动物细胞的灌流培养方法
阅读说明：本技术 动物细胞的灌流培养方法 (Perfusion culture method of animal cells ) 是由 陆金康 胡飞 于 2020-12-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种动物细胞的灌流培养方法,该动物细胞的灌流培养方法包括以下步骤：将基础培养基和补料培养基混合后灌流培养动物细胞；以及收获生物物质；其中,基础培养基为Growth A,补料培养基为Feed 4,基础培养基与补料培养基的体积之比为(80～90)：(10～20),上述动物细胞的灌流培养方法可以促进动物细胞增殖,提高动物细胞分泌的治疗性蛋白的产量。(The invention relates to a perfusion culture method of animal cells, which comprises the following steps: mixing a basal culture medium and a supplementary culture medium, and performing perfusion culture on animal cells; and harvesting the biological material; wherein the basic culture medium is Growth A, feed medium Feed4, the volume ratio of the basal medium to the Feed medium is (80-90): (10-20), the perfusion culture method of animal cells can promote the proliferation of the animal cells and improve the yield of therapeutic proteins secreted by the animal cells.)
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别是涉及一种动物细胞的灌流培养方法。
背景技术
近年来，生物药技术发展越来越快，生物药的市场需求也越来越大，随着对以哺乳动物细胞为载体所生产的生物制品(例如蛋白质类、生长因子、疫苗或单克隆抗体等)的需求量不断加大，大规模动物细胞培养技术也越来越被关注。
常见的动物细胞培养方法包括分批培养、分批补料培养和灌流培养。分批培养是将细胞及培养基一次性装入反应器内进行培养，细胞不断生长，同时产物也不断形成，经过一段时间的培养后，终止培养。分批补料培养是指先将一定量的培养基装入反应器，在适宜的条件下接种细胞，进行培养，使细胞不断生长，产物不断形成，在此过程中，随着营养物质的不断消耗，不断向反应容器中补充新的营养成分，使细胞进一步地代谢，直到整个培养结束后取出产物。分批补料培养只是向反应容器中补加必要的营养成分，以维持营养物质的浓度不变。灌流培养是将细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成的过程中，不断地将部分培养基取出，同时不断地灌注新的培养基。灌流培养作为目前哺乳动物细胞培养的重要工艺之一，不仅可以通过不断排出细胞代谢副产物提供有利于细胞培养的稳定环境，解决蛋白质量不稳定或者表达量偏低等问题，还可以通过提高单位体积产率来优化产能利用率并提高生产效率。
目前市场上商品化的灌流培养基品种较少，且与构建好的细胞匹配性有待验证，还缺少能促进表达治疗性蛋白的细胞生长和分泌治疗性蛋白的灌流培养基。
发明内容
基于此，有必要提供一种动物细胞的灌流培养方法，采用该灌流培养方法培养动物细胞时，动物细胞增殖快，且利于细胞分泌治疗性蛋白。
一种动物细胞的灌流培养方法，包括以下步骤：
将基础培养基和补料培养基混合后灌流培养动物细胞；以及
收获生物物质；
其中，所述基础培养基为Growth A，所述补料培养基为Feed 4，所述基础培养基与所述补料培养基的体积之比为(80～90)：(10～20)。
上述动物细胞的灌流培养方法中，采用的灌流培养基包括Growth A和Feed 4且两者的体积比设置为(80～90)：(10～20)，通过Growth A和Feed 4的配合，能够促进动物细胞增殖，提高动物细胞的细胞密度，并还能够促进动物细胞分泌治疗性蛋白，提高治疗性蛋白的产量。上述动物细胞的灌流培养方法对分泌抗CD20抗体的CHO细胞的培养效果尤为明显。
在其中一个实施例中，所述基础培养基与所述补料培养基的体积之比为90：10。
在其中一个实施例中，从灌流培养的第15天～第16天开始，所述基础培养基与所述补料培养基的体积之比为(80～85)：(20～15)。
在其中一个实施例中，从灌流培养的第15天～第16天开始，所述基础培养基与所述补料培养基的体积之比为80：20，从灌流培养的第17天～第18天开始，所述基础培养基与所述补料培养基的体积之比为85：15。
在其中一个实施例中，所述动物细胞的接种密度为0.2×106个/mL～2×106个/mL。
在其中一个实施例中，所述灌流培养的灌流速率为0.5VVD～2VVD。
在其中一个实施例中，所述灌流培养温度为31℃～37℃。
在其中一个实施例中，所述动物细胞为表达抗CD20抗体的动物细胞。
在其中一个实施例中，所述动物细胞选自中国仓鼠卵巢细胞、杂交瘤细胞、幼仓鼠肾细胞及骨髓瘤细胞中的任意一种。
在其中一个实施例中，所述中国仓鼠卵巢细胞为CHO-K1。
附图说明
图1为实施例1的生长曲线；
图2为实施例2的生长曲线；
图3为实施例2的抗体浓度曲线；
图4为对比例1的生长曲线；
图5为对比例1的抗体浓度曲线；
图6为对比例2的生长曲线；
图7为对比例2的抗体浓度曲线。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
如无特殊说明，在本文的灌流培养过程中，灌注新鲜培养基或取出用过的培养基可以是连续的，逐步的，间断的或任何这些或全部的组合。
本发明一实施方式提供了一种灌流培养基，该灌流培养基包括基础培养基和补料培养基，基础培养基为Growth A，补料培养基为Feed4，基础培养基与补料培养基的体积之比为(80～90)：(10～20)。经验证，将含有Growth A和Feed 4且两者的体积比设置为(80～90)：(10～20)的灌流培养基，用于灌流培养分泌抗CD20抗体的CHO细胞时，能够明显提高分泌抗CD20抗体(anti-CD20)的CHO细胞的细胞密度，提高抗CD20抗体的产量。
在一个可选地具体示例中，基础培养基与补料培养基的体积之比为90：10、88：12、85：15、83：17或80：20。在其中一个实施例中，基础培养基与补料培养基的体积之比为(85～90)：(10～15)。
在其中一个实施例中，上述灌流培养基由基础培养基和补料培养基组成，基础培养基和补料培养基的比例如上述。当然，在其他一些实施例中，上述灌流培养基除基础培养基和补料培养基外还包括其他组分。例如消泡剂，又例如能够结合到宿主细胞系中的抗性标记及存活性标记的一种或多种选择剂，这些选择剂包括但不限于遗传霉素(G4118)、新霉素、潮霉素B、嘌呤霉素、zeocin、蛋氨酸亚磺酰亚胺或甲氨蝶呤。
本发明一实施方式还提供了一种上述灌流培养基的制备方法，该制备方法包括：将灌流培养基的组分混合，制备灌流培养基。当然，灌流培养基的组分混合的方式无特别限制，只需要将各组分混合均匀即可。
上述灌流培养基的制备方法简捷易操作。
本发明一实施方式还提供了一种动物细胞的灌流培养方法，该动物细胞的灌流培养方法包括步骤a～步骤c。具体地：
步骤a：培养包含细胞培养基和动物细胞的细胞培养物。
具体地，培养包含细胞培养基和动物细胞的细胞培养物的步骤是为了缩短动物细胞接种到生物反应器后达到所需活性密度的时间，提高初始细胞量。可以理解的是，在培养包含细胞培养基和动物细胞的细胞培养物的步骤中，细胞培养基没有特别的限制，可以是任何可以用于培养动物细胞的培养基。当然，选择利于细胞增殖的培养基，更利于缩短达到适宜于灌流培养接种密度的细胞量的培养时间。
具体地，动物细胞选自中国仓鼠卵巢细胞、杂交瘤细胞、幼仓鼠肾细胞及骨髓瘤细胞中的任意一种。
在其中一个实施例中，动物细胞为CHO细胞。中国仓鼠卵巢细胞系(CHO细胞)是一个转化细胞系，1957年从中国仓鼠卵巢细胞得到。CHO细胞属于成纤维细胞，是一种分泌型细胞，常用来表达人体需要的蛋白，例如抗体。进一步地，动物细胞为用于表达抗CD20抗体的中国仓鼠卵巢细胞K1(简称CHO-K1)。当然，在其他实施例中，动物细胞不限于CHO细胞，还可以其他适用于工业化生产的哺乳细胞系，例如NSO细胞(来源于小鼠骨髓瘤细胞系NS-1，自身不分泌免疫球蛋白重链，也不合成免疫球蛋白轻链)、PerC.6细胞(Crucell公司与Royal DSM公司合作开发的工程细胞，由人胚视网膜母细胞通过基因改造而来)等。
可以理解的是，在一些实施例中，步骤a可以省略。例如，在用于灌流培养的细胞量能够满足灌流培养时的接种密度时，则不必进行步骤a。
步骤b：将基础培养基和补料培养基混合后灌流培养细胞培养物。
具体地，在将动物细胞培养到一定细胞量(即满足灌流培养的密度的细胞量)时，将动物细胞转移至灌流设备中进行灌流培养。动物细胞的接种密度为0.2×106个/mL～2×106个/mL。在此接种密度下，可以使得动物细胞能够更快适应灌流培养环境。可选地，动物细胞的接种密度为0.2×106个/mL、0.5×106个/mL、1×106个/mL、1.5×106个/mL或2×106个/mL。进一步地，动物细胞的接种密度为0.5×106个/mL～1×106个/mL。
在本实施方式中，灌流培养的灌流速率为0.5VVD～2VVD。“VVD”是指容器体积/天。可选地，灌流培养的灌流速率为0.5VVD、0.8VVD、1VVD、1.5VVD或2VVD。
具体地，灌流培养为交替切向流灌流培养或切向流灌流培养。交替切向流灌流培养是指在细胞培养中采用交替切向流(ATF)过滤技术截留细胞的灌流培养；切向流灌流培养是指在细胞培养过程中采用切向流(TFF)过滤技术截留细胞的灌流培养。在采用切向流(TFF)过滤技术截留细胞的灌流培养中，细胞液通过蠕动泵作用形成一个连续的环形流动方向，进入纤维膜后，废液会通过膜排出体系之外，细胞会随着环路重新回到培养体系之内。在采用交替切向流(ATF)过滤技术截留细胞的灌流培养中，是通过隔膜泵的往复吹吸作用，实现罐内培养基在截留设备中的往复流动，同时代谢废物会随着培养基通过膜排出而细胞截留在反应器内。使用ATF时，交替运动在过滤膜中产生冲刷作用，有助于防止纤维膜堵塞。
具体地，灌流培养的反应容器没有特别限制，例如可以是生物反应器，也可以是培养摇管。本文中的“生物反应器”主要是指容量在2L以上、用于培养细胞以产生目的产物的反应容器。
在其中一个实施例中，灌流培养的反应容器为生物反应器，采用生物反应器进行灌流培养更便于控制新鲜培养基的灌注及用过的培养基的取出。在一个具体的示例中，生物反应器为N级生物反应器(生产型生物反应器)，在N级生物反应器使用一般培养(例如分批培养)时，由于营养或设备限制，细胞量可迅速达到系统容量的上限，细胞活力迅速下降。而在N级生物反应器使用灌流培养时，可以实现对细胞密度的有效控制可以防止上述情况，通常使用半连续或连续性排细胞来控制细胞密度，并且细胞量可稳定维持较长的生产期。当然，生物反应器通常与细胞截留装置相配合，以使得细胞保留在生物反应器中。进一步地，细胞截留装置包括中空纤维过滤器。可选地，中空纤维过滤器的孔径为0.1μm～0.5μm。
在另一个实施例中，灌流培养的反应容器为培养摇管。例如，50mL的培养摇管或100mL的培养摇管。可选地，在用培养摇管培养细胞的过程中，采用200rpm～300rpm、振幅为50mm的摇床进行培养；从培养摇管中取出用过的培养基的方式可以采用离心。例如200g～300g离心5min～10min。当然，在取出用过的培养基后需添加新鲜培养基。可以理解的是，在其他实施例中，取出用过的培养基的方式不限于离心，还是可以其他方式。
在其中一个实施例中，在灌流培养的前期，灌流培养基中Growth A和Feed 4体积比为(80～90)：(10～20)；在灌流培养的后期，灌流培养基中Growth A和Feed 4体积比为(80～85)：(20～15)。在灌流培养的前期，Growth A的占比较大，使得动物细胞快速增殖，在灌流培养的后期，减少Growth A的占比，并相应增加Feed 4的占比，有利于抗体的积累，增加抗体的产量。
具体地，从灌流培养的第15天～第16天开始，灌流培养基中Growth A和Feed 4体积比为(80～85)：(20～15)。在一个可选地具体示例中，从灌流培养的第15天～第16天开始，灌流培养基中Growth A和Feed 4体积比为80：20～15。进一步地，从灌流培养的第17天～第18天开始，灌流培养基中Growth A和Feed 4体积比调整为85：15。
在其中一个实施例中，在灌流培养的前14天里，灌流培养基中Growth A和Feed 4体积比为90：10，从灌流培养的第15天～第16天开始，灌流培养基中Growth A和Feed 4体积比调整为80：20；从灌流培养的第17天～第18天开始，灌流培养基中Growth A和Feed 4体积比调整为85：15。
步骤c：收获生物物质。
具体地，在灌流培养过程中，不断地收获由细胞产生的生物物质。在本实施方式中，培养的细胞为用于表达抗CD20抗体的CHO-K1，因此，收获的是由动物细胞产生的抗CD20抗体。当然，在其他实施方式中，根据培养的动物细胞，可收获相应的产物。
需要说明的是，收获生物物质是一直持续的灌流培养过程中，而不是待灌流培养结束后才进行，也即是步骤c并不是在步骤b之后。
上述动物细胞的灌流培养方法简捷，利于工业化生产，而且由于采用了上述灌流培养基，上述动物细胞的灌流培养方法中的活细胞密度高，产量高，生产周期短，生产效率高。此外，对灌流培养后期的培养基的进一步优化，使得上述动物细胞的灌流培养方法所产生的生物物质的量更高。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。以下实施例中所使用的细胞株为用于表达抗CD20抗体的CHO-K1(来自ATCC，American type culture collection)；Feed 4和Growth A来自Irvine Scientific；EX-Advanced HDPerfusion Medium来自Sigma，货号24370C。
实施例1培养基比例筛选
取11个50mL的培养摇管作为反应容器，并编号A～K，分别在各培养摇管中装入20mL培养基(各个培养摇管对应的培养基的组成如表1所示)；然后以0.3×106个/mL的接种密度接种用于表达抗CD20抗体的CHO-K1，并在85％湿度、5.0％CO2的条件下，225rpm、振幅50mm的摇床培养，每2天～3天取样计数细胞密度，并绘制生长曲线。各组的生长曲线如图1所示，在图1中，横坐标为时间(单位：天)，纵坐标为活细胞密度(VC，单位106个/mL)。
表1
由图1可知，F组的培养基培养表达抗CD20抗体的CHO-K1的效果最好，细胞密度最高能达到1.67×107个/mL，尤其在培养5天之后，其他组的细胞密度均缓慢上升或者下降，而F组的细胞密度急剧上升，由此说明，与其他组的培养基相比，按照Feed 4与Growth的体积比为10：90的比例配制的F组的培养基，更适宜于表达抗CD20抗体的CHO-K1的增殖。
实施例2
在实施例1中，筛选得到了Feed 4与GrowthA最佳的混合比例，在培养过程中发现，在培养一段时间后，随着细胞密度的增加，通过对Feed 4与Growth A的混合比例进行进一步优化之后能够取得更好的培养效果。具体地，在灌流培养过程中对Feed 4与Growth A的混合比例进行进一步优化的培养方法包括以下步骤：
在50mL的培养摇管中加入10mL灌流培养基，以接种密度1×106个/mL接种用于表达抗CD20抗体的CHO-K1，在85％湿度、5.0％CO2的条件下，300rpm、振幅50mm的摇床培养，后续进行如下操作：
取样计数细胞密度，离心进行换液，每天换液1VVD。离心后的上清用于生化、代谢、产量指标等检测，离心后的沉淀用新鲜灌流培养基(具体组成如表2所示)将细胞重悬至10mL，继续培养。也即是，在灌流培养的前15天里，灌流培养基中GrowthA与Feed 4的体积之比为90：10；从第16天开始，灌流培养基中Growth A与Feed 4的体积之比调整为80：20；从第18天开始，灌流培养基中Growth A与Feed 4的体积之比调整为85:15。
根据记录的细胞密度绘制生长曲线，并根据每天检测的离心后的上清中抗体的含量绘制抗体浓度曲线，结果如图2和图3所示。
表2
由图2和图3可知，按照实施例2中的培养工艺，在培养表达抗CD20抗体的CHO-K1时，CHO-K1的最高的活细胞密度(VCD)可以达到7×107个/mL，在平台期，每天抗CD20抗体(anti-CD20)的表达量稳定在3.5g/L～4.3g/L。
对比例1
对比例1的灌流培养方法与实施例2除了使用的培养基存在差异，其他培养条件相同，对比例1中，在灌流培养的19天里，所用的灌流培养基均为100％的Growth A。
对比例1的生长曲线和抗体浓度曲线如图4和图5所示。在图4中，BalanCD GrowthA所代表的生长曲线为采用对比例1的灌流培养方法所得到的生长曲线，培养基A(由Growth A与Feed 4按照体积之比为90：10的比例制成的灌流培养基)所代表的生长曲线为采用实施例2的灌流培养方法所得到的生长曲线。在图5中，BalanCD Growth A所代表的抗体浓度曲线为采用对比例1的灌流培养方法所得到的抗体浓度曲线，培养基A所代表的抗体浓度曲线为采用实施例2的灌流培养方法得到的抗体浓度曲线。
由图4和图5可知，采用由Growth A与Feed4按照体积之比为90：10的比例制成的灌流培养基(下文简称培养基A)的灌流培养方法的最高活细胞密度达到7×107个/mL，高于只采用Growth A作为灌流培养基(下文简称培养基B)的灌流培养方法的最高活细胞密度(5×107个/mL)。并且，采用培养基A的灌流培养方法的平台期抗体表达量高于采用培养基B的灌流培养方法，在采用培养基A的灌流培养方法中，平台期每天的抗体表达量稳定在3.5g/L～4.3g/L，而在采用培养基B的灌流培养方法中，平台期每天的抗体表达量稳定在0.6g/L～0.7g/L。
对比例2
对比例2的灌流培养方法与实施例2除了使用的培养基存在差异，对比例1中，在灌流培养的19天里，所用的灌流培养基为EX-Advanced HD Perfusion Medium。
对比例2的生长曲线和抗体浓度曲线如图6和图7所示。在图6中，Excell HDperfusion medium所代表的生长曲线为采用对比例3的灌流培养方法所得到的生长曲线，培养基A所代表的生长曲线为采用实施例2的灌流培养方法所得到的生长曲线。在图7中，Excell HD perfusion medium所代表的抗体浓度曲线为采用对比例2的灌流培养方法所得到的抗体浓度曲线，培养基A所代表的抗体浓度曲线为采用实施例2的灌流培养方法得到的抗体浓度曲线。
由图6和图7可知，采用培养基A的灌流培养方法的最高活细胞密度达到7×107个/mL，高于采用EX-Advanced HD Perfusion Medium作为灌流培养基(下文简称培养基C，该培养基是在分泌抗CD20抗体的CHO细胞的灌流培养中主要使用的培养基，在使用该培养基灌流培养分泌抗CD20抗体的CHO细胞时，细胞密度高、抗CD20抗体的产量高)的灌流培养方法的最高活细胞密度(约5.5×107个/mL)，并且采用培养基A的灌流培养方法的平台期抗体表达量高于采用培养基C的灌流培养方法，在采用培养基A的灌流培养方法中，平台期每天的抗体表达量稳定在3.5g/L～4.3g/L，而在采用培养基C的灌流培养方法中，平台期每天的抗体表达量稳定在1.8g/L～2.1g/L。此外，与采用培养基C的灌流培养方法相比，采用培养基A的灌流培养方法的抗体表达较早，生产周期较短。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
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