccga gctgccggtc ggggagctgt 1020
tggctgcctg ttctgttgcc taggcacttt gggaaactca tgcttccaag agagaaaatt 1080
gaaatcaaca tccatggttt cgttaagagc atggcagact tcttttcgga ttttctcatg 1140
acgcttcact ggatcctgat caccgccttc actggtatct cgtcgagaat ccagaatgca 1200
gagcttctta tcattcatgt tgaaagcata tagagtccag tggccatcag atgatacagg 1260
gattaatacc tatatatata tacacacatt tcagcaaaaa aaaaacaatg ttcagattca 1320
atttggtaat ttcctggttg cattttgtaa cttaaatttg atcgacagac caattggatg 1380
acaagagatt agcgagagtt ttttcagttc tacccaattt ggatagaaat agaaaaggat 1440
cataccagat gtgaacctga aggatcatac atagtagaca aacgggaata ctcgttcctc 1500
agattgttgg gatcattgat atattgctgt ggaacaagga acaaaaatag ttgttattat 1560
gacactagga gaagagtaga actaggaatt atatgccgcc aacaacatcc caaggcgcac 1620
tcacgcaaac ttaccttcca atttgaatca acataatgcc tccaacctag acattttgtg 1680
tttttaaaaa tttcagcatc ctgtcttgcc ataattctaa cagccaagtc catgcaattt 1740
atacccatga ctccttcagg ttttattgtt tcctggatat ctacaagctt taaattgatc 1800
ggcaggttgc ctgataccca aacagacctg caattcaatc aataataagg ctggtcatga 1860
ctgcagtaac aaaactgatt gacttatgac aaagctaa 1898
<210> 2
<211> 26002
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
taggcaagac gaaaactata tcattagagc tgggccaatc atatcccaaa caaggtctta 60
ttggcatata tagtcggaaa actatgtatt taaaagttca tgtgtcctat aacaaaacac 120
aaaagaaaat gcaaactctg atgtgtctaa ccagggagct ttttgatcaa ctcagagaca 180
ttagtaggca ggactgaatg atcatccaaa ctggagagta tgtatgctag aaagttcttc 240
cgcaactcct ttgtttccta acaagatgat gcatatacaa aattaatgac gataatatat 300
tgaatatgta ttccaatcaa aattaactct ccaggaatta tttcttacag ttgaaaacca 360
ccgaatcagt cgatgaccat cccataatcg cataaaattg aatacaaaga atccacagtc 420
acaactagaa ataaatcata gggaaaaatg agttgatcac ttatcatgca gtaaaacata 480
tacccataat aaagacggga gatatattgt ggtgtaaaca aattgacgct tagacaactt 540
aataacacat tgcggacgtt tttaatgtac tgaattaacg ccgaattaat tcgggggatc 600
tggattttag tactggattt tggttttagg aattagaaat tttattgata gaagtatttt 660
acaaatacaa atacatacta agggtttctt atatgctcaa cacatgagcg aaaccctata 720
ggaaccctaa ttcccttatc tgggaactac tcacacatta ttatggagaa actcgacggt 780
atcgataagc ttgatccatg cctcacatgt taatgtacta ccaatggagg gcttccatgc 840
ctcacatgtt catgtacaca tttatgatta ggaaactttt taatatattt tatagatttc 900
ttatccatca tataaaaata cataattaat catacgattt tggagataca tattctgacg 960
tatcaaattc taattaaatt ttaaaatatt ttagtgacgt atcaaattct aattaaattt 1020
taaaatattt tagagacgta ttttcgtaac aatttaaaat gtatattata gatcacattc 1080
ataggtcatt ttataattta aaatattatg gagatgcatc ttcgtttatt ttacggagat 1140
atattttcgt aatttatcat aatagaattg ttcatgctat attttgttta tgtttgctca 1200
gatgaagatt taaaccttac aagcaatgtg caaaaaatga cgtacataaa tttagatggt 1260
ccaaaaatgt tataaataaa agatcaagaa gtgtcaaaaa aagtcaaaaa caacgataga 1320
gtagtataat gtcaaaataa aataaaatcc atgacactac tactattata tattaatgca 1380
ctaatgtgta tgtctaacta catcgcctct gcctcctctg tcagttatgt ctcgtaggcc 1440
atcaatcccc cgtcctccga cgttgtctcc ggtacatcaa tgtcccatgt gcctacgtca 1500
tgatggcatt taggacatgt ctcacatcag ccagatcagc aagatacatt tgtcaatgtc 1560
tatctacgca atctccacaa tgcgacgaca tataggcaag acatcctcaa cataatttag 1620
ttgtgcatgc ttctcctcta gtatctcccg atgagttgat cgaattaatt cctgcagccc 1680
ttggcaagct gctctagcca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt 1740
aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta 1800
atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta 1860
tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gacatgatta 1920
cgaattcgag ctcggtaccc agcttctaga gatctagtaa catagatgac accgcgcgcg 1980
ataatttatc ctagtttgcg cgctatattt tgttttctat cgcgtattaa atgtataatt 2040
gcgggactct aatcataaaa acccatctca taaataacgt catgcattac atgttaatta 2100
ttacatgctt aacgtaattc aacagaaatt atatgataat catcgcaaga ccggcaacag 2160
gattcaatct taagaaactt tattgccaaa tgtttgaacg atctgcaggt cggggtaccg 2220
aattctcagt actcagcctc gaaggtaact tcggcaggca caaactcaat acggtcaatg 2280
tacacttcat tgccagaatt gaacacatga gcgctaaggg tgaaaacgct tgatccgtta 2340
gagaagttga aaggagtagt gaaaccgacg gttctgaagc tgccggattg caagttgctg 2400
ccgcttgaca tggttgcgga gaagttaccc tgattgatag gccttccgtc gatggaggtg 2460
tggaattgca agttagtggt agatgcgtaa cgaatcctga cacgatatct ttgagaaagt 2520
ggtgcagtga tgttaactct gagggtgcta atctggccag gagaagttct tctaagaata 2580
tcacctcctg tgaagcctgg tcctttcacg acagaagttc cagatccaag gttagtagac 2640
ttggtcaatg ggatttgggt gatttgagag gaaggaatga tattgttgaa ctcagcacta 2700
cgatgaatcc atgagaacat aggagctctg atgatgctca cggaactgtt gctgaatccg 2760
gaacggaaca tggacacgtg gctcaacctg tgggagaatc cttgcctggg tggcacattg 2820
ttgttctgtg gtgggatttc gtccaaggaa tcaacggttc cgctctttct gtaaacagcg 2880
gatggcaagt tagaagaggt tccataggcg aactctgttc cgtcaagaac ggaaagttgc 2940
tggttgttga taccgatatt gaagggtctt ctgtacaagg tggaagacaa ggttctgtag 3000
acaccctgac ctagttgagc aacgatacgt tgttgtggag cggcgtttcc catagttcca 3060
tagagaggaa aggtaaactc gggcccgctg aatccaactg gagaggccat gatctggtgt 3120
ccagaccagt aatactctcc tctgtgagca tcggtgtaga tagttatgct gttcaagatg 3180
tccatcaagt gtgggctcct gatggagcct tcgatacctt gggcagaacc acggaagcta 3240
ccgtcgaagt tctcaagaac tgggttagta tagatttctc tggtaagttg ggacactgta 3300
cggatagggt aggttctgga gtcatagttc gggaagagag acacaatgtc caaaactgtg 3360
agggtcaatt ctctcctgaa ctggttgtat ctaatccaat ctctagaatc aggaccccag 3420
acacgctcca agccagtgtt gtaccaacga acagcgtggt cggtgtagtt tccaatcagc 3480
ctagtaaggt cgttgtaacg gctattgatg gttgcagcat cgaatcccca cctttgccca 3540
aacacgctaa cgtctcgaag cacgctgagg tgaagattag ctgcttgaac gtacacggac 3600
aagagaggaa cttggtagtt ctggactgcg aacaatggga tagctgtggt caaggcgctg 3660
ttcatgtcgt tgaattgaat acgcatttcc tcgcggagag ctgggttagt aggatcggct 3720
tcccactctc tgaagctctc tgcatagatt tggtagagat tgctcaatcc ttccaaccta 3780
gagatggcct ggttcctggc gaactcttcg atcctctggt tgatcaactg ctcaatttgc 3840
accaggaatg catcccattg agatggacca aagatacccc agatgatgtc aactagtccg 3900
agaacgaacc cagcacctgg cacgaactcg ctgagcagaa actgtgtcaa ggacaaggag 3960
atgtcgatgg gagtgtaacc ggtttcaatg cgttctccac caagtacttc aacttctggg 4020
ttactcaagc agttgtatgg aatgcattcg ttgatgtttg ggttgttgtc catggatcct 4080
ctagagtcga cctgcagaag taacaccaaa caacagggtg agcatcgaca aaagaaacag 4140
taccaagcaa ataaatagcg tatgaaggca gggctaaaaa aatccacata tagctgctgc 4200
atatgccatc atccaagtat atcaagatca aaataattat aaaacatact tgtttattat 4260
aatagatagg tactcaaggt tagagcatat gaatagatgc tgcatatgcc atcatgtata 4320
tgcatcagta aaacccacat caacatgtat acctatccta gatcgatatt tccatccatc 4380
ttaaactcgt aactatgaag atgtatgaca cacacataca gttccaaaat taataaatac 4440
accaggtagt ttgaaacagt attctactcc gatctagaac gaatgaacga ccgcccaacc 4500
acaccacatc atcacaacca agcgaacaaa aagcatctct gtatatgcat cagtaaaacc 4560
cgcatcaaca tgtataccta tcctagatcg atatttccat ccatcatctt caattcgtaa 4620
ctatgaatat gtatggcaca cacatacaga tccaaaatta ataaatccac caggtagttt 4680
gaaacagaat ttctactccg atctagaacg accgcccaac cagaccacat catcacaacc 4740
aagacaaaaa aaagcatgaa aagatgaccc gacaaacaag tgcacggcat atattgaaat 4800
aaaggaaaag ggcaaaccaa accctatgca acgaaacaaa aaaaatcatg aaatcgatcc 4860
cgtctgcgga acggctagag ccatcccagg attccccaaa gagaaacact ggcaagttag 4920
caatcagaac gtgtctgacg tacaggtcgc atccgtgtac gaacgctagc agcacggatc 4980
taacacaaac acggatctaa cacaaacatg aacagaagta gaactaccgg gccctaacca 5040
tggaccggaa cgccgatcta gagaaggtag agaggggggg ggggggagga cgagcggcgt 5100
accttgaagc ggaggtgccg acgggtggat ttgggggaga tctggttgtg tgtgtgtgcg 5160
ctccgaacaa cacgaggttg gggaaagagg gtgtggaggg ggtgtctatt tattacggcg 5220
ggcgaggaag ggaaagcgaa ggagcggtgg gaaaggaatc ccccgtagct gccgtgccgt 5280
gagaggagga ggaggccgcc tgccgtgccg gctcacgtct gccgctccgc cacgcaattt 5340
ctggatgccg acagcggagc aagtccaacg gtggagcgga actctcgaga ggggtccaga 5400
ggcagcgaca gagatgccgt gccgtctgct tcgcttggcc cgacgcgacg ctgctggttc 5460
gctggttggt gtccgttaga ctcgtcgacg gcgtttaaca ggctggcatt atctactcga 5520
aacaagaaaa atgtttcctt agttttttta atttcttaaa gggtatttgt ttaattttta 5580
gtcactttat tttattctat tttatatcta aattattaaa taaaaaaact aaaatagagt 5640
tttagttttc ttaatttaga ggctaaaata gaataaaata gatgtactaa aaaaattagt 5700
ctataaaaac cattaaccct aaaccctaaa tggatgtact aataaaatgg atgaagtatt 5760
atataggtga agctatttgc aaaaaaaaag gaaaacacat gcaccctaaa aagataaaac 5820
tgtaaagtcc tgttgtcaaa atactcaatt gtcctttaaa ccatgtctaa ctgttcattt 5880
atatgattct ctaaaacact gatattattg tagtactata aattatatta ttcgtagagt 5940
aaagtttaaa tatatgtata aagatagata aactgcactt caaacaagtg tgacaaaaaa 6000
aatatgggga aattttttat aacttaaaca tgcaaggctc attatctcta gagaggggca 6060
cgaccgggtc acgctgcact gcaggcatgc aagctgggga tcctctagag tcgacctgca 6120
ggcatgcaag cttggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg 6180
ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag 6240
aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tgctagagca 6300
gcttgagctt ggatcagatt gtcgtttccc gccttcagtt taattcgatc catgcctcac 6360
atgttaatgt actaccaatg gagggctgta cacatttatg attacgaaat tttttaatat 6420
attttataga tttcttatgc atcatacaaa aatacataat tattcgtaac attttggaga 6480
tacatattca gatgcatcaa attctaatta aacgttaaaa tattttggag acgtatcttc 6540
gtaacaattt aaaacctata ctatagatca cattcgaagg tcattttata atttaaaata 6600
ttatggagat gcatcttcgt ttatgtttgc tcagatgaag atttaaacct tacaaacaat 6660
atgtaaaaaa tgacgtacat aaattcagat agtccaaaag tgtcatatat aaataaagat 6720
caataagtgt caaaaaaagt caagaacaac gatagagtag cataatgtca aaataaaata 6780
aaatccatga cactactact attatatatt aatgcactaa tgtgtatgtc taactacatc 6840
gtctctgcct cctctgtcag ttatgtctcg taagccatca atcccccgtc ctccggcgtt 6900
gtctccggta tatcaatgtc cccatgtgcc tacgtcatga tggcatctag gacatgtctc 6960
acatcagaca cattaggaaa gatacatttg ccaatgtata tctgcgcaat ctccacaayg 7020
caacgacata taggcaagac atcctcaaca taatttagtt gtgcatgctt ctcctctagt 7080
atcttccgat gagttgatca agcttatcga aactatcagt gtttgacagg atatattggc 7140
gggtaaacct aagagaaaag agcgtttatt agaataatcg gatatttaaa agggcgtgaa 7200
aaggtttatc cgttcgtcca cttgtatgtg catgccaacc acagggttcc cctcgggatc 7260
aaagtacttt gatccaaccc ctccgctgct atagtgcagt cggcttctga cgttcagtgc 7320
agccgtcttc tgaaaacgac atgtcgcaca agtcctaagt tacgcgacag gcggccgccc 7380
tgcccttttc ctggcgtttt cttgtcgcgt gttttagtcg cataaagtag aatacttgcg 7440
actagaaccg gagacattac gccatgaaca agagcgccgc cgctggcctg ctgggctatg 7500
cccgcgtcag caccgacgac caggacttga ccaaccaacg ggccgaactg cacgcggccg 7560
gctgcaccaa gctgttttcc gagaagatca ccggcaccag gcgcgaccgc ccggagctgg 7620
ccaggatgct tgaccaccta cgccctggcg acgttgtgac agtgaccagg ctagaccgcc 7680
tggcccgcag cacccgcgac atactggaca ttgccgagcg catccaggag gccggcgcgg 7740
gcctgcgtag cctggcagag ccgtgggccg acaccaccac gccggccggc cgcatggtgt 7800
tgaccgtgtt cgccggcatt gccgagttcg agcgttccct aatcatcgac cgcacccgga 7860
gcgggcgcga ggccgccaag gcccgaggcg tgaagtttgg cccccgccct accctcaccc 7920
cggcacagat cgcgcacgcc cgcgagctga tcgaccagga aggccgcacc gtgaaagagg 7980
cggctgcact gcttggcgtg catcgctcga ccctgtaccg cgcacttgag cgcagcgagg 8040
aagtgacgcc caccgaggcc aggcggcgcg gtgccttccg tgaggacgca ttgaccgagg 8100
ccgacgccct ggcggccgcc gagaatgaac gccaagagga acaagcatga aaccgcacca 8160
ggacggccag gacgaaccgt ttttcattac cgaagagatc gaggcggaga tgatcgcggc 8220
cgggtacgtg ttcgagccgc ccgcgcacgt ctcaaccgtg cggctgcatg aaatcctggc 8280
cggtttgtct gatgccaagc tggcggcctg gccggccagc ttggccgctg aagaaaccga 8340
gcgccgccgt ctaaaaaggt gatgtgtatt tgagtaaaac agcttgcgtc atgcggtcgc 8400
tgcgtatatg atgcgatgag taaataaaca aatacgcaag gggaacgcat gaaggttatc 8460
gctgtactta accagaaagg cgggtcaggc aagacgacca tcgcaaccca tctagcccgc 8520
gccctgcaac tcgccggggc cgatgttctg ttagtcgatt ccgatcccca gggcagtgcc 8580
cgcgattggg cggccgtgcg ggaagatcaa ccgctaaccg ttgtcggcat cgaccgcccg 8640
acgattgacc gcgacgtgaa ggccatcggc cggcgcgact tcgtagtgat cgacggagcg 8700
ccccaggcgg cggacttggc tgtgtccgcg atcaaggcag ccgacttcgt gctgattccg 8760
gtgcagccaa gcccttacga catatgggcc accgccgacc tggtggagct ggttaagcag 8820
cgcattgagg tcacggatgg aaggctacaa gcggcctttg tcgtgtcgcg ggcgatcaaa 8880
ggcacgcgca tcggcggtga ggttgccgag gcgctggccg ggtacgagct gcccattctt 8940
gagtcccgta tcacgcagcg cgtgagctac ccaggcactg ccgccgccgg cacaaccgtt 9000
cttgaatcag aacccgaggg cgacgctgcc cgcgaggtcc asgcgctggc cgctgaaatt 9060
aaatcaaaac tcatttgagt taatgaggta aagagaaaat gagcaaaagc acaaacacgc 9120
taagtgccgg ccgtccgagc gcacgcagca gcaaggctgc aacgttggcc agcctggcag 9180
acacgccagc catgaagcgg gtcaactttc agttgccggc ggaggatcac accaagctga 9240
agatgtacgc ggtacgccaa ggcaagacca ttaccgagct gctatctgaa tacatcgcgc 9300
agctaccaga gtaaatgagc aaatgaataa atgagtagat gaattttagc ggctaaagga 9360
ggcggcatgg aaaatcaaga acaaccaggc accgacgccg tggaatgccc catgtgtgga 9420
ggaacgggcg gttggccagg cgtaagcggc tgggttgcct gccggccctg caatggcact 9480
ggaaccccca agcccgagga atcggcgtga gcggtcgcaa accatccggc ccggtacaaa 9540
tcggcgcggc gctgggtgat gacctggtgg agaagttgaa ggccgcgcag gccgcccagc 9600
ggcaacgcat cgaggcagaa gcacgccccg gtgaatcgtg gcaagcggcc gctgatcgaa 9660
tccgcaaaga atcccggcaa ccgccggcag ccggtgcgcc gtcgattagg aagccgccca 9720
agggcgacga gcaaccagat tttttcgttc cgatgctcta tgacgtgggc acccgcgata 9780
gtcgcagcat catggacgtg gccgttttcc gtctgtcgaa gcgtgaccga cgagctggcg 9840
aggtgatccg ctacgagctt ccagacgggc acgtagaggt ttccgcaggg ccggccggca 9900
tggccagtgt gtgggattac gacctggtac tgatggcggt ttcccatcta accgaatcca 9960
tgaaccgata ccgggaaggg aagggagaca agcccggccg cgtgttccgt ccacacgttg 10020
cggacgtact caagttctgc cggcgagccg atggcggaaa gcagaaagac gacctggtag 10080
aaacctgcat tcggttaaac accacgcacg ttgccatgca gcgtacgaag aaggccaaga 10140
acggccgcct ggtgacggta tccgagggtg aagccttgat tagccgctac aagatcgtaa 10200
agagcgaaac cgggcggccg gagtacatcg agatcgagct agctgattgg atgtaccgcg 10260
agatcacaga aggcaagaac ccggacgtgc tgacggttca ccccgattac tttttgatcg 10320
atcccggcat cggccgtttt ctctaccgcc tggcacgccg cgccgcaggc aaggcagaag 10380
ccagatggtt gttcaagacg atctacgaac gcagtggcag cgccggagag ttcaagaagt 10440
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aagcatccgc cggttcctaa tgtacggagc agatgctagg gcaaattgcc ctagcagggg 10620
aaaaaggtcg aaaaggtctc tttcctgtgg atagcacgta cattgggaac ccaaagccgt 10680
acattgggaa ccggaacccg tacattggga acccaaagcc gtacattggg aaccggtcac 10740
acatgtaagt gactgatata aaagagaaaa aaggcgattt ttccgcctaa aactctttaa 10800
aacttattaa aactcttaaa acccgcctgg cctgtgcata actgtctggc cagcgcacag 10860
ccgaagagct gcaaaaagcg cctacccttc ggtcgctgcg ctccctacgc cccgccgctt 10920
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taccagggcg cggacaagcc gcgccgtcgc cactcgaccg ccggcgccca catggggttt 11040
ggggagcaat ggaaccaaaa accaacgtaa gctctgaatc ccaccgtaaa ggggctttcc 11100
gatctccagc tcacccgcca ggcattactc tctgatcagt gcctcgatga tcgggcagat 11160
cgttccgccg tctcccgcat cacattgctg caccagttcg cctaacagtt gctgcatgac 11220
gaccaagtcg gccatcttct gctcgatcaa cgcgagcttg cgtgcagccc gtgctcgcgt 11280
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ccgatggcca cccaagggtt tggctggttc atccagcagc ccgcgtcgct ggtagtagcg 11460
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catcactttc tccttgattc cgtactttgg tacggagttt agaatagcac ctaggcaatc 11580
aggctcagga gatgggaatg gggatgcaac tcaccgggaa aggctcgctg gtcgcgagtt 11640
cgctgaccgc catcggtgcg tcggtgtgct gtgtcgggcc actggtgctg ttggcactcg 11700
gtgtcggcgg tacgtgggtg ggcgctctga ccatgatgga gccactacgc cccctcttca 11760
tcgggttgac tctactgttc ctgggattgg cattccgcaa gctctacctg gtgccacagg 11820
tttgtacgcc aggtacaccc tgcgccgatc cgcgcacgct cgtgcgacag cgactcgtgt 11880
tctggatcgt cagcgtgctg ctgctcggcc tattggccgt gccgtggctc gccccgctgt 11940
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tcgtggcgct ggcggctccc ccgaaaaccg tcacgctcga cgtgcagaac atgacgtgcg 12060
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aggcactgac tgaggcgacc gcgaacgcgg gatacccctc cacagtgcag aagtgaggtc 12240
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ccggaaacca tgcccacgga cgcctgccag ttctattacg agtgcagcaa ctgcaaggcg 12360
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ccgccgatcc agcagcagct tgggtgttgc tcatagcgtt tagggggatc acaggtcgtc 12480
gtctggatta cgcagtggcc gcagctcgcc gcgcgcaact tcttccggta ccgcaaagga 12540
ataccgcccg agcatgttga tgtgctcgta gatcagcggc gatagccggg ccaaatcctc 12600
ttccagcact ggatagccgt gctgcttgag ccgttccacg gccgccgtca tgtagagggt 12660
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gcggaagagc ccgaacacca catcgctgta ggccccggtg tcggtcatga tttgcgtcgg 13200
ctgcaactcg gtctgctgtt ccagcacgac cgccagcaac accaggctgt cgcgcagcgt 13260
gccgggcacg gtgatggcgt tgaggccgga gaattggtcg gaaatcaggt tgtaccaggt 13320
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tacgacgaag cgcatgccat cggcggaggc gacctcgccg ccaccccaga cttgggccag 13440
ttccagttgg ctttgcgctc cgaccaggat ggcgttagcc gctgacaggg tgtcgtcgcg 13500
gatataattc tggctgaccc aggacagccg gtcacggcgc agcgccgggt tgtcggtgcg 13560
gatcaagggc tccaggccgg tgttgcaggc cccgcccaac agcaccgcgc agaggctggt 13620
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cggacgcgcc gttgatgtgg tgtcccgcaa tgccgtcaat cccgacttct taccggacga 20400
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atgccgcctg tttttcctgc tcattggcac gtttcgcaac ctgttctcat tgcggacacc 20820
ttttccagcc tcgtttggaa agtttcattg ccagacggga ctcctgcaat cgtcaaggga 20880
ttgaaaccta tagaagacat tgctgatgaa ctgcgcgggg ccgactatct ggtatggcgc 20940
aatgggaggg gagcagtccg gttgctcggt cgtgagaaca atctgatgtt gctcgaatat 21000
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gattgactta tgacaaagct aa 26002