具体实施方式

本说明不旨在是可以实施本发明的所有不同方式，或可以添加到本发明中的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施例所说明的特征可以并入其他实施例中，并且关于一个特定实施例所说明的特征可以从那个实施例删除。因此，本发明考虑了，在本发明的一些实施例中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征的组合。此外，鉴于本披露，本文建议的不同实施例的众多变化以及附加对于本领域技术人员是显而易见的，这不脱离本发明。因此，以下说明旨在阐述本发明的一些特定实施例，并且并没有穷尽地叙述其所有排列、组合和变化。

除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在本文的发明的说明中使用的术语是仅出于描述特定实施例的目的，且并不旨在限制本发明。还应当理解的是在此使用的术语仅仅是出于描述具体实施例的目的并且不旨在限制本发明的范围。与本发明有关的一般参考文献包括：Alwine等人(1977)Proc.Nat.Acad.Sci.[美国国家科学院学报]74:5350-54；Baldwin(2004)Mol.Cell.Proteomics[分子和细胞的蛋白质组学]3(1):1-9；Can和Annan(1997)Overview of peptide and protein analysis by mass spectrometry[肽和蛋白质质谱分析综述].In:Current Protocols in Molecular Biology[摘自:最新分子生物学方法汇编],Ausubel等人编辑,纽约:威利,第10.21.1-10.21.27页；Chang等人(2000)PlantPhysiol.[植物生理学]122(2):295-317；Domon和Aebersold(2006)Science[科学]312(5771):212-17；Nain等人(2005)Plant Mol.Biol.Rep.[植物分子生物学导报]23:59-65；Patterson(1998)Protein identification and characterization by massspectrometry[蛋白质的质谱鉴定与表征].In:Current Protocols in MolecularBiology[摘自:最新分子生物学方法汇编],Ausubel等人编辑,纽约:威利,第10.22.1-10.22.24页；Paterson和Aebersold(1995)Electrophoresis[电泳]16:1791-1814；Rajagopal和Ahern(2001)Science[科学]294(5551):2571-73；Sesikeran和Vasanthi(2008)Asia Pac.J.Clin.Nutr.17[亚太临床营养杂志]增刊1:241-44；以及Toplak等人(2004)Plant Mol.Biol.Rep.[植物分子生物学导报]22:237-50。

定义

如本文和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个/种(a/an)”和“该/所述(the)”可以表示一个或多于一个。因此，例如，提及“一种植物”可以指单种植物或多种植物。

如本文所使用的，“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关的列出项的任何及全部可能组合，连同当以可替代性(“或”)解释时组合的缺少。

术语“约”在此用于意指大约、大致、约或在……左右。当术语“约”结合数值范围来使用时，它通过将边界延伸至高于以及低于所阐述的数值来限定这个范围。一般而言，术语“约”本文用于将数值限定至以20％的变化，优选地10％上下(更高或更低)地高于以及低于规定值。关于温度，术语“约”意指±1℃，优选±0.5℃。当术语“约”被用于本发明的上下文中(例如与温度或分子量值组合)时，确切值(即，无“约”)是优选的。

术语“包含(comprises和/或comprising)”当在本说明书中使用时，指明所列举特征、整体、步骤、操作、元件、和/或部件的存在，但是不排除一种或多种其他特征、整体、步骤、操作、元件、部件、和/或其组的存在或添加。

如本文使用的，过渡短语“基本上由……组成”(以及语法变体)意指，权利要求书的范围有待被解读为涵盖权利要求书中所列举的指定材料或步骤以及不实质上改变所要求的发明的一个或多个基本和新颖特征的那些。因此，当用于本发明的权利要求中时，术语“基本上由……组成”并不旨在被解释为等同于“包含(comprising)”。

如本文使用的，术语“Cry蛋白”是指在芽孢杆菌属物种(例如苏云金芽孢杆菌)生长周期的孢子形成阶段期间，在天然条件下以结晶形式积聚为原毒素的呈球状蛋白质分子的杀昆虫蛋白。术语“Cry毒素”以及“δ-内毒素”可以与术语“Cry蛋白”互换地使用。对于Cry蛋白和编码Cry蛋白的基因的当前命名法基于氨基酸序列同源性(Crickmore等人,(1998),Microbiol.Mol.Biol.Rev.[微生物分子生物学评论],62:807-813)。在本领域公认的分类中，每种Cry蛋白被指定唯一的名称，所述名称合并了初级等级(阿拉伯数字)、二级等级(大写字母)、三级等级(小写字母)、以及四级等级(另一个阿拉伯数字)。例如，根据Crickmoe等人，具有<45％同源性的两个Cry蛋白将被指定唯一的初级等级，例如Cry1和Cry2。具有>45％但<70％同源性的两个Cry蛋白将接受相同的初级等级，但是将被指定不同的二级等级，例如Cry1A和Cry1B。具有70％至95％同源性的两个Cry蛋白将被指定相同的初级等级和二级等级，但是将被指定不同的三级等级，例如Cry1Aa和Cry1Ab。并且具有>95％但<100％同源性的两个Cry蛋白将被指定相同的初级等级、二级等级和三级等级，但是将被指定不同的四级等级，例如Cry1Ab1和Cry1Ab2。

如本文使用的，“Cry1Ab蛋白”意指衍生自苏云金芽孢杆菌的杀昆虫晶体蛋白，其(无论是天然存在的还是合成的)包含与全型Cry1Ab氨基酸序列(根据Crickmore等人(同上))具有至少96％同一性的氨基酸序列并且在因特网站“lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt”上披露为登录号AAA22330)。Cry1Ab蛋白(具有登录号)的实例包括但不限于Cry1Ab1(AAA22330)、Cry1Ab2(AAA22613)、Cry1Ab3(AAA22561)、Cry1Ab4(BAA00071)、Cry1Ab5(CAA28405)、Cry1Ab6(AAA22420)、Cry1Ab7(CAA31620)、Cry1Ab8(AAA22551)、Cry1Ab9(CAA38701)、Cry1Ab10(A29125)、Cry1Ab11(I12419)、Cry1Ab12(AAC64003)、Cry1Ab13(AAN76494)、Cry1Ab14(AAG16877)、Cry1Ab15(AAO13302)、Cry1Ab16(AAK55546)、Cry1Ab17(AAT46415)、Cry1Ab18(AAQ88259)、Cry1Ab19(AAW31761)、Cry1Ab20(ABB72460)、Cry1Ab21(ABS18384)、Cry1Ab22(ABW87320)、Cry1Ab23(HQ439777)、Cry1Ab24(HQ439778)、Cry1Ab25(HQ685122)、Cry1Ab26(HQ847729)、Cry1Ab27(JN135249)、Cry1Ab28(JN135250)、Cry1Ab29(JN135251)、Cry1Ab30(JN135252)、Cry1Ab31(JN135253)、Cry1Ab32(JN135254)、Cry1Ab33(AAS93798)、Cry1Ab34(KC156668)、Cry1Ab35(KT692985)、和Cry1Ab36(KY440260)。本发明的Cry1Ab蛋白的示例性实例由SEQ ID NO:259表示。

如本文使用的，术语“Cry3”是指与分类为Cry3的先前描述的序列(根据Crickmore等人(同上))共享高度序列同一性或相似性的杀昆虫蛋白，其实例披露在因特网站“lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/”上并且包括(具有登录号)Cry3Aa1(AAA22336)、Cry3Aa2(AAA22541)、Cry3Aa3(Caa68482)、Cry3Aa4(AAA22542)、Cry3Aa5(AAA50255)、Cry3Aa6(AAC43266)、Cry3Aa7(CAB41411)、Cry3Aa8(AAS79487)、Cry3Aa9(AAW05659)、Cry3Aa10(AAU29411)、Cry3Aa11(AAW82872)、Cry3Aa12(ABY49136)、Cry3Ba1(CAA34983)、Cry3Ba2(CAA00645)、Cry3Ba3(JQ397327)、Cry3Bb1(AAA22334)、Cry3Bb2(AAA74198)、Cry3Bb3(I15475)、和Cry3Ca1(CAA42469)。已经通过插入、取代或缺失氨基酸而工程化的Cry3蛋白在本文称为“修饰的Cry3蛋白”或“mCry3蛋白”。与从其衍生出“修饰的Cry3蛋白”的野生型Cry3蛋白相比，此类“修饰的Cry3蛋白”典型地具有针对某些昆虫有害生物(例如玉米根虫(根萤叶甲属物种))的增强的活性。“修饰的Cry3蛋白”的实例是由SEQID NO:262的氨基酸序列表示的“mCry3A”。“修饰的Cry3”蛋白的其他实例包括但不限于披露于美国专利8,247,369中的“mCry3A蛋白”、披露于美国专利9,109,231中的“mCry3A蛋白”、和披露于美国专利6,060,594中的“mCry3B蛋白”。

术语“eCry3.1Ab”是指工程化的杂合杀昆虫蛋白，其在N-末端至C-末端方向包含融合至如描述于美国专利8,309,516中的Cry1Aa或Cry1Ab蛋白的C-末端区域的Cry3A的N-末端区域。“eCry3.1Ab蛋白”的实例由SEQ ID NO:260的氨基酸序列表示。

如本文使用的，术语转基因“事件”是指通过用异源DNA(例如，包含目的基因的表达盒)转化和再生单个植物细胞而产生的重组植物。术语“事件”是指包含异源DNA的原始转化体和/或所述转化体的子代。术语“事件”也是指通过该转化体和另一种玉米品系之间进行有性异型杂交(sexual outcross)而产生的子代。即使在重复回交至一个轮回亲本后，来自所述转化的亲本的插入DNA和侧翼DNA存在于在所述杂交子代的同样的染色体位置。通常，植物组织的转化产生多个事件，每个上述事件代表DNA构建体插入至植物细胞的基因组中的不同位置中。基于转基因或其他期望的特征的表达，选择特定的事件。本发明的此类转基因事件的非限制性实例包括“事件Bt11”，其包含cry1Ab和pat基因，并描述于US 6114608中(也称为“Bt11事件”或仅“Bt11”)；“事件5307”，其包含eCry3.1Ab和PMI基因，并描述于US8466346中(也称为“5307事件”或仅称为“5307”)；“事件MIR604”，其包含mCry3A和PMI基因，并描述于US 7361813中(也称为“MIR604事件”或仅称为“MIR604”)；“事件MIR162”，其包含Vip3A和PMI基因，并在描述于US 8232456中(也称为“事件MIR162”或仅称为“MIR162”)；“事件GA21”，其包含dmEPSPS基因，并描述于US 6566587中(也称为“GA21事件”或仅称为“GA21”)；“事件3272”，其包含α-淀粉酶797E和PMI基因，并描述于US 7635799中(也称为“3272事件”或仅称为“3272”)；“事件MON810”，其包含Cry1Ab，并描述于US 6713259中(也称为“MON810事件”或仅称为“MON810”)；“事件MON89034”，其包含Cry1A.105和Cry2Ab基因，并描述于US 8062840中(也称为“MON89034事件”或仅称为“MON89034”)；“事件TC1507”，其包含Cry1F和PAT基因，并描述于US 7288643(也称为“TC1507事件”或仅称为“TC1507”)；“事件DAS59122”，其包含Cry34/Cry35和PAT基因，并描述于US 7323556中(也称为“DAS59122事件”或仅称为“DAS59122”)和“事件DP4114”，其包含Cry1F、Cry34/Cry35和PAT基因，并描述于US 9790561中(也称为“DP4114事件”或仅称为“DP4114”)。

如本文使用的，术语“杂合Cry蛋白”是天然不存在的工程化的杀昆虫蛋白，并且其至少一部分包含至少一个27％连续的Cry1Ab蛋白氨基酸序列。该27％限制是通过将杂合Cry蛋白中的连续的Cry1Ab氨基酸数量除以杂合Cry蛋白中的氨基酸总数来计算的。例如，该杂合Cry蛋白eCry3.1Ab(SEQ ID NO:261)具有174个Cry1Ab氨基酸(位置480-653)和总共653个氨基酸。因此，eCry3A.1Ab具有至少一个27％连续的Cry1Ab蛋白的氨基酸序列。根据本发明的杂合Cry蛋白Cry1A.105的另一个实例由SEQ ID NO:267表示。

“dmEPSPS”(5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶)是工程化的蛋白，赋予植物对草甘膦除草剂的耐受性，如PCT公开号WO 97/04103中所述。本发明的dmEPSPS的示例性实例由SEQ ID NO:263表示。

如本文使用的，“高度相关的杀昆虫蛋白”是指具有至少95％总体序列同一性的蛋白，或具有存在至少80％序列同一性的共同基序的蛋白。“高度相关的”杀昆虫蛋白的实例包括Cry1Ab(SEQ ID NO:259)和eCry3.1Ab(SEQ ID NO:260)(它们具有存在至少80％序列同一性的共同基序)，以及eCry3.1Ab(SEQ ID NO:260)和mCry3A(SEQ ID NO:261)(它们具有存在至少80％序列同一性的共同基序)。

术语“分离的”核酸分子、多核苷酸或毒素是不再存在于其天然环境中的核酸分子、多核苷酸或毒性蛋白。本发明的分离的核酸分子、多核苷酸或毒素可以按照纯化的形式存在，或者可以存在于重组宿主中，例如转基因细菌细胞或转基因植物中。

如本文使用的，一般术语“质谱”是指任何合适的质谱方法、设备或配置，包括例如电喷雾电离(ESI)、基质辅助激光解吸/电离(MALDI)MS、MALDI-飞行时间(TOF)MS、大气压(AP)MALDI MS、真空MALDI MS、串联MS或其任何组合。质谱设备通过测量分子在一组磁场和电场中的飞行路径，来测量分子的分子量(作为分子的质荷比的函数)。质荷比是带电粒子的电动力学中广泛使用的物理量。特定肽的质荷比可由本领域技术人员事先计算。当经历相同的电场和磁场时，质荷比不同的两个粒子在真空中不会沿相同的路径移动。本发明尤其包括使用高效液相色谱(HPLC)，随后对该肽进行串联MS分析。在“串联质谱”中，可以在MS仪器中过滤替代肽，并在随后将该替代肽碎裂以产生一个或多个“过渡离子”，在第二个MS程序中对这些过渡离子进行分析(检测和/或定量)。

质谱方法和设备的详细概述可在以下参考文献中找到，在此通过引用将其并入：Can和Annan(1997)Overview of peptide and protein analysis by mass spectrometry[肽和蛋白质质谱分析综述].In:Current Protocols in Molecular Biology[摘自:最新分子生物学方法汇编],Ausubel等人编辑,纽约:威利,第10.21.1-10.21.27页；Paterson和Aebersold(1995)Electrophoresis[电泳]16:1791-1814；Patterson(1998)Proteinidentification and characterization by mass spectrometry[蛋白质的质谱鉴定与表征].In:Current Protocols in Molecular Biology[摘自:最新分子生物学方法汇编],Ausubel等人编辑,纽约:威利,第10.22.1-10.22.24页；以及Domon和Aebersold(2006)Science[科学]312(5771):212-17。

肽是一种短聚合物，由α-氨基酸按定义顺序连接而成。肽也可以通过用蛋白酶消化多肽(例如蛋白质)来产生。

“植物”是在发育的任何阶段的任何植物，特别是种子植物。

“植物细胞”是植物的结构和生理学单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以处于分离的单个细胞或培养细胞的形式，或者是作为较高级的组织单位(诸如像植物组织、植物器官、或全株植物)的一部分。

“植物细胞培养物”意指植物单元(诸如像原生质体、细胞培养物细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及处于不同发育阶段的胚)的培养物。

“植物材料”是指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、接合子、种子、切条、细胞或组织培养物、或植物的任何其他部分或产物。

“植物器官”是植物的独特而明显的已结构化并且分化的部分，如根、茎、叶、花蕾或胚。

如本文使用的“植物组织”意指组织化成结构和功能单元的一组植物细胞。包括植物中或培养物中的任何植物组织。这个术语包括但不限于全株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织化成结构和/或功能单元的任何植物细胞群组。这个术语与如以上列出的或由该定义以其他方式涵盖的任何具体类型的植物组织的联合应用或单独应用并不旨在排除任何其他类型的植物组织。

如本文使用的，术语“替代肽”是指通过蛋白水解消化，例如胰蛋白酶消化，从靶转基因蛋白衍生的肽，该靶转基因蛋白在质谱测定中起作用以产生一个或多个过渡离子，当在复合生物基质(诸如来自转基因植物的样品)中该靶转基因蛋白伴随存在一种或多种其他转基因蛋白和/或非转基因蛋白时，该一个或多个过渡离子与该替代肽组合差异检测和/或定量该靶转基因蛋白，并且不检测和/或定量该生物基质中的该一种或多种其他转基因蛋白或该非转基因蛋白。“替代肽”也可以称为该靶转基因蛋白的“特征(signature)肽”。例如，本发明的Cry1Ab替代肽产生一个或多个过渡离子，当该Cry1Ab转基因蛋白伴随存在一种或多种非Cry1Ab转基因蛋白例如本发明的eCry3.1Ab杀昆虫蛋白或mCry3A杀昆虫蛋白和/或非转基因蛋白时，其与Cry1Ab-替代肽组合差异检测和/或定量复合生物基质中的靶Cry1Ab转基因杀昆虫蛋白。在另一个实例中，本发明的eCry3.1Ab替代肽与eCry3.1Ab-替代肽组合产生一个或多个过渡离子，当在复合生物基质中该eCry3.1Ab转基因蛋白伴随存在一种或多种非eCry3.1Ab转基因蛋白例如本发明的Cry1Ab或mCry3A和/或非转基因蛋白时，其在复合生物基质中差异检测和/或定量靶eCry3.1Ab转基因蛋白。根据本发明的实施例，本发明的两种或更多种标记的替代肽可以同时用于质谱测定中，以检测和/或定量复合生物基质中的两种或多种靶转基因蛋白。

“标记的替代肽”是一种非天然存在的替代肽，其被标记使得易于在质谱测定中检测该替代肽。例如，该标记可以是稳定的同位素标记的氨基酸(SIL)，诸如赖氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或精氨酸。因此，SIL标记的替代肽具有与未标记的替代肽相同的氨基酸序列，不同之处在于该替代肽的一个或多个氨基酸被重同位素标记。例如，如本文所述，将该替代肽SAEFNNIIPSSQITQIPLTK(SEQ ID NO:21)用重赖氨酸(K)标记，并且可以被命名为SAEFNNIIPSSQITQIPLTK[C13N15-K]；将该替代肽TDVTDYHIDQV(SEQ ID NO:27)用重缬氨酸(V)标记，并可以命名为TDVTDYHIDQV[C13N15-V]；将该替代肽LQSGASVVAGPR(SEQ ID NO:252)用精氨酸(R)标记，并可以命名为LQSGASVVAGPR[C13N15-R]；将该替代肽DGGISQFIGDK(SEQ ID NO:36)用重赖氨酸(K)标记，并可以命名为DGGISQFIGDK[C13N15-K]；将该替代肽FTTGTDLK(SEQ ID NO:255)用重赖氨酸(K)标记，并可以命名为FTTGTDLK[C13N15-K]；将该替代肽SLTAAVTAAGGNATYVLDDGVPR(SEQ ID NO:257)用重精氨酸(R)标记，并可以命名为SLTAAVTAAGGNATYVLDDGVPR[C13N15-R]；将该替代肽LGLGSTLYTHLLK(SEQ ID NO:79)用重赖氨酸标记，并可以命名为LGLGSTLYTHLLK[C13N15-K]；将该替代肽SALDSQQGEPWQTIR(SEQ IDNO:89)用重精氨酸(R)标记，并可以命名为SALDSQQGEPWQTIR[C13N15-R]，依此类推。

如PCT公开号WO 87/05629中所述，“PAT”(草丁膦N-乙酰基转移酶)蛋白赋予植物对草铵膦除草剂的耐受性。本发明的PAT蛋白的示例性实例由SEQ ID NO:264表示。

“PMI”(甘露糖6-磷酸异构酶)蛋白赋予植物细胞利用甘露糖的能力，如US5767378中所述。本发明的PMI蛋白的示例性实例由SEQ ID NO:265和SEQ ID NO:266表示。

如本文使用的，术语“堆叠(stacked或stacking)”是指植物的基因组中存在掺入的多个异源多核苷酸或转基因蛋白或转基因事件。

如本文所用，“靶蛋白”是指如下蛋白，典型地是转基因蛋白，当该靶蛋白处于复合生物基质中时，旨在通过标记的替代肽进行选择性检测和/或定量。

如本文使用的，术语“转基因蛋白”意指在非天然形式、位置、生物等中产生的蛋白或肽。因此，“转基因蛋白”可以是与天然存在的蛋白具有相同的氨基酸序列的蛋白，或它可以是具有非天然存在的氨基酸序列的蛋白。例如，当在转基因植物或细菌中产生时，与来自苏云金芽孢杆菌(产生天然Cry1Ab的生物)的野生型Cry1Ab蛋白具有相同氨基酸序列的Cry1Ab蛋白是“转基因蛋白”。

核苷酸在本文中用以下标准缩写表示：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、以及鸟嘌呤(G)。氨基酸也由以下标准缩写表示：丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酰胺(Gln；Q)、谷氨酸(Glu；E)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；1)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)、以及缬氨酸(Val；V)。

本发明包括可用于进行质谱的组合物、方法和系统，用于差异检测和/或定量衍生自转基因植物的复合生物样品中的包含转基因和非转基因蛋白的混合物中的一种或多种靶转基因蛋白，例如，来自一种或多种转基因植物的叶、茎、根、花粉和种子的生物样品，每种生物样品对质谱测定结果的影响可能不同。本发明的组合物、方法和系统也可用于测试如下非转基因植物，该非转基因植物具有例如通过异花授粉而被来自邻近植物的转基因污染的风险。通过这些实施例，可以监测和限制转基因的偶然存在。在其他实施例中，本文披露的方法可用于筛选植物转化程序的结果，以鉴定表现出转基因蛋白的所需表达特征的转化体。

熟练技术人员可自行选择针对待分析的特定靶蛋白的偏好。此类蛋白可以是但不限于来自植物、动物、细菌、酵母等的那些，并且可以是见于非转化的细胞或见于转化的细胞的蛋白。在转基因植物中表达的特别适合的蛋白是赋予对除草剂、昆虫、或病毒的耐受性的那些，以及提供改进的营养价值、增加的产量、耐旱性、氮利用、生产有用的工业化合物、加工植物特征、或生物除污的潜力的基因。此类蛋白质的实例包括杀昆虫晶体蛋白(即Cry蛋白)和营养期杀昆虫蛋白(即来自苏云金芽孢杆菌的Vip)或由其衍生的工程化的蛋白(用于赋予昆虫抗性)、除草剂耐受蛋白(诸如5'-烯醇丙酮酸-3'-磷酸莽草酸合酶(EPSPS)或草丁膦乙酰转移酶(PAT)或可选择标记蛋白诸如磷酸甘露糖异构酶(PMI)。如本领域技术人员容易理解的，赋予所希望的性状的任何蛋白可以使用重组DNA技术在植物细胞中表达，并且因此可以是根据本发明的靶转基因蛋白。

更具体地，本发明提供了组合物、诊断方法和用于进行该诊断方法的系统，其允许对来自转基因植物组织(诸如叶、根、茎、花粉、种子或籽粒)的样品中的复合生物基质中的Cry1Ab、eCry3.1Ab、mCry3A、Vip3、dmEPSPS、PAT和PMI转基因蛋白进行特异性差异检测和/或定量。本发明的组合物、诊断方法和系统特别适用于在包含该转基因杀昆虫蛋白的复合生物样品中差异检测和/或定量高度相似的转基因杀昆虫蛋白，例如Cry1Ab、mCry3A和eCry3.1Ab。当前的现有技术是这样的，可商购的基于抗体的免疫测定不能用于从使用大量的Cry1Ab蛋白的氨基酸序列工程化的杂合Cry蛋白(当这两种蛋白在同一生物样品中时)示差检测Cry1Ab蛋白，这是因为在这两种类型的蛋白之间存在抗体的高度交叉反应性。例如，针对用于Cry1Ab检测免疫测定中的野生型Cry1Ab而产生的抗体与具有衍生自野生型Cry1Ab蛋白的少至27％的其氨基酸的杂合Cry蛋白(当这两种蛋白在同一生物样品中时)交叉反应。因此，例如，在这种复合生物样品中对野生型Cry1Ab的定量可能由于存在一种或多种非靶野生型Cry蛋白或非靶杂合Cry蛋白而混淆。此外，由于抗体对转基因植物产品中的Cry1Ab蛋白和杂合Cry蛋白的交叉反应性，使用所表达的蛋白质的检测用于包含野生型Cry1Ab和一种或多种本发明的杂合Cry蛋白的商品化转基因植物产品的身份保存是困难的。本文披露的方法和组合物提供了针对这些问题的解决方案，并依赖于来自靶转基因蛋白的替代肽和衍生自替代肽的过渡离子来进行靶蛋白的差异检测和/或定量，即使当该靶蛋白处于其他非常紧密相关的转基因蛋白和非转基因蛋白的混合物中。

通过质谱多反应监测测定(MRM)进行靶蛋白定量的准确性完全取决于适当替代肽的选择以及该替代肽/过渡离子组合对该靶蛋白的区分能力。可以用一种或多种来自Cry1Ab、eCry3.1Ab、mCry3A、Vip3、dmEPSPS、PAT和/或PMI蛋白的特定肽通过MRM测定同时监测和定量本发明替代肽的许多不同组合，并因此提供通过质谱鉴定和定量给定生物样品中每种靶蛋白的方法。该七种靶蛋白的替代肽可以组成盒以定量每种相应的靶蛋白，即Cry1Ab、eCry3.1Ab、mCry3A、Vip3、dmEPSPS、PAT和/或PMI。组成该盒的可用替代肽可在单个MRM测定中单独或以任何组合进行分析，或在多个MRM测定中进行分析。

本发明的替代肽结合基于MRM的测定具有众多应用，包括定量肽/蛋白质分析，用于确定不同生长阶段的表达水平，确定潜在的暴露水平以进行环境风险评估，确定食品加工中靶蛋白的不同水平，确定比较研究中的表达水平，并比较世代研究中的表达水平。从广义上讲，这七种蛋白质的独特替代肽可与MRM测定组合使用，以监测或定量可能处于特定组织(即叶、根、谷粒、花粉)中的单个转基因事件中或多个转基因事件的育种堆叠中的可选择标记物、除草剂耐受性或杀昆虫性状。

该基于MRM的测定可以定量或测量来自如下蛋白质的特定替代肽的相对或绝对水平，这些蛋白质包括Cry1Ab、eCry3.1Ab、mCry3A、Vip3、dmEPSPS、PAT和/或PMI。这些蛋白质的相对定量水平可以通过MRM测定，通过相互比较特征峰面积来确定。可以从不同样品或组织类型中定量个体Cry1Ab、eCry3.1Ab、mCry3A、Vip3、dmEPSPS、PAT和/或PMI替代肽的相对水平。通常，通过将MRM测量中的肽丰度与稳定的同位素标记的(SIL)合成肽类似物作为每种靶替代肽的内标进行比较，来确定相对定量水平。与本领域典型地教导的相反，典型地，通过掺入[¹³C₆ ¹⁵N₂]赖氨酸或[¹³C₆ ¹⁵N₄]精氨酸来标记SIL肽，但还可以包括其他氨基酸，诸如异亮氨酸和缬氨酸。该SIL标准需要具有高纯度，并应通过氨基酸分析进行定量标准化。与本领域典型地教导的相反，本发明的SIL在蛋白质消化后立即加标到样品中，从而用于校正后续的分析步骤。该SIL在液相色谱分离中与未标记的替代肽共洗脱，并显示出相同的MS/MS碎裂图谱，但由于该同位素标记，其仅质量不同。标记的替代肽和产物离子的质量偏移结果使该质谱仪区分未标记的肽和标记的肽。由于复合肽消化物通常包含多组可能被误认为该靶肽的共洗脱过渡物，因此该同位素标记的标准品的共洗脱可鉴定正确的信号，并提供最佳的保护，以防止假阳性定量。由于将已知浓度的加标SIL标准品加标到每个样品中，因此可以确定Cry1Ab、eCry3.1Ab、mCry3A、Vip3、dmEPSPS、PAT和/或PMI的来自不同靶蛋白的每种相应替代肽的相对量。由于可以相对于样品内部或样品之间另一种肽或多种肽的量进行一种或多种个体肽的相对定量，因此可以通过确定峰面积是否在该生物样品内彼此相对来确定存在的肽的相对量。从各个特征峰面积得出的不同样品之间的相对定量数据通常会归一化为每个样品分析的蛋白质的量。可以在一个样品和/或多个样品中同时对来自多种蛋白质的多种肽进行相对定量，以进一步了解一种肽/蛋白相对于其他肽/蛋白的相对蛋白量。

可以通过基于MRM的测定，通过比较一个生物样品中来自相应蛋白的个体替代肽的特征峰面积与该样品中已知数量的一种或多种内标来确定Cry1Ab、eCry3.1Ab、mCry3A、Vip3、mEPSPS、PAT和/或PMI的绝对定量水平。这可以通过将已知浓度的这些蛋白加标到不含该靶蛋白的阴性对照基质中来实现。该多重反应监测(MRM)测定包括用七种蛋白质中每种的确切加标浓度称量该非转基因样品；在裂解缓冲液中提取和均化样品；离心样品以分离可溶性和不溶性蛋白，以丰富和减少提取的复杂性；用胰蛋白酶消化可溶性蛋白样品(该组织或生物样品可以用一种或多种蛋白酶处理一段时间以充分消化该样品，该一种或多种蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白内切酶Asp-N和Lys-C)，离心样品，添加固定浓度的SIL肽(绝对定量时，该SIL用作指示剂)；通过利用阳离子交换的固相提取进行脱盐，以最小化基质效应或干扰并减少离子抑制；并且通过液相色谱与串联质谱联用分析该样品。典型地，执行典型地离子阱质谱仪或能够执行全局分析的另一种形式的质谱仪，以从单个复合蛋白/肽裂解物中鉴定出尽可能多的肽，以进行分析。尽管可以在任何类型的质谱仪上开发和执行基于MRM的测定，但通常认为MRM测定最有利的仪器平台是三重四极杆仪器平台。通过LC-MS/MS测量了对于这七种蛋白而言独特的目的替代肽和SIL。确定每种目的肽的峰面积比(替代肽的峰面积/相应的SIL肽的峰面积)。使用该峰面积比从校准曲线中反算出七种目的蛋白的浓度。可以对许多肽进行绝对定量，这允许同时在单个样品中和/或在多个样品中定量测定多种蛋白质，从而深入了解单个生物样品或大样品集中的绝对蛋白量。

在一些实施例中，本发明包括在质谱测定例如多反应监测测定中起作用以选择性地检测或定量靶转基因蛋白的标记的替代肽，所述靶转基因蛋白选自由以下组成的组：来自一种或多种转基因植物的一个或多个生物样品中的转基因蛋白和非转基因蛋白的混合物中的Cry1Ab蛋白、eCry3.1Ab蛋白、mCry3A蛋白、Vip3蛋白、双突变5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(dmEPSPS)蛋白、草丁膦乙酰转移酶(PAT)蛋白和磷酸甘露糖异构酶(PMI)蛋白，该替代肽包含标记和选自由以下组成的组的氨基酸序列：GSAQGIEGSIR(SEQ ID NO:1)、IVAQLGQGVYR(SEQ ID NO:2)、TLSSTLYR(SEQ ID NO:3)、DVSVFGQR(SEQ ID NO:4)、TYPIR(SEQ ID NO:5)、TVSQLTR(SEQ ID NO:6)、WYNTGLER(SEQ ID NO:7)、EWEADPTNPALR(SEQ IDNO:8)、VWGPDSR(SEQ ID NO:9)、APMFSWIHR(SEQ ID NO:10)、WGFDAATINSR(SEQ ID NO:11)、NQAISR(SEQ ID NO:12)、IEEFAR(SEQ ID NO:13)、SGFSNSSVSIIR(SEQ ID NO:14)、LSHVSMFR(SEQ ID NO:15)、EIYTNPVLENFDGSFR(SEQ ID NO:16)、LEGLSNLYQIYAESFR(SEQ ID NO:17)、YNQFR(SEQ ID NO:18)、YNDLTR(SEQ ID NO:19)、SPHLMDILNSITIYTDAHR(SEQ ID NO:20)、SAEFNNIIPSSQITQIPLTK(SEQ ID NO:21)、QGFSHR(SEQ ID NO:22)、MDNNPNINECIPYNCLSNPEVEVLGGER(SEQ ID NO:23)、ELTLTVLDIVSLFPNYDSR(SEQ ID NO:24)、RPFNIGINNQQLSVLDGTEFAYGTSSNLPSAVYR(SEQ ID NO:25)、SGTVDSLDEIPPQNNNVPPR(SEQ IDNO:26)、TDVTDYHIDQV(SEQ ID NO:27)、AVNELFTSSNQIGLK(SEQ ID NO:28)、ITQLPLTK(SEQID NO:29)、GLDSSTTK(SEQ ID NO:30)、QCAGIRPYDGR(SEQ ID NO:31)、IEFVPAEVTFEAEYDLER(SEQ ID NO:32)、ITQLPLVK(SEQ ID NO:33)、MTADNNTEALDSSTTK(SEQ ID NO:34)、VYIDK(SEQ ID NO:35)、DGGISQFIGDK(SEQ ID NO:36)、LITLTCK(SEQ ID NO:37)、ELLLATDLSNK(SEQ ID NO:38)、FEELTFATETSSK(SEQ ID NO:39)、EVLFEK(SEQ ID NO:40)、TASELITK(SEQID NO:41)、DVSEMFTTK(SEQ ID NO:42)、LLGLADIDYTSIMNEHLNK(SEQ ID NO:43)、IDFTK(SEQID NO:44)、TDTGGDLTLDEILK(SEQ ID NO:45)、DIMNMIFK(SEQ ID NO:46)、ALYVHK(SEQ IDNO:47)、VNILPTLSNTFSNPNYAK(SEQ ID NO:48)、ITSMLSDVIK(SEQ ID NO:49)、QNLQLDSFSTYR(SEQ ID NO:50)、DSLSEVIYGDMDK(SEQ ID NO:51)、MIVEAKPGHALIGFEISNDSITVLK(SEQ IDNO:52)、VYFSVSGDANVR(SEQ ID NO:53)、NQQLLNDISGK(SEQ ID NO:54)、VESSEAEYR(SEQ IDNO:55)、YMSGAK(SEQ ID NO:56)、DGSPADILDELTELTELAK(SEQ ID NO:57)、VYEAK(SEQ IDNO:58)、LDAINTMLR(SEQ ID NO:59)、GKPSIHLK(SEQ ID NO:60)、DENTGYIHYEDTNNNLEDYQTINK(SEQ ID NO:61)、DNFYIELSQGNNLYGGPIVHFYDVSIK(SEQ ID NO:62)、LLCPDQSEQIYYTNNIVFPNEYVITK(SEQ ID NO:63)、SQNGDEAWGDNFIILEISPSEK(SEQ IDNO:64)、NAYVDHTGGVNGTK(SEQ ID NO:65)、LDGVNGSLNDLIAQGNLNTELSK(SEQ ID NO:66)、IANEQNQVLNDVNNK(SEQ ID NO:67)、YEVTANFYDSSTGEIDLNK(SEQ ID NO:68)、QNYALSLQIEYLSK(SEQ ID NO:69)、QLQEISDK(SEQ ID NO:70)、LLSPELINTNNWTSTGSTNISGNTLTLYQGGR(SEQ ID NO:71)、YVNEK(SEQ ID NO:72)、QNYQVDK(SEQ ID NO:73)、MAGAEEIVLQPIK(SEQ ID NO:74)、FPVEDAK(SEQ ID NO:75)、EISGTVK(SEQ ID NO:76)、ILLLAALSEGTTVVDNLLNSEDVHYMLGALR(SEQ ID NO:77)、DFELPAPPRPVRPVTQI(SEQ ID NO:78)、LGLGSTLYTHLLK(SEQ ID NO:79)、MSPER(SEQ ID NO:80)、HGGWHDVGFWQR(SEQ ID NO:81)、NAYDWTVESTVYVSHR(SEQ ID NO:82)、TEPQTPQEWIDDLER(SEQ ID NO:83)、AAGYK(SEQ IDNO:84)、YPWLVAEVEGVVAGIAYAGPWK(SEQ ID NO:85)、RPVEIRPATAADMAAVCDIVNHYIETSTVNFR(SEQ ID NO:86)、ENAAGIPMDAAER(SEQ ID NO:87)、ALAILK(SEQ ID NO:88)、SALDSQQGEPWQTIR(SEQ ID NO:89)、GSQQLQLKPGESAFIAANESPVTVK(SEQ ID NO:90)、FEAKPANQLLTQPVK(SEQ ID NO:91)、STLLGEAVAK(SEQ ID NO:92)、LINSVQNYAWGSK(SEQ IDNO:93)、HNSEIGFAK(SEQ ID NO:94)、VLCAAQPLSIQVHPNK(SEQ ID NO:95)、TALTELYGMENPSSQPMAELWMGAHPK(SEQ ID NO:96)、LSELFASLLNMQGEEK(SEQ ID NO:97)和QGAELDFPIPVDDFAFSLHDLSDK(SEQ ID NO:98)。在其他实施例中，通过掺入稳定的同位素标记的(SIL)氨基酸来标记该替代肽。在其他实施例中，通过掺入[¹³C₆ ¹⁵N₂]赖氨酸、[¹³C₆ ¹⁵N₂]异亮氨酸、[¹³C₆ ¹⁵N₂]缬氨酸或[¹³C₆ ¹⁵N₂]精氨酸来标记该SIL肽。

在一些实施例中，所述标记的替代肽选择性地检测或定量转基因和非转基因蛋白混合物中的Cry1Ab蛋白，并包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：GSAQGIEGSIR(SEQ IDNO:1)、IVAQLGQGVYR(SEQ ID NO:2)、TLSSTLYR(SEQ ID NO:3)、DVSVFGQR(SEQ ID NO:4)、TYPIR(SEQ ID NO:5)、TVSQLTR(SEQ ID NO:6)、WYNTGLER(SEQ ID NO:7)、EWEADPTNPALR(SEQ ID NO:8)、VWGPDSR(SEQ ID NO:9)、APMFSWIHR(SEQ ID NO:10)、WGFDAATINSR(SEQ IDNO:11)、NQAISR(SEQ ID NO:12)、IEEFAR(SEQ ID NO:13)、SGFSNSSVSIIR(SEQ ID NO:14)、LSHVSMFR(SEQ ID NO:15)、EIYTNPVLENFDGSFR(SEQ ID NO:16)、LEGLSNLYQIYAESFR(SEQ IDNO:17)、YNQFR(SEQ ID NO:18)、YNDLTR(SEQ ID NO:19)、SPHLMDILNSITIYTDAHR(SEQ IDNO:20)、SAEFNNIIPSSQITQIPLTK(SEQ ID NO:21)、QGFSHR(SEQ ID NO:22)、MDNNPNINECIPYNCLSNPEVEVLGGER(SEQ ID NO:23)、ELTLTVLDIVSLFPNYDSR(SEQ ID NO:24)、RPFNIGINNQQLSVLDGTEFAYGTSSNLPSAVYR(SEQ ID NO:25)和SGTVDSLDEIPPQNNNVPPR(SEQ IDNO:26)。

在其他实施方案中，本发明的Cry1Ab特异性标记的替代肽产生具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的过渡离子：GIEGSIR(SEQ ID NO:99)、EGSIR(SEQ ID NO:100)、AQLGQGVYR(SEQ ID NO:101)、GQGVYR(SEQ ID NO:102)；SSTLYR(SEQ ID NO:103)、STLYR(SEQ ID NO:104)、SVFGQR(SEQ ID NO:105)、FGQR(SEQ ID NO:106)、PIR、TY、SQLTR(SEQ IDNO:107)、QLTR(SEQ ID NO:108)、NTGLER(SEQ ID NO:109)、YNTGLER(SEQ ID NO:110)、PTNPALR(SEQ ID NO:111)、DPTNPALR(SEQ ID NO:112)、GPDSR(SEQ ID NO:113)、VW、HR、SWIHR(SEQ ID NO:114)、ATINSR(SEQ ID NO:115)、DAATINSR(SEQ ID NO:116)、AISR(SEQID NO:117)、ISR、EFAR(SEQ ID NO:118)、EEFAR(SEQ ID NO:119)、SNSSVSIIR(SEQ ID NO:120)、SSVSIIR(SEQ ID NO:121)、SMFR(SEQ ID NO:122)、VSMFR(SEQ ID NO:123)、ENFDGSFR(SEQ ID NO:124)、GSFR(SEQ ID NO:125)、YAESFR(SEQ ID NO:126)、LEG、NQFR(SEQ ID NO:127)、QFR、DLTR(SEQ ID NO:128)、NDLTR(SEQ ID NO:129)、TIYTDAHR(SEQ ID NO:130)、YTDAHR(SEQ ID NO:131)、PLTK(SEQ ID NO:132)、SAEFNNII(SEQ ID NO:133)、FSHR(SEQ IDNO:134)、GFSHR(SEQ ID NO:135)、EVLGGER(SEQ ID NO:136)、GGER(SEQ ID NO:137)、FPNYDSR(SEQ ID NO:138)、PNYDSR(SEQ ID NO:139)、PSAVYR(SEQ ID NO:140)、YR、PPR和SGTVDSLDE(SEQ ID NO:141)。

在仍其他实施例中，本发明的Cry1Ab特异性标记的替代肽包含氨基酸序列SAEFNNIIPSSQITQIPLTK(SEQ ID NO:21)，并产生由氨基酸序列PLTK(SEQ ID NO:132)或SAEFNNII(SEQ ID NO:133)组成的过渡离子。

在一些实施例中，本发明的标记的替代肽选择性地检测或定量eCry3.1Ab蛋白，并包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：TDVTDYHIDQV(SEQ ID NO:27)、AVNELFTSSNQIGLK(SEQ ID NO:28)、ITQLPLTK(SEQ ID NO:29)、GLDSSTTK(SEQ ID NO:30)、QCAGIRPYDGR(SEQID NO:31)和IEFVPAEVTFEAEYDLER(SEQ ID NO:32)。

在其他实施例中，该eCry3.1Ab特异性标记的替代肽产生具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的过渡离子：TDYHIDQV(SEQ ID NO:142)、DYHIDQV(SEQ ID NO:143)、TSSNQIGLK(SEQ ID NO:144)、SSNQIGLK(SEQ ID NO:145)、QLPLTK(SEQ ID NO:146)、TQLPLTK(SEQ ID NO:147)、DSSTTK(SEQ ID NO:148)、SSTTK(SEQ ID NO:149)、PYDGR(SEQID NO:150)、DGR、IEF和LER。

在仍其他实施例中，本发明的eCry3.1Ab特异性标记的替代肽包含氨基酸序列TDVTDYHIDQV(SEQ ID NO:27)，并产生由氨基酸序列TDYHIDQV(SEQ ID NO:142)或DYHIDQV(SEQ ID NO:143)组成的过渡离子。

在一些实施例中，该标记的替代肽选择性地检测或定量mCry3A蛋白，并包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：ITQLPLVK(SEQ ID NO:33)、MTADNNTEALDSSTTK(SEQ ID NO:34)、VYIDK(SEQ ID NO:35)和LQSGASVVAGPR(SEQ ID NO:252)。

在其他实施例中，该mCry3A特异性替代肽产生具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的过渡离子：QLPLVK(SEQ ID NO:151)、TQLPLVK(SEQ ID NO:152)、ALDSSTTK(SEQ IDNO:153)、EALDSSTTK(SEQ ID NO:154)、YIDK(SEQ ID NO:155)和IDK。

在仍其他实施例中，本发明的mCry3A特异性标记的替代肽包含氨基酸序列LQSGASVVAGPR(SEQ ID NO:252)，并产生由氨基酸序列SGASVVAGPR(SEQ ID NO:253)或SVVAGPR(SEQ ID NO:254)组成的过渡离子。

在一些实施例中，本发明的标记的替代肽选择性地检测或定量Vip3A蛋白，并包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：DGGISQFIGDK(SEQ ID NO:36)、LITLTCK(SEQ ID NO:37)、ELLLATDLSNK(SEQ ID NO:38)、FEELTFATETSSK(SEQ ID NO:39)、EVLFEK(SEQ ID NO:40)、TASELITK(SEQ ID NO:41)、DVSEMFTTK(SEQ ID NO:42)、LLGLADIDYTSIMNEHLNK(SEQ IDNO:43)、IDFTK(SEQ ID NO:44)、TDTGGDLTLDEILK(SEQ ID NO:45)、DIMNMIFK(SEQ ID NO:46)、ALYVHK(SEQ ID NO:47)、VNILPTLSNTFSNPNYAK(SEQ ID NO:48)、ITSMLSDVIK(SEQ IDNO:49)、QNLQLDSFSTYR(SEQ ID NO:50)、DSLSEVIYGDMDK(SEQ ID NO:51)、MIVEAKPGHALIGFEISNDSITVLK(SEQ ID NO:52)、VYFSVSGDANVR(SEQ ID NO:53)、NQQLLNDISGK(SEQ ID NO:54)、VESSEAEYR(SEQ ID NO:55)、YMSGAK(SEQ ID NO:56)、DGSPADILDELTELTELAK(SEQ ID NO:57)、VYEAK(SEQ ID NO:58)、LDAINTMLR(SEQ ID NO:59)、GKPSIHLK(SEQ ID NO:60)、DENTGYIHYEDTNNNLEDYQTINK(SEQ ID NO:61)、DNFYIELSQGNNLYGGPIVHFYDVSIK(SEQ ID NO:62)、LLCPDQSEQIYYTNNIVFPNEYVITK(SEQ IDNO:63)、SQNGDEAWGDNFIILEISPSEK(SEQ ID NO:64)、NAYVDHTGGVNGTK(SEQ ID NO:65)、LDGVNGSLNDLIAQGNLNTELSK(SEQ ID NO:66)、IANEQNQVLNDVNNK(SEQ ID NO:67)、YEVTANFYDSSTGEIDLNK(SEQ ID NO:68)、QNYALSLQIEYLSK(SEQ ID NO:69)、QLQEISDK(SEQID NO:70)、LLSPELINTNNWTSTGSTNISGNTLTLYQGGR(SEQ ID NO:71)、YVNEK(SEQ ID NO:72)、QNYQVDK(SEQ ID NO:73)和FTTGTDLK(SEQ ID NO:255)。

在其他实施例中，该Vip3A特异性标记的替代肽产生具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的过渡离子：SQFIGDK(SEQ ID NO:156)、GDK、TLTCK(SEQ ID NO:157)、TCK、ATDLSNK(SEQ ID NO:158)、LATDLSNK(SEQ ID NO:159)、TFATETSSK(SEQ ID NO:160)、FATETSSK(SEQ ID NO:161)、FEK、LFEK(SEQ ID NO:162)、SELITK(SEQ ID NO:163)、ASELITK(SEQ ID NO:164)、SEMFTTK(SEQ ID NO:165)、DVS、IMNEHLNK(SEQ ID NO:166)、MNEHLNK(SEQ ID NO:167)、DFTK(SEQ ID NO:168)、FTK、TLDEILK(SEQ ID NO:169)、LTLDEILK(SEQID NO:170)、MNMIFK(SEQ ID NO:171)、NMIFK(SEQ ID NO:172)、YVHK(SEQ ID NO:173)、HK、VNI、VNIL(SEQ ID NO:174)、SMLSDVIK(SEQ ID NO:175)、TSMLSDVIK(SEQ ID NO:176)、DSFSTYR(SEQ ID NO:177)、LDSFSTYR(SEQ ID NO:178)、IYGDMDK(SEQ ID NO:179)、VIYGDMDK(SEQ ID NO:180)、SNDSITVLK(SEQ ID NO:181)、MIV、SGDANVR(SEQ ID NO:182)、SVSGDANVR(SEQ ID NO:183)、LLNDISGK(SEQ ID NO:184)、LNDISGK(SEQ ID NO:185)、SSEAEYR(SEQ ID NO:186)、ESSEAEYR(SEQ ID NO:187)、SGAK(SEQ ID NO:188)、MSGAK(SEQID NO:189)、TELTELAK(SEQ ID NO:190)、DGSPADI(SEQ ID NO:191)、YEAK(SEQ ID NO:192)、EAK、NTMLR(SEQ ID NO:193)、AINTMLR(SEQ ID NO:194)、PSIHLK(SEQ ID NO:195)、HLK、DYQTINK(SEQ ID NO:196)、NK、DNF、DNFY(SEQ ID NO:197)、PNEYVITK(SEQ ID NO:198)、LLC、SPSEK(SEQ ID NO:199)、LEISPSEK(SEQ ID NO:200)、NAY、DHTGGVNGTK(SEQ IDNO:201)、GNLNTELSK(SEQ ID NO:202)、NTELSK(SEQ ID NO:203)、LNDVNNK(SEQ ID NO:204)、NDVNNK(SEQ ID NO:205)、YE、DLNK(SEQ ID NO:206)、QIEYLSK(SEQ ID NO:207)、LQIEYLSK(SEQ ID NO:208)、SDK、QEISDK(SEQ ID NO:209)、YQGGR(SEQ ID NO:210)、TLYQGGR(SEQ ID NO:211)、NEK、VNEK(SEQ ID NO:212)、DK和VDK。

在仍其他实施例中，本发明的Vip3A特异性标记的替代肽包含氨基酸序列FTTGTDLK(SEQ ID NO:255)，并产生由氨基酸序列TGTDLK(SEQ ID NO:256)和LK组成的过渡离子。

在一些实施例中，本发明的标记的替代肽选择性地检测或定量dmEPSPS蛋白，并包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：MAGAEEIVLQPIK(SEQ ID NO:74)、FPVEDAK(SEQ IDNO:75)、EISGTVK(SEQ ID NO:76)、ILLLAALSEGTTVVDNLLNSEDVHYMLGALR(SEQ ID NO:77)和SLTAAVTAAGGNATYVLDGVPR(SEQ ID NO:257)。

在其他实施例中，该EPSPS特异性标记的替代肽产生具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的过渡离子：PIK、EIVLQPIK(SEQ ID NO:213)、PVEDAK(SEQ ID NO:214)、VEDAK(SEQ ID NO:215)、SGTVK(SEQ ID NO:216)、GTVK(SEQ ID NO:217)、ILLLAA(SEQ ID NO:218)和HYMLGALR(SEQ ID NO:219)。

在仍其他实施例中，本发明的dmEPSPS特异性标记的替代肽包含氨基酸序列SLTAAVTAAGGNATYVLDGVPR(SEQ ID NO:257)，并产生由氨基酸序列PR和GVPR(SEQ ID NO:258)组成的过渡离子。

在一些实施例中，本发明的标记的替代肽选择性地检测或定量PAT蛋白，并包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：DFELPAPPRPVRPVTQI(SEQ ID NO:78)、LGLGSTLYTHLLK(SEQ ID NO:79)、MSPER(SEQ ID NO:80)、HGGWHDVGFWQR(SEQ ID NO:81)、NAYDWTVESTVYVSHR(SEQ ID NO:82)、TEPQTPQEWIDDLER(SEQ ID NO:83)、AAGYK(SEQ ID NO:84)、YPWLVAEVEGVVAGIAYAGPWK(SEQ ID NO:85)和RPVEIRPATAADMAAVCDIVNHYIETSTVNFR(SEQ ID NO:86)。

在其他实施例中，该PAT特异性标记的替代肽产生具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的过渡离子：DFE、DF、YTHLLK(SEQ ID NO:220)、THLLK(SEQ ID NO:221)、PER、SPER(SEQ ID NO:222)、GFWQR(SEQ ID NO:223)、VGFWQR(SEQ ID NO:224)、STVYVSHR(SEQ IDNO:225)、SHR、TEPQT(SEQ ID NO:226)、DLER(SEQ ID NO:227)、GYK、AGYK(SEQ ID NO:228)、GPWK(SEQ ID NO:229)、GIAYAGPWK(SEQ ID NO:230)、TSTVNFR(SEQ ID NO:231)和NFR。

在仍其他实施例中，该PAT特异性标记的替代肽包含氨基酸序列LGLGSTLYTHLLK(SEQ ID NO:79)，并产生由氨基酸序列YTHLLK(SEQ ID NO:220)或THLLK(SEQ ID NO:221)组成的过渡离子。

在一些实施例中，本发明的标记的替代肽选择性地检测或定量PMI蛋白，并包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：ENAAGIPMDAAER(SEQ ID NO:87)、ALAILK(SEQ ID NO:88)、SALDSQQGEPWQTIR(SEQ ID NO:89)、GSQQLQLKPGESAFIAANESPVTVK(SEQ ID NO:90)、FEAKPANQLLTQPVK(SEQ ID NO:91)、STLLGEAVAK(SEQ ID NO:92)、LINSVQNYAWGSK(SEQ IDNO:93)、HNSEIGFAK(SEQ ID NO:94)、VLCAAQPLSIQVHPNK(SEQ ID NO:95)、TALTELYGMENPSSQPMAELWMGAHPK(SEQ ID NO:96)、LSELFASLLNMQGEEK(SEQ ID NO:97)和QGAELDFPIPVDDFAFSLHDLSDK(SEQ ID NO:98)。

在其他实施例中，该PMI特异性标记的替代肽产生具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的过渡离子：PMDAAER(SEQ ID NO:232)、GIPMDAAER(SEQ ID NO:233)、AILK(SEQID NO:234)、LK、PWQTIR(SEQ ID NO:235)、GEPWQTIR(SEQ ID NO:236)、ANESPVTVK(SEQ IDNO:237)、PVTVK(SEQ ID NO:238)、LTQPVK(SEQ ID NO:239)、PVK、GEAVAK(SEQ ID NO:240)、LGEAVAK(SEQ ID NO:241)、QNYAWGSK(SEQ ID NO:242)、NYAWGSK(SEQ ID NO:243)、NSEIGFAK(SEQ ID NO:244)、HN、VLCAAQ(SEQ ID NO:245)、PNK、WMGAHPK(SEQ ID NO:246)、TALTE(SEQ ID NO:247)、NMQGEEK(SEQ ID NO:248)、LNMQGEEK(SEQ ID NO:249)、SLHDLSDK(SEQ ID NO:250)和HDLSDK(SEQ ID NO:251)。

在仍其他实施例中，该PMI特异性替代肽包含氨基酸序列SALDSQQGEPWQTIR(SEQID NO:89)，并产生由氨基酸序列PWQTIR(SEQ ID NO:235)或GEPWQTIR(SEQ ID NO:236)组成的过渡离子。

根据一些实施例，本发明的Cry1Ab特异性标记的替代肽检测和/或定量包含SEQID NO:259的氨基酸序列的Cry1Ab蛋白。在其他实施例中，该Cry1Ab蛋白来自该转基因玉米事件Bt11。

在一些实施例中，本发明的eCry3.1Ab特异性标记的替代肽检测和/或定量包含SEQ ID NO:260的氨基酸序列的eCry3.1Ab蛋白。在其他实施例中，该eCry3.1Ab蛋白来自转基因玉米事件5307。

根据一些实施例，本发明的mCry3A特异性标记的替代肽检测和/或定量包含SEQID NO:261的氨基酸序列的mCry3A蛋白。在其他实施例中，该mCry3A蛋白来自该转基因玉米事件MIR604。

根据一些实施例，本发明的Vip3特异性标记的替代肽检测和/或定量包含SEQ IDNO:262的氨基酸序列的Vip3Aa蛋白。在其他实施例中，该Vip3Aa蛋白来自该转基因玉米事件MIR162。

根据一些实施例，本发明的dmEPSPS特异性标记的替代肽检测和/或定量包含SEQID NO:263的氨基酸序列的dmEPSPS蛋白。在其他实施例中，该dmEPSPS蛋白来自该转基因玉米事件GA21。

根据一些实施例，本发明的PAT特异性标记的替代肽检测和/或定量包含SEQ IDNO:264的氨基酸序列的PAT蛋白。在其他实施例中，该PAT蛋白来自该转基因玉米事件Bt11、59122、TC1507、DP4114或T25。

根据一些实施例，本发明的PMI特异性标记的替代肽检测和/或定量包含SEQ IDNO:265或SEQ ID NO:266的氨基酸序列的PMI蛋白。在其他实施例中，该PMI蛋白来自该转基因玉米事件MIR162、MIR604、5307或3272。

在一些实施例中，本发明的标记的替代肽特异性地检测或定量转基因蛋白的混合物中的Cry1Ab蛋白、eCry3.1Ab蛋白、mCry3A蛋白、Vip3蛋白、dmEPSPS蛋白、PAT蛋白或PMI蛋白，该转基因蛋白包含至少两种选自由以下组成的组的转基因蛋白：Cry1Ab蛋白、eCry3.1Ab蛋白、mCry3A蛋白、Vip3A蛋白、dmEPSPS蛋白、PAT蛋白和PMI蛋白。在其他实施例中，转基因蛋白的混合物包含Cry1Ab蛋白、eCry3.1Ab蛋白、mCry3A蛋白、Vip3A蛋白、dmEPSPS蛋白、PAT蛋白和PMI蛋白。在仍其他实施例中，转基因蛋白的混合物进一步包含选自由以下组成的组的至少一种转基因蛋白：Cry1A.105蛋白(SEQ ID NO:267)、Cry1F蛋白(SEQ ID NO:268)、Cry34蛋白(SEQ ID NO:269)和Cry35蛋白(SEQ ID NO:270)。

在一些实施例中，本发明的标记的替代肽特异性地检测或定量来自转基因植物的生物样品中的蛋白转基因混合物中的Cry1Ab蛋白、eCry3.1Ab蛋白、mCry3A蛋白、Vip3蛋白、dmEPSPS蛋白、PAT蛋白或PMI蛋白，其中该转基因植物是玉米植物、大豆植物、棉花植物、水稻植物、小麦植物或卡诺拉油菜植物。在其他实施例中，该转基因植物是玉米植物，其包含选自由以下组成的组的转基因事件：事件Bt11、事件5307、事件MIR604、事件MIR162、事件3272和事件GA21。在仍其他实施例中，该转基因玉米植物进一步包含事件MON89034、事件DP4114、事件TC1507、事件59122或事件T25。

在一些实施例中，本发明的标记的替代肽特异性地检测或定量来自转基因植物的叶组织、种子、籽粒、花粉或根组织的生物样品中的Cry1Ab蛋白、eCry3.1Ab蛋白、mCry3A蛋白、Vip3蛋白、dmEPSPS蛋白、PAT蛋白或PMI蛋白。在其他实施例中，该叶组织、种子、籽粒、花粉或根组织来自转基因玉米植物，其包含一种或多种该转基因玉米事件Bt11、5307、MIR604、MIR162、GA21、3272、59122、DP4114、TC1507和T25。

本领域中有许多参考文献提出了许多不同的方法来预测哪种替代肽对于任何给定的靶蛋白而言是最佳的，许多参考文献提出了使用质谱定量靶蛋白的捷径，例如Mead等人2009.Mol.Cell.Proteomics[分子和细胞的蛋白质组学]8:696-705和美国专利号8,227,252。但是，对此类预测方法和捷径的依赖会导致混淆结果，因为不可预测的因素会干扰基于质谱的测定，从而导致灵敏度损失和定量结果不准确。至少一个主要因素在于生物基质本身。例如，从与来自转基因植物的叶、根、花粉和种子的生物样品同样有效的替代肽中鉴定出单个过渡离子是非常不可预测且困难的。该基质的化学组成、pH或离子强度的差异可能会影响MS仪器中的蛋白水解、肽稳定性、聚集或电离。因此，必须鉴定和凭经验测试所有相关基质(特别是转基因植物的基质)的替代肽和特定替代肽/过渡离子组合，以克服此类测定的不可预测的性质。本发明在开发质谱测定中采用了两步途径，以特异性地检测和/或定量靶转基因蛋白，包括1)从蛋白水解切割的靶蛋白衍生的肽库中测试和选择替代肽，以及测试SIL替代肽和过渡离子肽的组合，并选择能在所有生物基质(例如来自转基因植物的叶、根、花粉或种子的生物样品)中特异性检测和定量该靶蛋白的组合；以及2)根据经验确定适合所有生物基质(包括转基因植物，特别是转基因玉米植物的叶、根、花粉和种子)中所有替代肽和替代肽/过渡离子组合的样品制备方法和质谱条件。

因此，在一些实施例中，本发明包括同时检测和/或定量来自转基因植物的包含靶转基因蛋白和非转基因蛋白的混合物的复合生物样品中的一种或多种靶转基因蛋白的方法，其中该方法包括以下步骤：a)从转基因植物中获得生物样品；b)从所述生物样品中提取蛋白，得到包含蛋白的混合物的提取物；c)减少步骤b的提取物中非转基因不溶性蛋白的量，得到浓缩的可溶性蛋白的提取物；d)消化步骤c的提取物中的可溶性蛋白，得到包含肽碎片的提取物，其中所述肽碎片包含至少一种对每种靶转基因蛋白具有特异性的未标记的替代肽；e)浓缩步骤d的提取物中的肽碎片；f)添加一种或多种本发明的标记的替代肽，其中每种标记的替代肽具有与衍生自该靶转基因蛋白的每种未标记的替代肽相同的氨基酸序列，并且其中添加的标记的替代肽的数目等于该混合物中靶转基因蛋白的数目；g)通过减少所述混合物中非替代肽的量来浓缩所述未标记的替代肽和所述标记的替代肽；h)通过液相色谱使步骤g的所述肽碎片混合物分解；i)通过质谱分析从步骤h得到的所述肽碎片混合物，其中检测到未标记的替代肽的过渡离子碎片指示存在衍生所述替代肽的靶转基因蛋白；以及，任选地，j)通过比较由步骤i的所述过渡离子碎片产生的质谱信号与由标记的替代肽的过渡离子产生的质谱信号，计算所述生物样品中靶转基因蛋白的量。

在一些实施例中，通过上述方法检测和/或定量的靶转基因蛋白是Cry1Ab蛋白、eCry3.1Ab蛋白、mCry3A蛋白、Vip3蛋白、双突变5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(dmEPSPS)蛋白、草丁膦乙酰转移酶(PAT)蛋白或磷酸甘露糖异构酶(PMI)蛋白。

在本发明的方法涵盖的其他实施例中，该靶转基因蛋白是Cry1Ab，并且该标记的替代肽包含氨基酸序列SAEFNNIIPSSQITQIPLTK(SEQ ID NO:21)，并产生由氨基酸序列PLTK(SEQ ID NO:132)或SAEFNNII(SEQ ID NO:133)组成的过渡离子。在仍其他实施例中，通过比较由氨基酸序列PLTK(SEQ ID NO:132)组成的未标记的和标记的过渡离子产生的质谱信号，对该Cry1Ab靶蛋白进行定量。

在本发明的方法涵盖的其他实施例中，该靶转基因蛋白是eCry3.1Ab，并且该标记的替代肽包含氨基酸序列TDVTDYHIDQV(SEQ ID NO:27)，并产生由氨基酸序列TDYHIDQV(SEQ ID NO:142)或DYHIDQV(SEQ ID NO:143)组成的过渡离子。在仍其他实施例中，通过比较由氨基酸序列TDYHIDQV(SEQ ID NO:142)组成的未标记的和标记的过渡离子产生的质谱信号，对该eCry3.1Ab靶蛋白进行定量。

在本发明的方法涵盖的其他实施例中，该靶转基因蛋白是mCry3A，并且该标记的替代肽包含氨基酸序列LQSGASVVAGPR(SEQ ID NO:252)，并产生由氨基酸序列SGASVVAGPR(SEQ ID NO:253)或SVVAGPR(SEQ ID NO:254)组成的过渡离子。在仍其他实施例中，通过比较由氨基酸序列SGASVVAGPR(SEQ ID NO:253)组成的未标记的和标记的过渡离子产生的质谱信号，对该mCry3A靶蛋白进行定量。

在本发明的方法涵盖的其他实施例中，该靶转基因蛋白是Vip3A，并且该标记的替代肽包含氨基酸序列FTTGTDLK(SEQ ID NO:255)，并产生由氨基酸序列TGTDLK(SEQ ID NO:256)或LK组成的过渡离子。在仍其他实施例中，通过比较由氨基酸序列TGTDLK(SEQ ID NO:256)组成的未标记的和标记的过渡离子产生的质谱信号，对该Vip3A靶蛋白进行定量。

在本发明的方法涵盖的其他实施例中，该靶转基因蛋白是dmEPSPS，并且该标记的替代肽包含氨基酸序列SLTAAVTAAGGNATYVLDGVPR(SEQ ID NO:257)，并产生由氨基酸序列PR或GVPR(SEQ ID NO:258)组成的过渡离子。在仍其他实施例中，通过比较由氨基酸序列PR组成的未标记的和标记的过渡离子产生的质谱信号，对该eCry3.1Ab靶蛋白进行定量。

在本发明的方法涵盖的其他实施例中，该靶转基因蛋白是PAT，并且该标记的替代肽包含氨基酸序列LGLGSTLYTHLLK(SEQ ID NO:79)，并产生由氨基酸序列YTHLLK(SEQ IDNO:220)或THLLK(SEQ ID NO:221)组成的过渡离子。在仍其他实施例中，通过比较由氨基酸序列YTHLLK(SEQ ID NO:220)组成的未标记的和标记的过渡离子产生的质谱信号，对该PAT靶蛋白进行定量。

在本发明的方法涵盖的其他实施例中，该靶转基因蛋白是PMI，并且该标记的替代肽包含氨基酸序列SALDSQQGEPWQTIR(SEQ ID NO:89)，并产生由氨基酸序列PWQTIR(SEQ IDNO:235)或GEPWQTIR(SEQ ID NO:236)组成的过渡离子。在仍其他实施例中，通过比较由氨基酸序列PWQTIR(SEQ ID NO:235)组成的未标记的和标记的过渡离子产生的质谱信号，对该PMI靶蛋白进行定量。

在其他实施例中，本发明包括用于高通量检测或定量转基因靶蛋白的系统。这样的系统包含对该转基因靶蛋白具有特异性的预先设计的标记的替代肽的盒；和一个或多个质谱仪。在该实施例的一方面，该盒包含对选自由以下组成的组的靶蛋白具有特异性的标记的替代肽：Cry1Ab、eCry3.1Ab、mCry3A、Vip3、dmEPSPS、PAT和PMI。在该实施例的其他方面，该标记的替代肽包含SEQ ID NO:1-98中的任一个。在该实施例的其他方面，该标记的替代肽产生一个或多个过渡离子，其包含选自由SEQ ID NO:99-251、SEQ ID NO:254、255、256，肽PIR、TY、VW、HR、ISR、LEG、QFR、YR、PPR、DGR、IEF、LER、IDK、GDK、TCK、FEK、DVS、FTK、HK、VNI、MIV、EAK、HLK、NK、DNF、LLC、NAY、YE、SDK、NEK、DK、VDK、PIK、DFE、DF、PER、SHR、GYK、NFR、LK、PVK、HN、PNK和PR中至少一个组成的组的肽序列。

包括以下特定实例，以说明本发明的优选实施例。本领域技术人员应当理解，以下实例中披露的技术代表本发明人发现的在本发明的实践中良好地起作用的技术，因此可以认为构成本发明实践的优选模式。然而，根据本披露，本领域技术人员应当理解，可以在所披露的特定实施例中进行许多改变，并且在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下仍可获得相似或类似的结果。更具体地，将清楚的是，化学和生理学均相关的某些药剂可以用本文描述的药剂取代，同时实现相同或相似的结果。对于本领域技术人员而言清楚的所有此类类似取代和修改被认为在如所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念之内。

实例

实例1-替代肽选择

基于MRM的测定依赖于选择一组预定的肽，并取决于每种选择的替代肽的特定碎裂/过渡离子。选择合适的替代或特征肽需要几个标准。首先，必须选择构成该靶向蛋白盒的蛋白质。其次，对于每种靶蛋白，必须鉴定出表现出良好质谱响应并独特地鉴定该靶蛋白或其特异性修饰(即，翻译后修饰)的那些肽。第三，对于每种质谱合适的肽，必须鉴定出那些提供最佳信号强度并将该替代肽与该样品中存在的其他肽种类独特地区分开的过渡离子。这些标准对于执行基于MRM的测定至关重要。

鉴定并选择了来自七种转基因蛋白Cry1Ab、eCry3.1Ab、mCry3A、Vip3A、dmEPSPS、PAT和PMI的替代肽，用于基于MRM的测定。使用微生物产生的蛋白开发了该MRM测定，这些微生物产生的蛋白用胰蛋白酶消化。用水将微生物产生的蛋白分别重构。然后将三氟乙醇(TFE)添加到每种蛋白质的等分试样中，然后添加100mM碳酸氢铵和胰蛋白酶(1:10(w:w)酶:蛋白比例)。将该样品在约37℃下消化过夜，然后添加约0.05M的三(2-羧乙基)膦(TCEP)。等分每种蛋白质以形成终浓度为约200pmol/μL的库。将该肽混合物用于在QTRAP6500质谱仪(爱博才思公司(AB Sciex LLC)，弗雷明汉，美国马萨诸塞州)上开发该MRM测定。使用选择的反应监测MS/MS确定每种肽的最佳的两个过渡(由质谱仪监测的肽替代物和碎片离子质荷比(m/z)的组合)。通过针对每种肽计算双电荷和三电荷肽离子以及第一和第二y碎片离子(其m/z大于[m/z(替代)+20Da])的特征质量来开发该MS/MS方法。如果在该MRM扫描过程中观察到这些计算的过渡，则该仪器将自动切换到MS/MS模式，并获得该替代肽离子的完整MS/MS谱。对于每种获得的肽，确定了该MS/MS谱中两个最强的碎片离子(仅b或y碎片离子)及其洗脱时间。然后针对每个选定的过渡优化碰撞能量(CE)。所开发的MRM测定用于校准曲线样品的分析。

该MRM测定靶向来自7种转基因蛋白的193种蛋白型肽(proteotypic peptide)。其中，111种肽是对于这7种蛋白而言独特的，并且与已知的玉米蛋白不重叠。表1列出了每种靶蛋白的替代肽和过渡离子的特征，包括氨基酸序列(包括包含至少四个氨基酸的肽的序列表标识符)、单同位素质量、特征电荷状态、特征m/z和产物过渡m/z。鉴定了所有七种蛋白的独特替代肽；Cry1Ab(26)、eCry3.1Ab(6)、mCry3A(4)、Vip3Aa20(39)、dmEPSPS(5)、PAT(9)和PMI(12)。这些来自Cry1Ab、eCry3.1Ab、mCry3A、Vip3A、dmEPSPS、PAT和PMI的替代肽经鉴定可用于确定Cry1Ab、eCry3.1Ab、mCry3A、Vip3A、dmEPSPS、PAT和PMI转基因蛋白的绝对或相对量。表1列出的这些肽或肽组合中的每一种均通过质谱在裂解物中检测到，并且是基于MRM的测定中用于定量Cry1Ab、eCry3.1Ab、mCry3A、Vip3A、dmEPSPS、PAT和PMI的潜在候选物。

表1.替代肽和过渡离子的特征。

鉴定了靶蛋白Cry1Ab、eCry3.1Ab、mCry3A、Vip3A、dmEPSPS、PAT和PMI的多种潜在替代肽后，根据提供最佳信号强度并具有将该靶替代肽与生物样品基质(例如，玉米叶、根、花粉或谷粒(种子))中存在的其他种类中区分开的能力的过渡离子进一步选择个体替代肽。这既包括基质干扰(即基质干扰是在目的肽处或附近检测到的该基质中的一种或多种特定成分)和潜在的遗留物(即遗留物是由于该样品分析系统的化学/物理特性或二者，先前注入的样品在后续分析中洗脱的结果)。包含该个体替代肽的盒的这些优化过渡组成了整个MRM测定。在本披露中，对来自Cry1Ab、eCry3.1Ab、mCry3A、Vip3A、dmEPSPS、PAT和PMI的提供了最高的灵敏度(最强的碎片)并且具有期望的特异性的那些替代肽进行进一步选择以组成替代肽的盒，用于定量该七种靶向蛋白。表2列出了每种靶蛋白Cry1Ab、eCry3.1Ab、mCry3A、Vip3Aa20 dmEPSPS、PAT和PMI的优选替代肽，以及相应的稳定同位素标记的(SIL)肽。替代肽的盒包含要同时监测和/或定量的肽中的一种或多种。具有每种肽的特异性碎裂/过渡离子的替代肽的该盒可用于MRM测定，以定量相应的靶蛋白。

表2.特异性地检测靶蛋白的替代肽和SIL肽。

实例2-用于在转基因植物组织中检测转基因蛋白的测定

开发直接检测靶蛋白的灵敏方法对于在生物基质(诸如转基因植物的组织，例如叶、谷粒、根和花粉组织)中进行定量评估非常需要。多反应监测(MRM)质谱已成为用以通过液相色谱(LC)与串联质谱(MS/MS/)联用定量给定样品中多种蛋白质的有前途的平台。MRM测定利用蛋白水解肽的序列特异性串联MS碎裂，从而为不同的靶蛋白提供高度选择性和特异性的测量。尽管取得了这些进展，但要对低丰度蛋白或具有影响分离的特定理化性质的蛋白进行准确的定量测量仍然具有挑战性。

典型地在三重四极杆质谱仪上进行MRM测定，尽管该方法也可以在离子阱仪器中应用，在该离子阱仪器上，特征离子碎裂后，在限定质量范围内或在整个质量范围内在碎片离子上采集MS/MS数据。一系列的过渡(特征/碎片离子m/z对)与该靶向肽的保留时间组合可以构成MRM测定。为了实现最佳的MRM测定，(1)需要选择靶蛋白/肽；(2)替代肽必须产生良好的MS和MS/MS信号；(3)每个选择的肽碎片离子必须提供最佳的信号强度，并将该靶肽与该复合生物样品中存在的其他肽种类区分开。总的来说，替代肽和碎片离子为肽选择提供了高特异性，因为只记录了所需的过渡而忽略了该样品中存在的其他信号。

本领域常见的误解是MRM测定可确保特异性和灵敏度，样品制备可简化甚至省去，并且不需要色谱分离或色谱分离非常少。但是，与这种错误的认识相反，MRM测定往往会受到该样品的复杂性的极大影响，从而降低了特定靶肽的灵敏度。该特异性和灵敏度可能会受到基质效应的影响，例如叶、花粉、根、茎之间的差异，并导致离子抑制，这在MS分析过程中会发生。通常，大多数带电或可电离的分子，例如盐、离液剂、洗涤剂、聚合物、所有非挥发性离子化合物，干扰所需分析物(即肽/蛋白质)的电离，从而竞争并导致信号抑制和/或背景噪声升高。离子抑制会对几个分析参数产生负面影响，诸如检测能力、精确度和准确性。因此，为了克服本领域的MRM质谱法中的所有这些缺陷，需要开发一种用于从复合生物样品(例如转基因植物样品)中有效提取靶蛋白的方法，以富集靶蛋白和/或消除可能降低靶蛋白/肽的离子强度并影响该测定的可重复性和准确性的干扰。

总体而言，改善样品制备可能是减少基质效应和避免离子抑制的最有效方法。该方法使得实现富集选择的靶蛋白和肽而没有使干扰集中的能力，从而可以在低靶蛋白浓度下进行准确而精确的定量。

使用替代肽的盒(来自表1或表2)进行的基于MRM的测定在含有该七种蛋白中的至少一种的不同转基因事件中测量Cry1Ab、eCry3.1Ab、mCry3A、Vip3A、dmEPSPS、PAT和PMI(表4)。该研究中评估的转基因事件如下：Bt11(Cry1Ab和PAT)；5307(eCry3.1Ab和PMI)；MIR604(mCry3A和PMI)；MIR162(Vip3Aa20和PMI)和GA21(dmEPSPS)。

组织提取-将12-15mg冻干的组织(叶、根、花粉、谷粒和整个植物)放入2μL裂解基质A FastPrep管(MP生物医疗公司，圣安娜，加利福尼亚州)中。然后加入1.0-1.5μL(w/v)的含0.1％RapiGest的PBS。然后在环境温度下，在具有裂解基质A(石榴石基质和1/4”陶瓷球珠)的FastPrep-24组织匀浆器(MP生物医疗公司，圣安娜，加利福尼亚州)中提取样品，进行1个循环(40s，速度设置6)。每mg冻干组织在50μl提取缓冲液(6M尿素，2M硫脲，5mM EDTA，0.1M HEPES)中从所选组织中提取蛋白

离心-组织提取后，将该样品于4℃下15,000g离心约5min。该步骤取出不溶性蛋白，例如，组蛋白和肌动蛋白，从而降低了消化前该提取物的复杂性。因此，只有可溶性蛋白才能进入该酶消化步骤。

胰蛋白酶消化-通过在均化缓冲液中稀释，将该离心步骤中上清液的总蛋白浓度调节至约0.2μg/μl。将相当于30μg的蛋白转移到孔板中。将一体积的三氟乙醇添加到该样品中，并在室温下伴随低速摇动孵育约30min。加入四体积的100mM碳酸氢铵。然后添加约12μl胰蛋白酶(0.1μg/μl)。将样品在37℃下孵育过夜。然后将样品用20％甲酸(终浓度1％)淬灭。然后加入20μl稳定同位素标记的肽。

离心-将上一步骤中的样品在4℃下15,000g离心约5min。

通过MCX进行脱盐-离心后，将该样品脱盐。该步骤在离子交换柱上进行。该脱盐步骤通过丢弃洗槽中的非目的肽来浓缩该目的肽。除了去除非目的肽外，该步骤还去除了可能干扰目的替代肽的电离和检测的盐和小分子。与本领域已知的其他方法相比，浓缩目的肽并去除干扰盐和小分子可以提高本发明的该MRM测定的灵敏度。

QTRAP-MRM-利用QTRAP 6500与NanoAcquity UPLC联用使用Halo Peptide ES-C18柱进行MRM分析。该流速为约18μl/min。溶剂A为约97/3水/DMSO+0.2％甲酸(FA)，且溶剂B为约97/3乙腈(CAN)/DMSO+0.2％FA。在分析过程中，自动进样器的温度保持在约4℃。将总共8μl的样品注入保持在环境温度下的该柱上。

数据分析-使用Analyst软件(爱博才思公司，安大略省，加拿大)进行数据采集，并使用Multiquant软件(爱博才思公司)进行数据分析。

为了使用本发明的优选的标记的替代肽确定靶转基因蛋白的检测水平(LOD)，将所有七种靶蛋白Cry1Ab、eCry3.1Ab、mCry3A、Vip3A、dmEPSPS、PAT和PMI混合在一起并添加至非转基因玉米植物的叶、根、谷粒和花粉组织中。表3-6显示了该MRM对靶蛋白的检测水平(LOD)，并表明当在所有植物基质中该靶蛋白伴随存在其他转基因和非转基因蛋白时，每种标记的替代肽及其产生的过渡离子都能够选择性地检测和定量靶蛋白。对于表2的每种优选替代肽，均获得了良好的线性(r＝0.988-0.998)。每种替代肽的LOD低于通过ELISA确定的定量范围，表明本发明的组合物和方法等于或优于用以定量植物中转基因蛋白的当前标准。

表3.玉米叶基质中靶蛋白的LOD。(LOD＝fmol/μg总蛋白)

表4.玉米谷粒基质中靶蛋白的LOD。(LOD＝fmol/μg总蛋白)

表5.玉米根基质中靶蛋白的LOD。(LOD＝fmol/μg总蛋白)

表6.玉米花粉基质中靶蛋白的LOD。(LOD＝fmol/μg总蛋白)

然后测试该优选的标记的替代肽(表2)及其过渡离子，以确定其特异性检测来自转基因玉米植物的叶、谷粒、根和花粉组织中靶蛋白的能力，该转基因玉米植物包含选自由以下组成的组的转基因事件：Bt11(包含Cry1Ab和PAT)、5307(包含eCry3.1Ab和PMI)、MIR604(包含mCry3A和PMI)、MIR162(包含Vip3A和PMI)和GA21(包含dmEPSPS)。针对每种转基因事件测试了该七种优选的替代肽中的每一种。表7显示了该靶蛋白的定量的结果。该结果表明，该Cry1Ab和PAT替代肽和标记的替代肽能够检测和/或定量来自包含事件Bt11的转基因玉米植物的叶、谷粒、根和花粉中的Cry1Ab和PAT。对于所测试的植物，该Cry1Ab蛋白低于花粉(见表5)组织中的LOD，而该PAT蛋白低于谷粒和花粉(见表4和5)中的LOD。该eCry3.1Ab和PMI替代肽和标记的替代肽能够从包含事件5307的转基因玉米植物的叶、谷粒、根和花粉中检测eCry3.1Ab和PMI。对于所测试的植物，该eCry3.1Ab蛋白低于花粉中的LOD(见表5)。该mCry3A和PMI替代肽和标记的替代肽能够从包含事件MIR604的转基因玉米植物的叶、谷粒、根和花粉中检测mCry3A和PMI蛋白。对于该测试的植物，该mCry3A蛋白低于花粉中的LOD(见表5)。该Vip3Aa20和PMI替代肽和标记的替代肽能够从包含事件MIR162的转基因玉米植物的叶、谷粒、根和花粉中检测Vip3Aa20和PMI蛋白。该dmEPSPS替代肽和标记的替代肽能够检测来自包含事件GA21的转基因玉米植物的叶、谷粒、根和花粉中的dmEPSPS蛋白。

为了进一步表征本发明的优选的标记的替代肽的能力，上述测定是在表达所有七种蛋白质(Cry1Ab、eCry3.1Ab、mCry3A、Vip3A、dmEPSPS、PAT和PMI)的育种堆叠上进行的。该结果表明，LC-SRM可以同时检测和定量该育种堆叠中包含的所有七种蛋白。

表1和/或表2中列出的替代肽和标记的替代肽能够检测和/或定量本发明的靶蛋白。这些肽中的每一种或这些肽的组合都是候选物，可用于该靶蛋白的定量MRM测定。

表7.转基因植物中靶蛋白的检测和定量。

nd＝未测出

虽然已经结合本发明的特定实施例描述了本发明，但是应当理解，本发明的设备能够进行进一步的改良。本专利申请意在涵盖任何一般而言遵循本发明的原理的变化、用途或改编，并且包括这样的偏离本披露的内容：其在本发明所属领域的已知或惯常操作内，并且可以适用于此前所阐述的关键特征，并且遵循所附权利要求的范围。

在本说明书中提到的所有公开物和专利申请对于本发明所涉及领域的技术人员的技术水平是指示性的。所有这些公开物和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的公开物或专利申请被明确地并单独地指示通过引用而被并入。

序列表

<110> Syngenta Participations AG

Young, Scott

Sessler, Richard

Graser, Gerson

Guilbaud, Rudolf

Schirm, Michael

Isabelle, Maxim

<120> 用于蛋白质检测的组合物以及方法

<130> 81319-US-L-ORG-NAT-1

<160> 270

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 1

Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu Gly Ser Ile Arg

1 5 10

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 2

Ile Val Ala Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 3

Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 4

Asp Val Ser Val Phe Gly Gln Arg

1 5

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 5

Thr Tyr Pro Ile Arg

1 5

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 6

Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 7

Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg

1 5

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 8

Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg

1 5 10

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 9

Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 10

Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg

1 5

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 11

Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg

1 5 10

<210> 12

<211> 6

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 12

Asn Gln Ala Ile Ser Arg

1 5

<210> 13

<211> 6

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 13

Ile Glu Glu Phe Ala Arg

1 5

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 14

Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile Arg

1 5 10

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 15

Leu Ser His Val Ser Met Phe Arg

1 5

<210> 16

<211> 16

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 16

Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg

1 5 10 15

<210> 17

<211> 16

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 17

Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu Ser Phe Arg

1 5 10 15

<210> 18

<211> 5

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 18

Tyr Asn Gln Phe Arg

1 5

<210> 19

<211> 6

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 19

Tyr Asn Asp Leu Thr Arg

1 5

<210> 20

<211> 19

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 20

Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr Ile Tyr Thr Asp

1 5 10 15

Ala His Arg

<210> 21

<211> 20

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 21

Ser Ala Glu Phe Asn Asn Ile Ile Pro Ser Ser Gln Ile Thr Gln Ile

1 5 10 15

Pro Leu Thr Lys

20

<210> 22

<211> 6

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 22

Gln Gly Phe Ser His Arg

1 5

<210> 23

<211> 28

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 23

Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu

1 5 10 15

Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg

20 25

<210> 24

<211> 19

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 24

Glu Leu Thr Leu Thr Val Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr

1 5 10 15

Asp Ser Arg

<210> 25

<211> 34

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 25

Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp

1 5 10 15

Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val

20 25 30

Tyr Arg

<210> 26

<211> 20

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 26

Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asn Asn Asn

1 5 10 15

Val Pro Pro Arg

20

<210> 27

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 工程化杂合毒素

<400> 27

Thr Asp Val Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val

1 5 10

<210> 28

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 工程化杂合毒素

<400> 28

Ala Val Asn Glu Leu Phe Thr Ser Ser Asn Gln Ile Gly Leu Lys

1 5 10 15

<210> 29

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 工程化杂合毒素

<400> 29

Ile Thr Gln Leu Pro Leu Thr Lys

1 5

<210> 30

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 工程化杂合毒素

<400> 30

Gly Leu Asp Ser Ser Thr Thr Lys

1 5

<210> 31

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 工程化杂合毒素

<400> 31

Gln Cys Ala Gly Ile Arg Pro Tyr Asp Gly Arg

1 5 10

<210> 32

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 工程化杂合毒素

<400> 32

Ile Glu Phe Val Pro Ala Glu Val Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu

1 5 10 15

Glu Arg

<210> 33

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的Cry3A

<400> 33

Ile Thr Gln Leu Pro Leu Val Lys

1 5

<210> 34

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的Cry3A

<400> 34

Met Thr Ala Asp Asn Asn Thr Glu Ala Leu Asp Ser Ser Thr Thr Lys

1 5 10 15

<210> 35

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的Cry3A

<400> 35

Val Tyr Ile Asp Lys

1 5

<210> 36

<211> 11

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 36

Asp Gly Gly Ile Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys

1 5 10

<210> 37

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 37

Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys

1 5

<210> 38

<211> 11

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 38

Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys

1 5 10

<210> 39

<211> 13

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 39

Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr Ser Ser Lys

1 5 10

<210> 40

<211> 6

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 40

Glu Val Leu Phe Glu Lys

1 5

<210> 41

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 41

Thr Ala Ser Glu Leu Ile Thr Lys

1 5

<210> 42

<211> 9

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 42

Asp Val Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys

1 5

<210> 43

<211> 19

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 43

Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His

1 5 10 15

Leu Asn Lys

<210> 44

<211> 5

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 44

Ile Asp Phe Thr Lys

1 5

<210> 45

<211> 14

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 45

Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu Asp Glu Ile Leu Lys

1 5 10

<210> 46

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 46

Asp Ile Met Asn Met Ile Phe Lys

1 5

<210> 47

<211> 6

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 47

Ala Leu Tyr Val His Lys

1 5

<210> 48

<211> 18

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 48

Val Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr

1 5 10 15

Ala Lys

<210> 49

<211> 10

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 49

Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val Ile Lys

1 5 10

<210> 50

<211> 12

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 50

Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg

1 5 10

<210> 51

<211> 13

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 51

Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys

1 5 10

<210> 52

<211> 25

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 52

Met Ile Val Glu Ala Lys Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile

1 5 10 15

Ser Asn Asp Ser Ile Thr Val Leu Lys

20 25

<210> 53

<211> 12

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 53

Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg

1 5 10

<210> 54

<211> 11

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 54

Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys

1 5 10

<210> 55

<211> 9

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 55

Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr Arg

1 5

<210> 56

<211> 6

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 56

Tyr Met Ser Gly Ala Lys

1 5

<210> 57

<211> 19

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 57

Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu Leu Thr Glu Leu Thr Glu

1 5 10 15

Leu Ala Lys

<210> 58

<211> 5

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 58

Val Tyr Glu Ala Lys

1 5

<210> 59

<211> 9

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 59

Leu Asp Ala Ile Asn Thr Met Leu Arg

1 5

<210> 60

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 60

Gly Lys Pro Ser Ile His Leu Lys

1 5

<210> 61

<211> 24

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 61

Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn Asn Leu

1 5 10 15

Glu Asp Tyr Gln Thr Ile Asn Lys

20

<210> 62

<211> 27

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 62

Asp Asn Phe Tyr Ile Glu Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly

1 5 10 15

Pro Ile Val His Phe Tyr Asp Val Ser Ile Lys

20 25

<210> 63

<211> 26

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 63

Leu Leu Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile

1 5 10 15

Val Phe Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys

20 25

<210> 64

<211> 22

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 64

Ser Gln Asn Gly Asp Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu

1 5 10 15

Ile Ser Pro Ser Glu Lys

20

<210> 65

<211> 14

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 65

Asn Ala Tyr Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys

1 5 10

<210> 66

<211> 23

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 66

Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn

1 5 10 15

Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys

20

<210> 67

<211> 15

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 67

Ile Ala Asn Glu Gln Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys

1 5 10 15

<210> 68

<211> 19

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 68

Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly Glu Ile Asp

1 5 10 15

Leu Asn Lys

<210> 69

<211> 14

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 69

Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys

1 5 10

<210> 70

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 70

Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys

1 5

<210> 71

<211> 32

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 71

Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly

1 5 10 15

Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg

20 25 30

<210> 72

<211> 5

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 72

Tyr Val Asn Glu Lys

1 5

<210> 73

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 73

Gln Asn Tyr Gln Val Asp Lys

1 5

<210> 74

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的EPSPS

<400> 74

Met Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys

1 5 10

<210> 75

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的EPSPS

<400> 75

Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys

1 5

<210> 76

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的EPSPS

<400> 76

Glu Ile Ser Gly Thr Val Lys

1 5

<210> 77

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的EPSPS

<400> 77

Ile Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn

1 5 10 15

Leu Leu Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg

20 25 30

<210> 78

<211> 17

<212> PRT

<213> 产绿色链霉菌

<400> 78

Asp Phe Glu Leu Pro Ala Pro Pro Arg Pro Val Arg Pro Val Thr Gln

1 5 10 15

Ile

<210> 79

<211> 13

<212> PRT

<213> 产绿色链霉菌

<400> 79

Leu Gly Leu Gly Ser Thr Leu Tyr Thr His Leu Leu Lys

1 5 10

<210> 80

<211> 5

<212> PRT

<213> 产绿色链霉菌

<400> 80

Met Ser Pro Glu Arg

1 5

<210> 81

<211> 12

<212> PRT

<213> 产绿色链霉菌

<400> 81

His Gly Gly Trp His Asp Val Gly Phe Trp Gln Arg

1 5 10

<210> 82

<211> 16

<212> PRT

<213> 产绿色链霉菌

<400> 82

Asn Ala Tyr Asp Trp Thr Val Glu Ser Thr Val Tyr Val Ser His Arg

1 5 10 15

<210> 83

<211> 15

<212> PRT

<213> 产绿色链霉菌

<400> 83

Thr Glu Pro Gln Thr Pro Gln Glu Trp Ile Asp Asp Leu Glu Arg

1 5 10 15

<210> 84

<211> 5

<212> PRT

<213> 产绿色链霉菌

<400> 84

Ala Ala Gly Tyr Lys

1 5

<210> 85

<211> 22

<212> PRT

<213> 产绿色链霉菌

<400> 85

Tyr Pro Trp Leu Val Ala Glu Val Glu Gly Val Val Ala Gly Ile Ala

1 5 10 15

Tyr Ala Gly Pro Trp Lys

20

<210> 86

<211> 32

<212> PRT

<213> 产绿色链霉菌

<400> 86

Arg Pro Val Glu Ile Arg Pro Ala Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Val

1 5 10 15

Cys Asp Ile Val Asn His Tyr Ile Glu Thr Ser Thr Val Asn Phe Arg

20 25 30

<210> 87

<211> 13

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 87

Glu Asn Ala Ala Gly Ile Pro Met Asp Ala Ala Glu Arg

1 5 10

<210> 88

<211> 6

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 88

Ala Leu Ala Ile Leu Lys

1 5

<210> 89

<211> 15

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 89

Ser Ala Leu Asp Ser Gln Gln Gly Glu Pro Trp Gln Thr Ile Arg

1 5 10 15

<210> 90

<211> 25

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 90

Gly Ser Gln Gln Leu Gln Leu Lys Pro Gly Glu Ser Ala Phe Ile Ala

1 5 10 15

Ala Asn Glu Ser Pro Val Thr Val Lys

20 25

<210> 91

<211> 15

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 91

Phe Glu Ala Lys Pro Ala Asn Gln Leu Leu Thr Gln Pro Val Lys

1 5 10 15

<210> 92

<211> 10

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 92

Ser Thr Leu Leu Gly Glu Ala Val Ala Lys

1 5 10

<210> 93

<211> 13

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 93

Leu Ile Asn Ser Val Gln Asn Tyr Ala Trp Gly Ser Lys

1 5 10

<210> 94

<211> 9

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 94

His Asn Ser Glu Ile Gly Phe Ala Lys

1 5

<210> 95

<211> 16

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 95

Val Leu Cys Ala Ala Gln Pro Leu Ser Ile Gln Val His Pro Asn Lys

1 5 10 15

<210> 96

<211> 27

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 96

Thr Ala Leu Thr Glu Leu Tyr Gly Met Glu Asn Pro Ser Ser Gln Pro

1 5 10 15

Met Ala Glu Leu Trp Met Gly Ala His Pro Lys

20 25

<210> 97

<211> 16

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 97

Leu Ser Glu Leu Phe Ala Ser Leu Leu Asn Met Gln Gly Glu Glu Lys

1 5 10 15

<210> 98

<211> 24

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 98

Gln Gly Ala Glu Leu Asp Phe Pro Ile Pro Val Asp Asp Phe Ala Phe

1 5 10 15

Ser Leu His Asp Leu Ser Asp Lys

20

<210> 99

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 99

Gly Ile Glu Gly Ser Ile Arg

1 5

<210> 100

<211> 5

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 100

Glu Gly Ser Ile Arg

1 5

<210> 101

<211> 9

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 101

Ala Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg

1 5

<210> 102

<211> 6

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 102

Gly Gln Gly Val Tyr Arg

1 5

<210> 103

<211> 6

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 103

Ser Ser Thr Leu Tyr Arg

1 5

<210> 104

<211> 5

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 104

Ser Thr Leu Tyr Arg

1 5

<210> 105

<211> 6

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 105

Ser Val Phe Gly Gln Arg

1 5

<210> 106

<211> 4

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 106

Phe Gly Gln Arg

1

<210> 107

<211> 5

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 107

Ser Gln Leu Thr Arg

1 5

<210> 108

<211> 4

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 108

Gln Leu Thr Arg

1

<210> 109

<211> 6

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 109

Asn Thr Gly Leu Glu Arg

1 5

<210> 110

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 110

Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg

1 5

<210> 111

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 111

Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg

1 5

<210> 112

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 112

Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg

1 5

<210> 113

<211> 5

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 113

Gly Pro Asp Ser Arg

1 5

<210> 114

<211> 5

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 114

Ser Trp Ile His Arg

1 5

<210> 115

<211> 6

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 115

Ala Thr Ile Asn Ser Arg

1 5

<210> 116

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 116

Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg

1 5

<210> 117

<211> 4

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 117

Ala Ile Ser Arg

1

<210> 118

<211> 4

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 118

Glu Phe Ala Arg

1

<210> 119

<211> 5

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 119

Glu Glu Phe Ala Arg

1 5

<210> 120

<211> 9

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 120

Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile Arg

1 5

<210> 121

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 121

Ser Ser Val Ser Ile Ile Arg

1 5

<210> 122

<211> 4

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 122

Ser Met Phe Arg

1

<210> 123

<211> 5

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 123

Val Ser Met Phe Arg

1 5

<210> 124

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 124

Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg

1 5

<210> 125

<211> 4

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 125

Gly Ser Phe Arg

1

<210> 126

<211> 6

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 126

Tyr Ala Glu Ser Phe Arg

1 5

<210> 127

<211> 4

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 127

Asn Gln Phe Arg

1

<210> 128

<211> 4

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 128

Asp Leu Thr Arg

1

<210> 129

<211> 5

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 129

Asn Asp Leu Thr Arg

1 5

<210> 130

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 130

Thr Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg

1 5

<210> 131

<211> 6

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 131

Tyr Thr Asp Ala His Arg

1 5

<210> 132

<211> 4

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 132

Pro Leu Thr Lys

1

<210> 133

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 133

Ser Ala Glu Phe Asn Asn Ile Ile

1 5

<210> 134

<211> 4

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 134

Phe Ser His Arg

1

<210> 135

<211> 5

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 135

Gly Phe Ser His Arg

1 5

<210> 136

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 136

Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg

1 5

<210> 137

<211> 4

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 137

Gly Gly Glu Arg

1

<210> 138

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 138

Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg

1 5

<210> 139

<211> 6

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 139

Pro Asn Tyr Asp Ser Arg

1 5

<210> 140

<211> 6

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 140

Pro Ser Ala Val Tyr Arg

1 5

<210> 141

<211> 9

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 141

Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu

1 5

<210> 142

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 工程化杂合毒素

<400> 142

Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val

1 5

<210> 143

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 工程化杂合毒素

<400> 143

Asp Tyr His Ile Asp Gln Val

1 5

<210> 144

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 工程化杂合毒素

<400> 144

Thr Ser Ser Asn Gln Ile Gly Leu Lys

1 5

<210> 145

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 工程化杂合毒素

<400> 145

Ser Ser Asn Gln Ile Gly Leu Lys

1 5

<210> 146

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 工程化杂合毒素

<400> 146

Gln Leu Pro Leu Thr Lys

1 5

<210> 147

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 工程化杂合毒素

<400> 147

Thr Gln Leu Pro Leu Thr Lys

1 5

<210> 148

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 工程化杂合毒素

<400> 148

Asp Ser Ser Thr Thr Lys

1 5

<210> 149

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 工程化杂合毒素

<400> 149

Ser Ser Thr Thr Lys

1 5

<210> 150

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 工程化杂合毒素

<400> 150

Pro Tyr Asp Gly Arg

1 5

<210> 151

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的Cry3A

<400> 151

Gln Leu Pro Leu Val Lys

1 5

<210> 152

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的Cry3A

<400> 152

Thr Gln Leu Pro Leu Val Lys

1 5

<210> 153

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的Cry3A

<400> 153

Ala Leu Asp Ser Ser Thr Thr Lys

1 5

<210> 154

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的Cry3A

<400> 154

Glu Ala Leu Asp Ser Ser Thr Thr Lys

1 5

<210> 155

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的Cry3A

<400> 155

Tyr Ile Asp Lys

1

<210> 156

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 156

Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys

1 5

<210> 157

<211> 5

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 157

Thr Leu Thr Cys Lys

1 5

<210> 158

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 158

Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys

1 5

<210> 159

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 159

Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys

1 5

<210> 160

<211> 9

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 160

Thr Phe Ala Thr Glu Thr Ser Ser Lys

1 5

<210> 161

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 161

Phe Ala Thr Glu Thr Ser Ser Lys

1 5

<210> 162

<211> 4

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 162

Leu Phe Glu Lys

1

<210> 163

<211> 6

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 163

Ser Glu Leu Ile Thr Lys

1 5

<210> 164

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 164

Ala Ser Glu Leu Thr Ile Lys

1 5

<210> 165

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 165

Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys

1 5

<210> 166

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 166

Met Asn Glu His Leu Asn Lys

1 5

<210> 167

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 167

Met Asn Glu His Leu Asn Lys

1 5

<210> 168

<211> 4

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 168

Asp Phe Thr Lys

1

<210> 169

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 169

Thr Leu Asp Glu Ile Leu Lys

1 5

<210> 170

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 170

Leu Thr Leu Asp Glu Ile Leu Lys

1 5

<210> 171

<211> 6

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 171

Met Asn Met Ile Phe Lys

1 5

<210> 172

<211> 5

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 172

Asn Met Ile Phe Lys

1 5

<210> 173

<211> 4

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 173

Tyr Val His Lys

1

<210> 174

<211> 4

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 174

Val Asn Ile Leu

1

<210> 175

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 175

Ser Met Leu Ser Asp Val Ile Lys

1 5

<210> 176

<211> 9

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 176

Thr Ser Met Leu Ser Asp Val Ile Lys

1 5

<210> 177

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 177

Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg

1 5

<210> 178

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 178

Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg

1 5

<210> 179

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 179

Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys

1 5

<210> 180

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 180

Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys

1 5

<210> 181

<211> 9

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 181

Ser Asn Asp Ser Ile Thr Val Leu Lys

1 5

<210> 182

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 182

Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg

1 5

<210> 183

<211> 9

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 183

Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg

1 5

<210> 184

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 184

Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys

1 5

<210> 185

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 185

Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys

1 5

<210> 186

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 186

Ser Ser Glu Ala Glu Tyr Arg

1 5

<210> 187

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 187

Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr Arg

1 5

<210> 188

<211> 4

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 188

Ser Gly Ala Lys

1

<210> 189

<211> 5

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 189

Met Ser Gly Ala Lys

1 5

<210> 190

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 190

Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys

1 5

<210> 191

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 191

Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile

1 5

<210> 192

<211> 4

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 192

Tyr Glu Ala Lys

1

<210> 193

<211> 5

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 193

Asn Thr Met Leu Arg

1 5

<210> 194

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 194

Ala Ile Asn Thr Met Leu Arg

1 5

<210> 195

<211> 6

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 195

Pro Ser Ile His Leu Lys

1 5

<210> 196

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 196

Asp Tyr Gln Thr Ile Asn Lys

1 5

<210> 197

<211> 4

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 197

Asp Asn Phe Tyr

1

<210> 198

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 198

Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys

1 5

<210> 199

<211> 5

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 199

Ser Pro Ser Glu Lys

1 5

<210> 200

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 200

Leu Glu Ile Ser Pro Ser Glu Lys

1 5

<210> 201

<211> 11

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 201

Asp His Thr Gly Gly Val Asn Ser Gly Thr Lys

1 5 10

<210> 202

<211> 9

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 202

Gly Asn Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys

1 5

<210> 203

<211> 6

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 203

Asn Thr Glu Leu Ser Lys

1 5

<210> 204

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 204

Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys

1 5

<210> 205

<211> 6

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 205

Asn Asp Val Asn Asn Lys

1 5

<210> 206

<211> 4

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 206

Asp Leu Asn Lys

1

<210> 207

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 207

Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys

1 5

<210> 208

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 208

Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys

1 5

<210> 209

<211> 6

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 209

Gln Glu Ile Ser Asp Lys

1 5

<210> 210

<211> 5

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 210

Tyr Gln Gly Gly Arg

1 5

<210> 211

<211> 7

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 211

Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg

1 5

<210> 212

<211> 4

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 212

Val Asn Glu Lys

1

<210> 213

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的EPSPS

<400> 213

Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys

1 5

<210> 214

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的EPSPS

<400> 214

Pro Val Glu Asp Ala Lys

1 5

<210> 215

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的EPSPS

<400> 215

Val Glu Asp Ala Lys

1 5

<210> 216

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的EPSPS

<400> 216

Ser Gly Thr Val Lys

1 5

<210> 217

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的EPSPS

<400> 217

Gly Thr Val Lys

1

<210> 218

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的EPSPS

<400> 218

Ile Leu Leu Leu Ala Ala

1 5

<210> 219

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的EPSPS

<400> 219

His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg

1 5

<210> 220

<211> 6

<212> PRT

<213> 产绿色链霉菌

<400> 220

Tyr Thr His Leu Leu Lys

1 5

<210> 221

<211> 5

<212> PRT

<213> 产绿色链霉菌

<400> 221

Thr His Leu Leu Lys

1 5

<210> 222

<211> 4

<212> PRT

<213> 产绿色链霉菌

<400> 222

Ser Pro Glu Arg

1

<210> 223

<211> 5

<212> PRT

<213> 产绿色链霉菌

<400> 223

Gly Phe Trp Gln Arg

1 5

<210> 224

<211> 6

<212> PRT

<213> 产绿色链霉菌

<400> 224

Val Gly Phe Trp Gln Arg

1 5

<210> 225

<211> 8

<212> PRT

<213> 产绿色链霉菌

<400> 225

Ser Thr Val Tyr Val Ser His Arg

1 5

<210> 226

<211> 5

<212> PRT

<213> 产绿色链霉菌

<400> 226

Thr Glu Pro Gln Thr

1 5

<210> 227

<211> 4

<212> PRT

<213> 产绿色链霉菌

<400> 227

Asp Leu Glu Arg

1

<210> 228

<211> 4

<212> PRT

<213> 产绿色链霉菌

<400> 228

Ala Gly Tyr Lys

1

<210> 229

<211> 4

<212> PRT

<213> 产绿色链霉菌

<400> 229

Gly Pro Trp Lys

1

<210> 230

<211> 9

<212> PRT

<213> 产绿色链霉菌

<400> 230

Gly Ile Ala Tyr Ala Gly Pro Trp Lys

1 5

<210> 231

<211> 7

<212> PRT

<213> 产绿色链霉菌

<400> 231

Thr Ser Thr Val Asn Phe Arg

1 5

<210> 232

<211> 7

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 232

Pro Met Asp Ala Ala Glu Arg

1 5

<210> 233

<211> 9

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 233

Gly Ile Pro Met Asp Ala Ala Glu Arg

1 5

<210> 234

<211> 4

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 234

Ala Ile Leu Lys

1

<210> 235

<211> 6

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 235

Pro Trp Gln Thr Ile Arg

1 5

<210> 236

<211> 8

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 236

Gly Glu Pro Trp Gln Thr Ile Arg

1 5

<210> 237

<211> 9

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 237

Ala Asn Glu Ser Pro Val Thr Val Lys

1 5

<210> 238

<211> 5

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 238

Pro Val Thr Val Lys

1 5

<210> 239

<211> 6

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 239

Leu Thr Gln Pro Val Lys

1 5

<210> 240

<211> 6

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 240

Gly Glu Ala Val Ala Lys

1 5

<210> 241

<211> 7

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 241

Leu Gly Glu Ala Val Ala Lys

1 5

<210> 242

<211> 8

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 242

Gln Asn Tyr Ala Trp Gly Ser Lys

1 5

<210> 243

<211> 7

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 243

Asn Tyr Ala Trp Gly Ser Lys

1 5

<210> 244

<211> 8

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 244

Asn Ser Glu Ile Gly Phe Ala Lys

1 5

<210> 245

<211> 6

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 245

Val Leu Cys Ala Ala Gln

1 5

<210> 246

<211> 7

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 246

Trp Met Gly Ala His Pro Lys

1 5

<210> 247

<211> 5

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 247

Thr Ala Leu Thr Glu

1 5

<210> 248

<211> 7

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 248

Asn Met Gln Gly Glu Glu Lys

1 5

<210> 249

<211> 8

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 249

Leu Asn Met Gln Gly Glu Glu Lys

1 5

<210> 250

<211> 8

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 250

Ser Leu His Asp Leu Ser Asp Lys

1 5

<210> 251

<211> 6

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 251

His Asp Leu Ser Asp Lys

1 5

<210> 252

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的Cry3A

<400> 252

Leu Gln Ser Gly Ala Ser Val Val Ala Gly Pro Arg

1 5 10

<210> 253

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的Cry3A肽

<400> 253

Ser Gly Ala Ser Val Val Ala Gly Pro Arg

1 5 10

<210> 254

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的Cry3A肽

<400> 254

Ser Val Val Ala Gly Pro Arg

1 5

<210> 255

<211> 8

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 255

Phe Thr Thr Gly Thr Asp Leu Lys

1 5

<210> 256

<211> 6

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 256

Thr Gly Thr Asp Leu Lys

1 5

<210> 257

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的EPSPS

<400> 257

Ser Leu Thr Ala Ala Val Thr Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val

1 5 10 15

Leu Asp Gly Val Pro Arg

20

<210> 258

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> dmEPSPS过渡2

<400> 258

Gly Val Pro Arg

1

<210> 259

<211> 615

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌

<400> 259

Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu

1 5 10 15

Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly

20 25 30

Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser

35 40 45

Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile

50 55 60

Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile

65 70 75 80

Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala

85 90 95

Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu

100 105 110

Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu

115 120 125

Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala

130 135 140

Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val

145 150 155 160

Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser

165 170 175

Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg

180 185 190

Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val

195 200 205

Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg

210 215 220

Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val

225 230 235 240

Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro

245 250 255

Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val

260 265 270

Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu

275 280 285

Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr

290 295 300

Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln

305 310 315 320

Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro

325 330 335

Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala

340 345 350

Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg

355 360 365

Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val

385 390 395 400

Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln

405 410 415

Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His

420 425 430

Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile

435 440 445

Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn

450 455 460

Ile Ile Pro Ser Ser Gln Ile Thr Gln Ile Pro Leu Thr Lys Ser Thr

465 470 475 480

Asn Leu Gly Ser Gly Thr Ser Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly

485 490 495

Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Ser Pro Gly Gln Ile Ser Thr Leu Arg

500 505 510

Val Asn Ile Thr Ala Pro Leu Ser Gln Arg Tyr Arg Val Arg Ile Arg

515 520 525

Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu Gln Phe His Thr Ser Ile Asp Gly Arg

530 535 540

Pro Ile Asn Gln Gly Asn Phe Ser Ala Thr Met Ser Ser Gly Ser Asn

545 550 555 560

Leu Gln Ser Gly Ser Phe Arg Thr Val Gly Phe Thr Thr Pro Phe Asn

565 570 575

Phe Ser Asn Gly Ser Ser Val Phe Thr Leu Ser Ala His Val Phe Asn

580 585 590

Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Val Pro Ala Glu

595 600 605

Val Thr Phe Glu Ala Glu Tyr

610 615

<210> 260

<211> 653

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 工程化杂合毒素

<400> 260

Met Thr Ser Asn Gly Arg Gln Cys Ala Gly Ile Arg Pro Tyr Asp Gly

1 5 10 15

Arg Gln Gln His Arg Gly Leu Asp Ser Ser Thr Thr Lys Asp Val Ile

20 25 30

Gln Lys Gly Ile Ser Val Val Gly Asp Leu Leu Gly Val Val Gly Phe

35 40 45

Pro Phe Gly Gly Ala Leu Val Ser Phe Tyr Thr Asn Phe Leu Asn Thr

50 55 60

Ile Trp Pro Ser Glu Asp Pro Trp Lys Ala Phe Met Glu Gln Val Glu

65 70 75 80

Ala Leu Met Asp Gln Lys Ile Ala Asp Tyr Ala Lys Asn Lys Ala Leu

85 90 95

Ala Glu Leu Gln Gly Leu Gln Asn Asn Val Glu Asp Tyr Val Ser Ala

100 105 110

Leu Ser Ser Trp Gln Lys Asn Pro Ala Ala Pro Phe Arg Asn Pro His

115 120 125

Ser Gln Gly Arg Ile Arg Glu Leu Phe Ser Gln Ala Glu Ser His Phe

130 135 140

Arg Asn Ser Met Pro Ser Phe Ala Ile Ser Gly Tyr Glu Val Leu Phe

145 150 155 160

Leu Thr Thr Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Thr His Leu Phe Leu Leu Lys

165 170 175

Asp Ala Gln Ile Tyr Gly Glu Glu Trp Gly Tyr Glu Lys Glu Asp Ile

180 185 190

Ala Glu Phe Tyr Lys Arg Gln Leu Lys Leu Thr Gln Glu Tyr Thr Asp

195 200 205

His Cys Val Lys Trp Tyr Asn Val Gly Leu Asp Lys Leu Arg Gly Ser

210 215 220

Ser Tyr Glu Ser Trp Val Asn Phe Asn Arg Tyr Arg Arg Glu Met Thr

225 230 235 240

Leu Thr Val Leu Asp Leu Ile Ala Leu Phe Pro Leu Tyr Asp Val Arg

245 250 255

Leu Tyr Pro Lys Glu Val Lys Thr Glu Leu Thr Arg Asp Val Leu Thr

260 265 270

Asp Pro Ile Val Gly Val Asn Asn Leu Arg Gly Tyr Gly Thr Thr Phe

275 280 285

Ser Asn Ile Glu Asn Tyr Ile Arg Lys Pro His Leu Phe Asp Tyr Leu

290 295 300

His Arg Ile Gln Phe His Thr Arg Phe Gln Pro Gly Tyr Tyr Gly Asn

305 310 315 320

Asp Ser Phe Asn Tyr Trp Ser Gly Asn Tyr Val Ser Thr Arg Pro Ser

325 330 335

Ile Gly Ser Asn Asp Ile Ile Thr Ser Pro Phe Tyr Gly Asn Lys Ser

340 345 350

Ser Glu Pro Val Gln Asn Leu Glu Phe Asn Gly Glu Lys Val Tyr Arg

355 360 365

Ala Val Ala Asn Thr Asn Leu Ala Val Trp Pro Ser Ala Val Tyr Ser

370 375 380

Gly Val Thr Lys Val Glu Phe Ser Gln Tyr Asn Asp Gln Thr Asp Glu

385 390 395 400

Ala Ser Thr Gln Thr Tyr Asp Ser Lys Arg Asn Val Gly Ala Val Ser

405 410 415

Trp Asp Ser Ile Asp Gln Leu Pro Pro Glu Thr Thr Asp Glu Pro Leu

420 425 430

Glu Lys Gly Tyr Ser His Gln Leu Asn Tyr Val Met Cys Phe Leu Met

435 440 445

Gln Gly Ser Arg Gly Thr Ile Pro Val Leu Thr Trp Thr His Lys Ser

450 455 460

Val Asp Phe Phe Asn Met Ile Asp Ser Lys Lys Ile Thr Gln Leu Pro

465 470 475 480

Leu Thr Lys Ser Thr Asn Leu Gly Ser Gly Thr Ser Val Val Lys Gly

485 490 495

Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Ser Pro Gly Gln

500 505 510

Ile Ser Thr Leu Arg Val Asn Ile Thr Ala Pro Leu Ser Gln Arg Tyr

515 520 525

Arg Val Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu Gln Phe His Thr

530 535 540

Ser Ile Asp Gly Arg Pro Ile Asn Gln Gly Asn Phe Ser Ala Thr Met

545 550 555 560

Ser Ser Gly Ser Asn Leu Gln Ser Gly Ser Phe Arg Thr Val Gly Phe

565 570 575

Thr Thr Pro Phe Asn Phe Ser Asn Gly Ser Ser Val Phe Thr Leu Ser

580 585 590

Ala His Val Phe Asn Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu

595 600 605

Phe Val Pro Ala Glu Val Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Arg

610 615 620

Ala Gln Lys Ala Val Asn Glu Leu Phe Thr Ser Ser Asn Gln Ile Gly

625 630 635 640

Leu Lys Thr Asp Val Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val

645 650

<210> 261

<211> 598

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的Cry3A

<400> 261

Met Thr Ala Asp Asn Asn Thr Glu Ala Leu Asp Ser Ser Thr Thr Lys

1 5 10 15

Asp Val Ile Gln Lys Gly Ile Ser Val Val Gly Asp Leu Leu Gly Val

20 25 30

Val Gly Phe Pro Phe Gly Gly Ala Leu Val Ser Phe Tyr Thr Asn Phe

35 40 45

Leu Asn Thr Ile Trp Pro Ser Glu Asp Pro Trp Lys Ala Phe Met Glu

50 55 60

Gln Val Glu Ala Leu Met Asp Gln Lys Ile Ala Asp Tyr Ala Lys Asn

65 70 75 80

Lys Ala Leu Ala Glu Leu Gln Gly Leu Gln Asn Asn Val Glu Asp Tyr

85 90 95

Val Ser Ala Leu Ser Ser Trp Gln Lys Asn Pro Ala Ala Pro Phe Arg

100 105 110

Asn Pro His Ser Gln Gly Arg Ile Arg Glu Leu Phe Ser Gln Ala Glu

115 120 125

Ser His Phe Arg Asn Ser Met Pro Ser Phe Ala Ile Ser Gly Tyr Glu

130 135 140

Val Leu Phe Leu Thr Thr Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Thr His Leu Phe

145 150 155 160

Leu Leu Lys Asp Ala Gln Ile Tyr Gly Glu Glu Trp Gly Tyr Glu Lys

165 170 175

Glu Asp Ile Ala Glu Phe Tyr Lys Arg Gln Leu Lys Leu Thr Gln Glu

180 185 190

Tyr Thr Asp His Cys Val Lys Trp Tyr Asn Val Gly Leu Asp Lys Leu

195 200 205

Arg Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Trp Val Asn Phe Asn Arg Tyr Arg Arg

210 215 220

Glu Met Thr Leu Thr Val Leu Asp Leu Ile Ala Leu Phe Pro Leu Tyr

225 230 235 240

Asp Val Arg Leu Tyr Pro Lys Glu Val Lys Thr Glu Leu Thr Arg Asp

245 250 255

Val Leu Thr Asp Pro Ile Val Gly Val Asn Asn Leu Arg Gly Tyr Gly

260 265 270

Thr Thr Phe Ser Asn Ile Glu Asn Tyr Ile Arg Lys Pro His Leu Phe

275 280 285

Asp Tyr Leu His Arg Ile Gln Phe His Thr Arg Phe Gln Pro Gly Tyr

290 295 300

Tyr Gly Asn Asp Ser Phe Asn Tyr Trp Ser Gly Asn Tyr Val Ser Thr

305 310 315 320

Arg Pro Ser Ile Gly Ser Asn Asp Ile Ile Thr Ser Pro Phe Tyr Gly

325 330 335

Asn Lys Ser Ser Glu Pro Val Gln Asn Leu Glu Phe Asn Gly Glu Lys

340 345 350

Val Tyr Arg Ala Val Ala Asn Thr Asn Leu Ala Val Trp Pro Ser Ala

355 360 365

Val Tyr Ser Gly Val Thr Lys Val Glu Phe Ser Gln Tyr Asn Asp Gln

370 375 380

Thr Asp Glu Ala Ser Thr Gln Thr Tyr Asp Ser Lys Arg Asn Val Gly

385 390 395 400

Ala Val Ser Trp Asp Ser Ile Asp Gln Leu Pro Pro Glu Thr Thr Asp

405 410 415

Glu Pro Leu Glu Lys Gly Tyr Ser His Gln Leu Asn Tyr Val Met Cys

420 425 430

Phe Leu Met Gln Gly Ser Arg Gly Thr Ile Pro Val Leu Thr Trp Thr

435 440 445

His Lys Ser Val Asp Phe Phe Asn Met Ile Asp Ser Lys Lys Ile Thr

450 455 460

Gln Leu Pro Leu Val Lys Ala Tyr Lys Leu Gln Ser Gly Ala Ser Val

465 470 475 480

Val Ala Gly Pro Arg Phe Thr Gly Gly Asp Ile Ile Gln Cys Thr Glu

485 490 495

Asn Gly Ser Ala Ala Thr Ile Tyr Val Thr Pro Asp Val Ser Tyr Ser

500 505 510

Gln Lys Tyr Arg Ala Arg Ile His Tyr Ala Ser Thr Ser Gln Ile Thr

515 520 525

Phe Thr Leu Ser Leu Asp Gly Ala Pro Phe Asn Gln Tyr Tyr Phe Asp

530 535 540

Lys Thr Ile Asn Lys Gly Asp Thr Leu Thr Tyr Asn Ser Phe Asn Leu

545 550 555 560

Ala Ser Phe Ser Thr Pro Phe Glu Leu Ser Gly Asn Asn Leu Gln Ile

565 570 575

Gly Val Thr Gly Leu Ser Ala Gly Asp Lys Val Tyr Ile Asp Lys Ile

580 585 590

Glu Phe Ile Pro Val Asn

595

<210> 262

<211> 789

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的Vip3A

<400> 262

Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe

1 5 10 15

Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp

20 25 30

Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu

35 40 45

Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys

50 55 60

Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn

65 70 75 80

Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln

85 90 95

Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr

100 105 110

Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val

115 120 125

Ile Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys

130 135 140

Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val

145 150 155 160

Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile

165 170 175

Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr

180 185 190

Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu

195 200 205

Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val

210 215 220

Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly

225 230 235 240

Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile

245 250 255

Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr

260 265 270

Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Gln Ala Phe Leu Thr

275 280 285

Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr

290 295 300

Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val

305 310 315 320

Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala

325 330 335

Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys

340 345 350

Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr

355 360 365

Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp

370 375 380

Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu

385 390 395 400

Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe

405 410 415

Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys

420 425 430

Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly

435 440 445

Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr

450 455 460

Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val

465 470 475 480

Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala

485 490 495

Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg

500 505 510

Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile

515 520 525

Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser Ile

530 535 540

Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr

545 550 555 560

Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His

565 570 575

Lys Asp Gly Gly Ile Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys

580 585 590

Thr Glu Tyr Val Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser Ile His

595 600 605

Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn

610 615 620

Asn Leu Glu Asp Tyr Gln Thr Ile Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr

625 630 635 640

Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu

645 650 655

Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser Glu Lys

660 665 670

Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly

675 680 685

Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg

690 695 700

Gly Ile Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg

705 710 715 720

Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser

725 730 735

Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val

740 745 750

Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu

755 760 765

Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr

770 775 780

Asp Val Ser Ile Lys

785

<210> 263

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 双突变5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶

<400> 263

Met Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile Ser

1 5 10 15

Gly Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu

20 25 30

Leu Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu

35 40 45

Asn Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu Gly

50 55 60

Leu Ser Val Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly

65 70 75 80

Cys Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln Leu

85 90 95

Phe Leu Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Ser Leu Thr Ala Ala Val

100 105 110

Thr Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg

115 120 125

Met Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln Leu

130 135 140

Gly Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg

145 150 155 160

Val Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly

165 170 175

Ser Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu

180 185 190

Ala Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser Ile

195 200 205

Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Lys

210 215 220

Ala Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln

225 230 235 240

Lys Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser

245 250 255

Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr

260 265 270

Val Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala

275 280 285

Glu Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr Ser

290 295 300

Val Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His Leu

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Lys Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr

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<212> PRT

<213> 人工序列

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Leu Leu