具体实施方式

定义

如本节中所述，定义了本文使用的某些术语。在本公开的其他地方定义或示例了其他术语。除非另有定义，本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。

在本申请中，除非另外说明，否则“或”的使用表示“和/或”。在多项从属权利要求的上下文中，“或”的使用仅是指备选权利要求中的一个以上的在先独立或从属权利要求。

词语“约”表示该值的正负10％的范围，例如，“约5”表示4.5至5.5，“约100”表示90至100等，除非本公开的上下文另有指示，或与这种解释不一致。例如，在诸如“约49，约50，约55”之类的数值列表中，“约50”是指延伸到小于先前值与后续值之间的间隔的一半的范围，例如大于49.5到小于52.5。此外，应鉴于本文所提供的术语“约”的定义来理解短语“小于约”一个数值或“大于约”一个数值。

在本公开中提供了数值范围的情况下，意图是在该范围的上限和下限之间的每个中间值以及所述范围内的任何其他所述值或中间值都包含在本公开中。例如，如果所述范围是1μm至8μm，则意图是还公开了2μm、3μm、4μm、5μm、6μm和7μm。

如本文所用，术语“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。

如本文所用，术语“检测”是指通过测量样品的一个或更多个参数来确定与样品相关的一个值或一组值的过程，并且可以进一步包括将测试样品与参考样品进行比较。根据本公开，肿瘤的检测包括鉴定、测定、测量和/或定量一种或更多种标志物。

如本文所用，术语“可能性”通常是指概率、相对概率、存在或不存在或程度。

如本文所用，术语“包含”(或其变型)、“含有”(或其变型)、“具有”(或其变型)或“包括”(或其变型)并不意图是限制性的，而是包含性的或开放性的，并且不排除其他未引用的添加剂、组分、整数、元件或方法步骤。例如，包含一系列特征的过程、方法、系统、组合物、试剂盒或装置并不仅限于这些特征，还可以包括未明确列出的或此类过程、方法、系统、组合物、试剂盒或装置固有的其他特征。

如本文所用，术语“样品”是指获自或源自目标受试者的组合物，其包含例如基于物理、生化、化学和/或生理学特征来表征和/或鉴定的细胞和/或其他分子实体。优选地，样品是“生物样品”，其是指源自活体例如细胞、组织、器官等的样品。在一些实施方案中，组织样品的来源可以是血液或任何血液成分；体液；来自新鲜、冷冻和/或保存的器官或组织样品或活检或抽吸物的实体组织；以及来自受试者的妊娠或发育过程中的任何时间的细胞或血浆。样品包括但不限于原代或培养的细胞或细胞系、细胞上清液、细胞裂解物、血小板、血清、血浆、液体(例如淋巴、羊水、奶、全血、尿液、CSF、唾液、痰、眼泪、汗液、粘液、肿瘤裂解物和细胞培养基)、匀浆的组织、肿瘤组织和细胞提取物。样品还包括针对某些成分(例如蛋白质或核酸)通过例如试剂处理、溶解或富集而处理过的生物样品，或为切片目的而包埋在半固体或固体基质中的生物样品，例如组织学样品中的组织或细胞薄切片。样品可以包含环境成分，例如水、土壤、泥、空气、树脂、矿物质等。优选地，生物样品包含从受试者(例如，人类或其他哺乳动物受试者)获得的DNA(例如gDNA、mtDNA)、RNA(例如mRNA、tRNA)、蛋白质或其组合。

如本文所用，术语“细胞”与术语“生物细胞”可互换使用。生物细胞的非限制性实例包括真核细胞、植物细胞、动物细胞(例如哺乳动物细胞、爬行动物细胞、禽细胞、鱼细胞等)、原核细胞、细菌细胞、真菌细胞、原生动物细胞等、从组织(例如肌肉、软骨、脂肪、皮肤、肝、肺、神经组织等)解离的细胞、免疫细胞(例如T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞等)、胚胎(例如、受精卵)、卵母细胞、卵细胞、精子细胞、杂交瘤、培养的细胞、来自细胞系的细胞、癌细胞、感染的细胞、转染和/或转化的细胞、报告细胞等。哺乳动物细胞可以例如来自人、小鼠、大鼠、马、山羊、绵羊、牛、灵长类动物等。

如本文所用，术语“肿瘤”包括与正常或野生型细胞相比，在遗传、细胞或生理水平上可能已经经历转化的任何细胞或组织。该术语通常表示可能是良性的(例如，未形成转移灶并破坏邻近正常组织的肿瘤)或恶性/癌(例如，侵入周围组织且通常能够产生转移灶的肿瘤，尝试移除后可能复发，除非经过适当治疗，否则很可能导致宿主死亡)的瘤性生长。参见Steadman的Medical Dictionary,28^th Ed Williams&Wilkins,Baltimore,MD(2005)。

术语“癌症”是指异常的细胞生长，特别是本质上是恶性的癌症和癌，肉瘤、腺癌、淋巴瘤、白血病、实体癌和淋巴癌等。不同类型的癌症的实例包括但不限于肺癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、口腔癌、卵巢癌、甲状腺癌、前列腺癌、子宫癌、睾丸癌、神经母细胞瘤、头、颈、子宫颈和阴道的鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、软组织和骨源性肉瘤、结肠直肠癌、肝癌、肾癌(例如RCC)、胸膜癌、宫颈癌、肛门癌、胆管癌、胃肠道类癌肿瘤、食管癌、胆囊癌、小肠癌、中枢神经系统癌、皮肤癌、绒毛膜癌、骨源性肉瘤、纤维肉瘤、神经胶质瘤、黑色素瘤等。

在“正常细胞”的上下文中使用的术语“正常”是指未转化表型的细胞或表现出所检查的组织类型的未转化细胞的形态的细胞(例如，PBMC)。在一些实施方案中，如本文所用的“正常样品”包括非肿瘤样品，例如唾液样品、皮肤样品、毛发样品等。应当注意，可以在不使用正常样品的情况下实现本公开的方法。

如本文所用，术语“异常”通常是指在一定程度上偏离正常(例如，野生型)的生物系统状态。异常状态可以发生在生理或分子水平。代表性实例包括例如生理状态(疾病、病理学)或遗传畸变(突变、单核苷酸变体、拷贝数变体、基因融合、插入缺失等)。疾病状态可以是癌症或癌症前期。异常的生物状态可能与异常的程度有关(例如，指示远离正常状态的距离的定量测量)。

如本文所用，术语“标志物”是指可以客观地测量为正常生物过程、致病过程或对治疗干预(例如利用抗癌剂治疗)的药理学反应的指标的特征。标志物的代表性类型包括例如标志物的结构(例如序列)或数目的分子变化，包括例如基因突变、基因重复、氨基酸取代、添加或缺失或多个差异，例如DNA的体细胞改变、拷贝数变异、串联重复、易位或其组合。

如本文所用，术语“遗传标记”是指在基因组上具有特定位置或对应于基因组中的特定位置的多核苷酸序列(例如，与基因组位置的序列互补的转录物)。因此，术语“遗传标记”也可以用于指例如由基因组序列编码的cDNA和/或mRNA，以及该基因组序列本身。遗传标记可以包括两个或更多个等位基因或变体。遗传标记包括编码或不编码基因产物(例如蛋白质)的核酸序列。特别地，遗传标记包括单核苷酸多态性/变异或拷贝数变异或其组合。优选地，与参考样品相比，遗传标记包括DNA中的体细胞变异，例如sSNV或sCNV、插入缺失、SV或其组合。

如本文所用，术语“蛋白质标记”或“蛋白质组标记”是指对应于转录物(例如，由转录物编码)的多肽或其片段(例如多肽的生物学活性片段)的序列，其反过来对应于基因组序列(例如，由DNA序列转录的转录物)。

本文中的“福尔马林固定的蜡包埋的”或“福尔马林固定的石蜡包埋的”或“FFPE”组织样品广义地解释为指已经用福尔马林或等同物质固定并包埋在蜡(例如石蜡或等同物质)中的样品。本文的FFPE组织可以来自任何人、动物或植物来源。

本文中的“载玻片”可以是能够容纳用于分析的FFPE组织的任何类型的表面，并且可以由任何合适的材料制成。

本文中的“目标区域”或“ROI”是指基底上的样品的一部分，用户可能希望对其进行分析以例如评估基因的序列、结构或表达水平的变化。基底上的样品可以包括所有ROI、无ROI、一个ROI或多于一个ROI。ROI在本文中也称为“S”样品。基底上的RONI样品在本文中称为“X”样品。

如本文所用，术语“微粒”物质是指由颗粒组成的物质，例如基本上球形的颗粒或形状较不规则的颗粒。通常，微粒物质的直径为约10nm至约100μm；优选地，约50至约400nm；特别是约100至约200nm。

如本文所用，术语“测定”是对物质的数量、存在或不存在的测试。

如本文所用，术语“压缩”气体是指已经例如以大于大气压的压力被压缩的气体。在这种压缩的“气体”成分通常是选自氦、氩、氙、氮气、二氧化碳或其混合物的惰性气体。如在压缩系统中典型的那样，“气体”成分可以是液体、半液体或气体形式。

如本文所用，“接触”是指将包含试剂(例如接触介质)的组合物引入到试管、烧瓶、组织培养物、芯片、阵列、板、微板、毛细管等中的包含靶标(例如细胞靶标)的样品中，并在足以允许靶标与试剂之间相互作用的温度和时间下温育。

在体内诊断或治疗的上下文中，“接触”是指将活性成分(例如化合物或药物)引入受试者中，并使该活性成分在体内与受试者的靶组织(例如，上皮组织)接触。

如本文所用，术语“受试者”是指任何动物，优选哺乳动物，例如人类、兽医或农场动物、家畜或宠物，包括通常用于临床研究的动物。特别地，所述受试者是人类受试者，例如，被诊断患有例如癌症的疾病的人类患者。受试者可能具有，潜在地具有或怀疑具有与疾病有关的一种或更多种特征，与疾病有关的一种或更多种症状，关于该疾病是无症状的或未被诊断的。特别地，受试者可能患有癌症，受试者可能显示与癌症相关的症状，受试者可能没有与癌症相关的症状，或者受试者可能没有被诊断出患有癌症。

如本文所用，术语“噪声”在最广义上是指作为真实事件被处理或被接收的任何不需要的干扰(例如，与真实事件不直接相关的信号)。噪声是人为和自然来源引入系统的不需要的或干扰能量的总和。噪声会使信号失真，从而使信号携带的信息质量下降或可靠性降低。该术语与“信号”形成对比，“信号”是一种传达有关某种现象的行为或属性的信息的函数，例如标志物(SNV、CNV、indel、SV)与疾病(例如癌症)之间的概率关联。

如本文所用，在标志物水平的上下文中，术语“估计”在广义上使用。这样，术语“估计”可以指实际值(例如，每mbp DNA1个变异)、值的范围、统计值(例如，均值、中位数等)或其他估计方式(例如，概率地)。

如本文所用，术语“基本上”是指足以用于预期目的。因此，术语“基本上”允许从绝对或完美状态、尺寸、测量、结果等进行微小的、不重要的变化，这是本领域普通技术人员所期望的，但是不会明显影响整体性能。当针对数值或可表示为数值的参数或特性使用时，“基本上”是指百分之十以内。

如本文所用，术语“组分”是指系统的组成。例如，在细胞系统中，组分可以包括多肽(例如，小肽以及大蛋白)、核酸(例如，DNA或RNA)、碳水化合物(例如，单糖以及诸如淀粉的大分子)、脂质以及例如维生素和胆固醇的其他成分。

如本文所用，术语“转移”在最广义上用于指系统的组分通过诸如结合、键合、吸附等过程从其天然环境(例如，线粒体DNA的情况下为线粒体)到非天然环境(例如二氧化硅颗粒的表面)的运动。该术语包括诸如组分与非天然系统之间的共价或非共价相互作用的过程。

如本文所用，术语“共价”相互作用涉及在键合的原子之间共享电子。相反，“非共价”相互作用可包括例如离子相互作用、静电相互作用、氢键相互作用、物理化学相互作用、范德华力、路易斯酸/路易斯碱相互作用或其组合。

如本文所用，术语“分析物”通常是指使用本文所公开的方法或系统检测的靶分子。分析物可以是DNA分析物、RNA分析物、核酸分析物、大分子或小分子，如本领域中使用的那些术语。特别地，大分子可以包括例如多核苷酸、多肽、碳水化合物、脂质或这些中的一种或更多种的组合。通常，大分子的分子量至少约为300道尔顿，并且可以是数百万道尔顿。小分子是分子量高达约300道尔顿的有机化合物。在某些情况下，分析物是核酸分析物。

如本文所用，“探针”是可以识别或被特定靶标特异性识别的物质，例如分子。潜在的探针/靶标或靶标/探针结合伴侣的类型包括受体/配体；配体/反配体(antiligand)；核酸(多核苷酸)相互作用，包括DNA/DNA、DNA/RNA、PNA(肽核酸)/核酸；具有底物、小分子或效应分子的酶、其他催化剂或其他物质等。本发明考虑的探针的实例包括但不限于肽、酶(例如蛋白酶或激酶)、酶底物、辅因子、药物、凝集素、糖、核酸(包括寡核苷酸、DNA、RNA、PNA或修饰或取代的核酸)、寡糖、蛋白质、酶、多克隆和单克隆抗体、单链抗体或其片段。探针聚合物可以是线形或环形的。探针可以通过差异活性，差异结合或通过结构标记鉴定来区分不同的靶标。本发明的探针优选是核酸分子，特别优选是DNA。在某些情况下，“探针”可以作为“靶标”起作用，而“靶标”可以作为探针起作用，例如，互补DNA(cDNA)可以用作与靶标基因序列的一部分杂交的探针；但是，cDNA本身与靶序列相对应，因为它与基因序列的mRNA产物匹配。

如本文所用，术语“分析”以及短语“检测”可以指定性或定量确定与分析物有关的目标参数，例如，分析物的量、水平、浓度或活性(绝对的和相对的)。

如本文所用，术语“诊断”是指可以确定受试者是否可能患有给定疾病或病症的方法。技术人员通常基于一种或更多种诊断指标(例如标志物)进行诊断，所述标志物的存在、不存在、量或量的变化指示疾病或病症的存在、严重性或不存在。其他诊断指标可包括患者病史；身体症状，例如无法解释的体重减轻、发烧、疲劳、疼痛或皮肤异常；表型；基因型；或环境或遗传因素。本领域技术人员将理解，术语“诊断”是指某些过程或结果发生的增加的可能性；也就是说，与未表现出该特征的个体相比，表现出给定特征(例如，诊断指标的存在或水平)的患者中更可能发生病程或结果。本公开内容的诊断方法可以独立使用，或与其他诊断方法结合使用，以确定表现出给定特征的患者是否更可能发生病程或结果。

术语“核酸”通常是指DNA或RNA，无论其是扩增产物，合成产生的，RNA反转录产物还是天然存在的。通常，核酸是单链或双链分子，并且由天然存在的核苷酸组成。双链核酸分子可以具有3'或5'突出端，因此不需要或假定在其整个长度上完全是双链的。此外，术语核酸可以由非天然存在的核苷酸和/或对天然存在的核苷酸的修饰组成。实例在本文中列出，但不限于：5'或3'核苷酸的磷酸化以分别允许连接或防止核酸外切酶降解/聚合酶延伸；共价和近共价连接的氨基、硫醇、炔烃或生物素基修饰；荧光团和淬灭剂；核苷酸之间的硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯和磷酸酯连接以防止降解；甲基化和修饰的碱基。

当在本文中使用时，术语“多肽”是指可互换使用的肽、蛋白质或多肽，其涵盖给定长度的氨基酸链，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。术语多肽还指并且不排除多肽的修饰。修饰包括糖基化、乙酰化、酰化、磷酸化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联形成、半胱氨酸形成、焦谷氨酸形成、制剂、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解处理、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、亚硒化、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸加入蛋白质(例如精氨酸化)和泛素化。

如本文所用，在分子的上下文中，术语“分离的”或“提取的”是指基本上不含杂质的分子。从样品中的其他成分中纯化出来时，分子(例如DNA或RNA)已被“分离”或“提取”。纯化是指将靶标与同样在样品中也发现的一种或更多种外部组分分离。与未纯化或未提取的样品相比，从混合样本或样品中分离、提取或纯化的成分通常纯化或富集至少50％、至少60％、至少75％、至少90％或至少98％或甚至至少99％。

术语“合成的”是指已经使用本领域理解的技术例如使用亚磷酰胺化学方法或合成化学方法化学合成的分子。

在核酸的上下文中，术语“杂合”或“杂交”广泛地意指包括双链体以及能够如此形成双链体的分子。在本文中，在多个碱基上碱基配对的单链核酸被称为“杂交”。杂交通常在生理或生物条件下测定(例如，细胞内：pH7.2，140mM钾离子；细胞外：pH 7.4，145mM钠离子)。

如本文所用，术语“类似物”包括但不限于其中具有合成引入的残基或接头的寡核苷酸，例如DNA序列内的核糖核酸残基，支化连接剂例如甘油衍生物，或氨基烷基接头。“加合物”包括例如O6-烷基-dG和O6-Me-dG。同样，在一个实施方案中，术语“缀合物”是指与一种或更多种多核苷酸共价或非共价结合的靶标识别剂。在另一个实施方案中，术语“缀合物”是指与一个或更多个荧光染料分子共价或非共价的线性、分支或树枝状多核苷酸。

如本文所用，“靶标”是指需要确定其存在、活性和/或量并且对给定探针具有亲和力的物质。靶标可以是人造的或天然存在的物质。而且，它们可以以未改变的状态使用或与其他种类作为团聚体一起使用。靶标可以直接地或通过特异性结合物质共价或非共价地附着于结合成员。可用于本发明的靶标的实例包括但不限于核酸或多核苷酸(包括mRNA、tRNA、rRNA、寡核苷酸、DNA、病毒RNA或DNA、EST、cDNA、源自RNA或DNA的PCR扩增产物及其突变、变体或修饰)；蛋白质(包括酶，例如负责切割神经递质的酶、蛋白酶、激酶等)；酶的基底；肽；辅因子；凝集素；糖；多糖；细胞(可包括细胞表面抗原)；细胞膜；细胞器等，以及可以以络合、共价键交联等形式存在的其他此类分子或其他物质。靶标也可以称为反探针。

其中探针与靶序列结合时，结合可以是“特异性的”或“选择性的”。通常，如果探针具有一个且只有一个结合伴侣(例如靶标)，则它具有“特异性”的特性。实际上，绝大多数探针是“选择性的”而不是“特异性的”，因为大多数探针会结合许多靶标，尤其是在高浓度下。因此，这些术语可以互换使用。结合的特异性和选择性可以使用常规方法确定。例如，其中靶标是特定的mRNA时，探针可以是例如寡核苷酸，其在选定的杂交条件下与靶标特异性结合而不与干扰RNA或DNA特异性结合。本领域技术人员可以使用本领域公认的方法，通过实验确定寡核苷酸的特征，所述寡核苷酸将与靶标最佳杂交，而与非特异性干扰DNA或RNA的杂交最少(例如，参见上文)。通常，用于区分存在于大量过量的非靶向RNA的背景中的靶mRNA的寡核苷酸探针的长度范围可以是约8至约50个核苷酸，优选约18、20、22或25个核苷酸。在没有较大竞争靶标背景的生化测定中使用的寡核苷酸探针可短于8个核苷酸。使用本领域公认的程序(例如，计算机程序BLAST)，可以选择寡核苷酸探针的序列，使得它们彼此无关并且与已知遗传数据库中的潜在干扰序列不同。可以使用本领域公认的程序常规地确定选择允许寡核苷酸探针与RNA靶标特异性杂交的杂交条件。

如本文所用，术语“引物”是指短核酸分子，例如包含九个或更多个核苷酸的DNA寡核苷酸，其在一些实例中用于引发更长核酸序列的合成。更长引物的长度可以是大约10、12、15、20、25、30或50个核苷酸或更长。引物也可用于检测。

在本文中“机械地去除或消融”某些样品是指通过机械方式从基底上分离出该样品或使样品汽化或分解，以使其不再存在于基底上。

本文中化学“分解”大分子是指变性或分解大分子，例如RNA、DNA和/或蛋白质，或对其进行充分的化学修饰，以使其不会污染以后对ROI组织中RNA、DNA和/或蛋白质的分析。

由病理学家或实验室用户或其他个体在载玻片上做出的“标记”在本文中称为“手工标记”。这样的标记可以通过任何可用的手段来制作，例如用笔或蚀刻设备。相比之下，本文中由系统自动制作的标记可以称为“虚拟标记”或“数字标记”，以表示该标记不是手工制作，而是通过使用一种或更多种算法制作。

与用户手工执行的操作相反，术语“数字”、“数字化”、“自动化”和“自动”等表示由本文的系统执行的操作，例如由算法和/或通过用户与计算机用户界面之间的交互来控制。

如本文所用，术语“表面”是指提供允许分析物或目标探针之间相互作用的位点的任何物质。优选地，该表面是固相支持体如硝酸纤维素的表面，反应盘的孔的壁，多孔板，试管，聚苯乙烯珠，磁珠，膜和微粒(例如胶乳颗粒)。该术语考虑了具有足够孔隙率以允许检测试剂接近以及适当表面亲和力以固定捕获试剂(例如寡核苷酸)的适当多孔材料。例如，硝化纤维素的多孔结构对多种试剂(例如捕获试剂)具有出色的吸收和吸附质量。尼龙具有类似的特性，也是适合的。微孔结构是有用的，在水合状态下具有凝胶结构的材料也是有用的。有用的固相支持体的其他实例包括天然聚合物碳水化合物及其合成修饰的、交联的或取代的衍生物，例如琼脂、琼脂糖、交联的藻酸、取代的和交联的瓜尔胶、纤维素酯(尤其是与硝酸和羧酸的纤维素酯)、混合纤维素酯和纤维素醚；含氮的天然聚合物，例如蛋白质和衍生物，包括交联或改性的明胶；天然烃聚合物，例如乳胶和橡胶；可以用适当的多孔结构制备的合成聚合物，例如乙烯基聚合物，包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯及其部分水解的衍生物、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、上述缩聚物的共聚物和三元共聚物(例如聚酯、聚酰胺)以及其他聚合物(例如聚氨基甲酸酯或聚环氧化物)；多孔无机材料，例如碱土金属和镁的硫酸盐或碳酸盐，包括硫酸钡，硫酸钙，碳酸钙，碱金属、碱土金属、铝和镁的硅酸盐；铝或硅氧化物或水合物，例如粘土、氧化铝、滑石、高岭土、沸石、硅胶或玻璃(这些材料可用作具有上述聚合物材料的过滤器)；以及以上类别的混合物或共聚物，例如通过在现有天然聚合物上引发合成聚合物的聚合而获得的接枝共聚物。

如本文所用，术语“特征”是指指示目标表型的标志物的集合，例如，包含≥3个突变的癌症特征，其指示携带突变的细胞或组织是肿瘤细胞。在一些实施方案中，特征包括标志物例如肿瘤标志物的组合的存在、不存在和/或丰度。通过组合各种探针组，可以设计出一种可靠的用于检测目标表型的方法。作为单一测定法进行的这种特征测试可以为评估和理解各种标志物之间的相互作用提供极大的好处。

术语“扩增”通常是指从靶核酸产生多个核酸分子，其中引物与靶核酸分子上的特定位点杂交以提供用于通过聚合酶延伸的起始位点。可以通过本领域通常已知的任何方法进行扩增，例如但不限于标准PCR、长PCR、热启动PCR、qPCR、RT-PCR和实时PCR。

如本文所用，术语“抗体”是指完整的免疫球蛋白，例如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，或抗体的片段(特别是抗原结合片段)，例如Fab、Fv或Fc，或融合抗体，融合抗体片段或抗体的任何其他衍生物。术语“标记的抗体”是指用酶、荧光染料、化学发光物质、生物素、亲和素或放射性同位素标记的抗体。

术语“表位”是指化合物(例如蛋白质、碳水化合物或脂质)的抗原区域。抗原区域通常由5至8个氨基酸组成。表位被相应抗体的抗原结合位点特异性识别。

如本领域技术人员已知的，术语“固定的组织或细胞”在本文中使用，并且是指通过化学固定方法保存而免于腐烂的生物组织或细胞。此类方法可防止此类生物组织或细胞内的自溶或腐败。固定可终止生化反应并增加被处理组织的机械稳定性。

术语“免疫组织化学”或“IHC”是指用于用能够特异性结合组织学样品中抗原的抗体检测所述抗原的存在的技术。抗体-抗原复合物的检测通常通过利用酶标记的抗体的显色反应或通过荧光标记的抗体进行。

如本文所用，术语“宏观切割”是指通过使用诸如切割刀或刮刀的工具从安装在诸如显微镜载玻片的固相支持体上的组织切片上刮削目标区域的过程。如本文所用，术语“显微切割”是指从组织样品中切割和分离一个或更多个特定细胞或目标区域的过程。显微切割可以例如使用激光捕获显微切割(LCM)通过用激光切割相关区域来执行。

如本文所用，术语“膜载玻片”是指用于激光捕获显微切割(LCM)的固相支持体或显微镜载玻片。对于显微切割，可以使用利用膜覆盖的载玻片或由利用各种膜覆盖的金属框架组成的框架载玻片。

术语“聚赖氨酸”是指包含多达数百个重复单元的分子，并且适合于增加样品(例如组织切片)与安装样品的膜侧之间的亲和力。根据说明书的聚赖氨酸是聚-L-赖氨酸。根据说明书的聚-L-赖氨酸具有70至300kDa的分子量。聚-L-赖氨酸可以被蛋白酶消化。根据说明书的另一种聚赖氨酸是例如聚-D-赖氨酸。根据说明书的聚-D-赖氨酸具有70至300kDa的分子量。聚-D-赖氨酸对蛋白酶消化有抵抗力。

术语“qPCR”通常是指称为实时定量聚合酶链反应，定量聚合酶链反应或动力学聚合酶链反应的PCR技术。该技术使用PCR同时扩增和定量靶核酸，其中定量是借助于嵌入的荧光染料或序列特异性探针进行的，所述探针包含仅与靶核酸杂交后才能检测到的荧光报告分子。

如本领域技术人员已知的，术语“RNA”在本文中使用，并且指mRNA前体，mRNA前体转录物，mRNA，转录物处理中间体，用于翻译的成熟mRNA和来自一个或多个基因转录物，或由此衍生的核酸。转录物处理包括诸如剪接、编辑、修饰和降解的过程。包括样品的mRNA包括例如mRNA，一个或多个基因的mRNA转录物，使用逆转录源自mRNA的cDNA，从扩增的DNA转录的RNA，从cDNA转录的cRNA，从基因扩增的DNA等。

在本文中可包括样品的“容器”被广义地解释为意指任何类型、形状或大小的容器，包括表面、孔、管或小瓶。容器不需要具有由任何特定材料制成的任何特定形状或尺寸，而仅用作能够对位于其内或之上的组织进行分析或操作的物理结构。

本文中“染色的”载玻片/基底是指经过处理以帮助揭示ROI样品与其他样品之间差异的基底，以便病理学家或其他受过训练的个体可以标记基底以表示基底上任何ROI的轮廓。“未染色”的载玻片/基底是未经处理但可能已经或可能未经过其他类型处理的基底。

术语从基底上的X样品中“分离”一个或更多个ROI包括以这样的方式处理X样品的方法：将X样品从基底上物理去除，消融(例如汽化或燃烧或物理分解)，或经过化学处理，因此不会污染以后对ROI样品中分子的分析。

本文中的术语“基底”是指各种载玻片，包括但不限于FFPE载玻片、组织载玻片、标准载玻片、容器、染色载玻片、未染色载玻片、活体组织等。

本文中的术语“样品”是指细胞组织、样本、组织样品、FFPE组织或使用标准分子生物学方法固定的其他生物材料。

本文中，“计算机处理器”或“计算装置”或“计算机”广义地解释为是指将执行其所需功能的任何硬件和/或软件组合。例如，处理器可以是可编程数字微处理器，例如以电子控制器、主机、服务器或个人计算机(台式或便携式)的形式可用。在处理器是可编程的情况下，适当的编程可以从合并在计算机主体中或位于远程位置的用户界面传达给处理器，或者可以预先保存在计算机程序产品中(例如便携式或固定计算机可读存储介质，其可基于磁性、光学或固态设备)。例如，磁性介质或光盘可以承载编程，并且可以由与每个处理器在其对应的用户界面处进行通信的合适的读取器读取。本文中的“用户界面”广义地解释为表示允许用户对计算机进行编程并由此通过计算机控制系统的某些操作的物理结构。实例包括主机或便携式计算机的键盘和监视器，其他类型的视觉监视器和键盘系统，例如平板式或智能手机式设备或其他远程设备。用户界面可以是计算机主体的物理部分，可以位于系统的其他位置，也可以位于计算机的远程位置，并且可以通过有线或无线连接与计算机处理器进行通信。

在未染色基底上数字标记ROI的方法

样品分析和切割通常涉及一系列包含平行样品切片的载玻片。可以对一组中的一个或更多个载玻片进行染色，例如以揭示单个细胞核和/或帮助区分不同类型的细胞，例如肿瘤学应用中的癌细胞和非癌细胞。病理学家可以检查基底并用笔或其他合适的标记设备标记载玻片上的目标区域(ROI)。然后可以将这些ROI或相关的笔标记与样品的相邻切片的基底进行定位(旋转和对齐)，最终对其进行分析，例如提取DNA进行基因组测序，提取RNA进行RNA表达分析或进行细胞的原位分析等。在手工样品切割方法中，将病理学家的笔标记手工转移到基底上，然后使用剃刀刀片从载玻片上的周围样品中切出ROI。

宏观切割技术不仅涉及目标区域的组织学切片，而且涉及被调查器官的周围组织的组织学切片，已经越来越多地用于许多病理学研究中，例如肿瘤分型，炎性疾病的诊断和变性疾病的确定。在宏观切割中，从组织样本(例如载玻片)中收集目标患者组织(“S”区域)，而排除不需要的区域(“X”区域)，因此仅使用“S”区域作为下游测定的输入材料。在某些情况下，病理学家提供的复杂“S”形定义可能导致组织技术人员难以进行刮削操作。通常需要复杂的刮削技术，如图1所示。本公开涉及用于处理生物样品的系统和方法，从而可以更准确地检测其中的分析物，优选不受非分析物的干扰，因此，通过改善信号质量和/或降低噪声，本发明的系统和方法大大改善了生物测定的结果，尤其是在分析异质样品(例如FFPE)中的分析物的背景下。

通过改善测定参数，例如信号质量和降低噪声，当前公开的系统和方法还改善了测定目的，例如，将生物标志物的存在/不存在或水平或活性与目标特征，例如种族特征(用于法医)或疾病特征相关联。

本公开的系统和方法部分地基于使用颗粒微喷射器来靶向和去除生物样本(例如组织学切片)中组织的特定区域并选择性地收集包含信号(“S”)的组织区域。该方法包括使用颗粒和受控的压缩气体或其他气体流以将颗粒引导至ROI。该方法优选是干法，其减少了样品污染和/或样品中分析物稀释的机会。

当前公开的方法可以在多种设置中使用。例如，在其中需要进行宏观切割的第一实施中，可以选择性地对基底(例如组织学载玻片)中的“X”区域进行微喷砂处理，而仅使基底上的“S”区域保持不受影响。之后，可以使用下游处理方法从基底上去除“S”区域。在同样需要进行宏观切割的第二种实施中，可以选择性地对基底(例如组织学载玻片)中的“S”区域进行微喷砂处理，而仅使基底上的“X”区域保持不受影响。可将“S”区域的组织从基底上去除，然后将颗粒收集到容器中，以使用下游处理进行处理。在不需要宏观切割的另一实施中，对基底的所有区域(“X”和“S”区域)进行微喷砂处理，并将这两个区域的内容物收集在容器中以进行下游处理。

图2示出了用于数字处理未染色载玻片呈递(unstained slide submission，USS)的示例性过程，其中质量和组织厚度不能被均匀地控制。该过程可以包括具有三个路径的两个平行过程，这三个路径可能导致平行过程合并。

根据一个方面，沿着第一平行路径，USS可以安装到支架上。所安装的USS可以存储在存储单元中以等待路径检查。创建USS的扫描图像。从存储单元中检索到USS。然后可以执行自动样品切割程序。

根据一个方面，沿着第二平行路径，将USS染色以产生参考载玻片。扫描参考载玻片以创建图像。创建一个数字化标记，其中包括参考载玻片上的目标区域(ROI)。然后确定标记是否能够上载到图像管理系统(IMS)。如果是这样，则第二平行路径与第一平行路径通过路径1合并。

在路径1中，呈递基底成功地通过当前的数字病理学解决方案转移了其标记。可以通过路径1在当前的数字工作流程中最早处理USS。

如果不是，则应用外部标记转移算法。如果能够转移标记，则路径2将第二平行路径连接到第一平行路径。例如，在路径2中，呈递基底需要开发当前数字病理解决方案外部的标记转移算法。该路径假设需要外部标记转移算法(例如，当前数字病理学解决方案中的能力)。

最后，可以通过路径3手工转移标记。例如，在路径3中，无法从呈递基底直接进行标记转移，并且需要病理学家在每个相关基底上手工执行数字标记。在路径1和路径2都无法继续执行的情况下，此路径是一种后备解决方案。该过程仍然至少可以在自动样品刮取系统中进行处理。

图3示出了收集“S”区域或去除“X”区域的方法。根据一个方面，“X”区域被去除并且仅“S”区域被留下以允许直通(从载玻片收集所有样品)方法用于样品收集。这是一种有效的方法，因为通常只有很小的“X”区域。例如，约50％的情况是直通(例如，没有“S”区)。在大多数情况下，“X”区域远小于“S”区域(例如，要去除的“X”区域更少)。

其他方面包括分解“X”区域(例如仅剩“S”区域和无活性的“X”区域)中的核酸，从而无需从基底上去除“X”区域。例如，分解的“X”区域不包含任何残留在“X”区域中的进一步影响分析的可量化DNA/RNA。因此，“X”区域中将没有可分析数量的DNA或RNA。

另外的方面包括作为直通方法在基底上直接裂解样品。这种方法可以部分分解细胞的磷脂双层和/或完全分解蛋白质，从而将样品加工成适合下游分析过程的液体裂解物。例如，样品可以暴露于裂解缓冲液或缓冲溶液中。裂解液的实例包括：高渗、低渗、pH调节溶液或含有酶(例如蛋白酶)的溶液。

所描述的过程可以适用于自动和手工工作流程。例如，它们可以与当前的手工刮削技术结合实现，因为“S”区域比“X”区域多得多，因此与仅收集“S”区域相比，更容易去除或分解“X”区域。

样品切割过程

图4示出了各种样品切割方法。根据本公开的方面，去除“X”区域可以在载玻片上仅留下“S”区域用于收集。例如，可以除去基底上所有不需要的样品，仅将所需的样品留在载玻片上作为直通提取。为了去除“X”区域，可以使用机械和非机械工具从基底中提取不需要的样品。

机械(例如接触式)工具可包括使用物理材料，例如剃刀刀片、机器铣削(标准或定制铣削工具)、刮匙、冲头、勺、微珠喷砂和真空抽吸，以直接从基底上去除不需要的样品。机械工具还可包括用于去除“X”区域的颗粒喷砂处理。

非机械工具可以包括使用间接接触技术，例如激光和水射流，以直接从基底上去除不需要的样品。各种激光系统包括飞秒激光系统，皮秒激光系统，纳秒激光系统，微秒激光系统，二氧化碳激光系统，锁模激光系统，脉冲激光系统，Q开关激光系统，Nd：YAG激光系统，连续激光系统，染料激光系统，可调激光系统，钛蓝宝石激光系统，大功率二极管激光系统，连续波激光或大功率光纤激光系统。例如，飞秒激光系统可以利用20W的平均功率，其具有中塔型(mid-tower)个人计算机(PC)的大小。激光器的其他实例包括但不限于二极管激光器、固态激光器、气体激光器和染料激光器。应当理解，与常规激光器相比，所利用的激光器可以配置为功率更低以产生更少的痕迹(footprint)。

核酸(例如DNA)可能会在“X”区域分解(例如变性)，仅剩下载玻片上的“S”区域和无活性的“X”区域进行收集。例如，在“X”区域中分解核酸将使那些区域变成对随后的过程是无活性的(例如，核酸含量不在影响基因表达的水平)。因此，不需要物理上去除/切割那些区域，并且可以使用直通样品收集方法。

可以利用非机械方法，例如激光、热、RF、超声、低温、等离子体等，来从基底(例如，载玻片)上分解不需要的“X”区域。

化学方法可以包括将化学试剂(例如，漂白剂、酸、碱和酶等)施加到“X”区域以分解核酸(例如，DNA/RNA)。NaOH或盐也可用于使核酸变性。另外的变性剂可包括蛋白质变性剂和核酸变性剂。漂白剂的示例性浓度可以是至少10％的漂白剂。可以组合化学试剂的组合，包括含有核酸内切酶和/或蛋白酶或0.05％-10.0％(重量/体积)的次氯酸钠的pH调节溶液。

根据多个方面，使用裂解缓冲液直接在基底上进行裂解过程可以绕过样品切割过程。例如，可以将具有样品的基底直接浸入具有裂解缓冲液的温控容器中，以将整个样品与基底分离。随后的蛋白激酶(ProK)蛋白消化可以在同一容器中和单独的过程/容器中进行。

根据本公开的多个方面，样品切割可以包括机械和非机械方法，以从基底提取不需要的样品(例如，不需要的“X”区域)。如上所述，机械(接触式)方法可以包括使用物理材料来直接从基底上切割不需要的样品。该系统可以在刮削动作之后利用物理刮削工具(例如颗粒微喷砂、喷砂、剃刀刀片、刮匙、冲头或勺子)与真空吸管相结合，以使用抽吸方法同时收集不需要的样品。

抽吸装置由低成本的一次性消耗品(例如带过滤器的塑料管)组成，以收集所有样品，并将在每种情况下进行更换以避免交叉污染。备选地，可以在样品之间清洁抽吸装置以消除交叉污染。过滤器具有停止样品流动但允许空气通过的功能。另外，样品不能完全堵塞过滤器从而阻塞空气通过。

然后，可以将取出的样品收集在废物箱中，从而在直通方法中仅在基底上留下“S”区域。例如，直通收集可以通过以下方式实现：(a)可以轻松实现自动化的直接单通剃刀刀片直通；(b)利用温控超声波水浴将样品从基底分离到容器/管中；和/或(c)在样品与基底分离后，在收集容器/管的底部施加静电荷。

非机械方法可包括使用间接技术(例如，诸如激光和水射流消融)以将不需要的样品与基底分离。例如，激光和水射流方法可以包括使用高压水射流或激光磨蚀技术在目标玻璃表面上施加力以将样品与基底分离。对于直通方法，这导致在基底上仅留下“S”区域。

可以通过以下方式完成直通收集：(a)可以轻松实现自动化的直接单通剃刀刀片直通；(b)利用温控超声波水浴将样品从基底分离到容器/管中；和/或(c)在样品与基底分离后，在收集容器/管的底部施加静电荷。

为了分解“X”区域，可以使用以下方法从基底提取不需要的样品。例如，非机械方法可以将不需要的“X”区域中的DNA从基底分解。根据一种实施方式，该系统将使用非接触式消融技术，例如激光、热、RF、超声、低温或等离子体，以从基底分解不需要的样品。对于上面概述的直通方法，这导致在基底上仅留下“S”区域。

化学方法可以包括将化学物质施加到“X”区域以分解DNA。例如，该系统可以在玻璃表面的目标“X”区域上施加化学试剂(例如漂白剂、酸、碱或酶等)，以从基底分解样品。对于上面概述的直通方法，这导致在基底上仅留下“S”区域。

应当理解，本公开不限于病理领域。它也可以用于预富集或分离靶标以及非靶标。确定的技术也可以单独使用或与其他集成系统结合使用。还应理解，用于直通的方法还可包括使用气动或上述方法的组合。

样本类型包括但不限于细胞培养物、冷冻切片、新鲜样品、液体活检和细胞学样品(即痰液、胸膜液等)。样本类型还可以包括非人类靶标。

目标样本也不限于基底。可以使用提供任何形式的容器作为系统的输入，以使系统对样本成像。其他实例包括盖玻片(即产生血液涂片)、生物反应器、带有成像冲头的细胞培养皿、样品收集纸或液流/液滴。

本公开的多个方面提供了诸如清洁、廉价且与高通量实验室兼容的优点，以直接从基底人工(例如，使用笔)提取目标区域，或者提供了易于使用的数字注释工具和基于对象的算法以在基底之间匹配数字标记的同时保持样本的形态，从而消除了为手工显微切割而生成多套未染色基底(USS)的需要。它还使完成所需任务所需的操作者干预风险最小化。

在一些实施方案中，切割系统可以使用诸如激光、水射流和超声之类的许多手段来切割基底以从不需要的样品中分离出ROI。

一些实施方案可以包括利用铣削技术的低成本机械系统。小型台式CNC铣床使用立式端铣刀/勺子(scooper)收集ROI(要保存的样品)或RONI(要丢弃的样品)样本的预定义数字标记。该台式系统允许用户处理一个在铣削外壳中的一组载玻片，垂直铣削工具(例如，具有抽吸特征的低成本旋转刮削夹具)将能够跟踪和收集具有预先定义的最终用户数字注释的样本。在一些实施方案中，可以将保存的样品转移到管中以进行后续处理。在其他实施方案中，残留在基底上的是S样品，其可以用剃刀刀片容易且干净地刮削。

例如，来自某些癌症的活检样品的大部分(例如超过40％)可能全部是S，而没有X，而许多其他样品具有相对小的X区域。如果使用小型端铣刀设置，端铣刀可能会有用于抽吸的内腔(即，研磨机可以是带有或不带有研磨尖端的海波管(hypotube)，以简化样品的机械加工)。如果X区域较小，则可以去除X区域。如果S区域较小，则可以机械加工并收集S区域。为简单起见，也可以只一致地去除所有X区域或收集所有S区域。在一些实施方案中，可备选地使用水射流法去除载玻片上的X样品，留下S样品。

在其他实施方案中，X材料在载玻片上被有效地消融或破坏，而S材料保持完整。这可以通过各种机械手段来完成，例如使X样品经受各种能源(例如颗粒微喷砂(例如，微珠喷砂)、激光、电解、超声、射频或热能源)或通过选择性冷冻干燥X样品。在一些实施方案中，消融X样品所必需的手段包括能源，例如能够裂解细胞和/或分解生物大分子(例如核酸和蛋白质)的激光、射频、电流、声音或热能源。例如，其中一些方法可以有效地燃烧和蒸发X样品。在一些实施方案中，该装置可以将适当的能源精确地引导到基底上的笔或数字化标记之外的区域，例如精确地聚焦激光或射频波或超声波，以使其仅影响X样品区域。例如，在一些实施方案中，脉冲激光、电解或超声装置可以用作消融和/或分解载玻片的X区域中的核酸的手段，使得载玻片上仅保留包含ROI的S区域。例如，可以将系统配置为，一旦执行了对S和X区域的跟踪，仅将脉冲激光、电解或超声设备引导到X区域。例如，可以用来自激光器、电解装置或超声装置的能量仅从一端到另一端扫描载玻片，仅与载玻片的X区域接触，因此仅消融X区域中的细胞。结果，载玻片的S区域保持完整，并且是载玻片上唯一完整的细胞材料。在一些实施方案中，能量可以有效地蒸发X区域中的样品，并且可以破坏那些区域中的目标分子，例如DNA和RNA，从而在后续分析中来自X区域的物质不会污染所得的分离的S区域。

在其他实施方案中，可以通过化学处理来有效地去除X区域，包括水空化方法(例如，超声水空化方法)，例如用一种或更多种从待分析样品中分解分子(例如DNA和/或RNA和/或蛋白质)的试剂。用于选择性分解X样品的化学手段包括，例如，添加漂白剂、强酸、强碱或靶向并分解大分子的酶(例如DNase、RNase和蛋白酶)。例如，基于载玻片上的数字化笔标记，可以将使用RNase或蛋白酶的化学处理仅引导至载玻片的X区域。RNase或蛋白酶可以例如将RNA或蛋白质分解为小片段或单体。作为化学处理的结果，例如，载玻片的X区域将不包含显著水平的用于分析的完整分子，因此，例如对处理过的样品中蛋白质或RNA表达水平的分析将仅反映样品的S部分中的表达水平，因为只有来自S部分的蛋白质和/或RNA会保持完整。

这两种方法中的任一种-消融X部分的细胞以有效去除X组织或化学变性X部分或其中的目标分子-都可以通过从包含X和S组织的载玻片上切下S组织来消除收集S组织的需要。作为替代，在“直通”组织收集方法中，可以收集载玻片上的整个组织，或将其用于以后的分析。例如，在“直通”收集中，将载玻片上的所有组织都去除，并且在S和X区域之间没有组织切割。因此，本文的方法与直通组织收集兼容，在直通组织收集中，当收集组织用于以后的分析时，不需要分离载玻片上的S和X组织。作为替代，可以简单地从载玻片上去除组织，例如通过用类似于铣削过程的旋转切割工具通过毛细管作用、抽吸等将其从载玻片上刮下并进入收集容器中。在这样的实施方案中，即使手工地进行组织收集，也不需要当前使用的高技能的剃刀刀片技术，该技术会引起伤害或导致低准确性。备选地，组织收集可以由仪器自动执行。这种自动化更容易实现，因为目标是收集所有组织，而无需将X区域与S区域分开。例如，可以将组织收集到合适的容器中，例如孔、小瓶或管中，以进行处理，例如细胞裂解和提取目标分子(例如DNA、RNA或蛋白质)。用于将组织从经处理的载玻片机械收集到容器中的手段包括，例如，喷砂，使用剃刀刀片或类似刀片刮去组织，或刮匙，勺子，冲头或真空吸取组织，添加溶液或另一物质以提供与载玻片表面相比的竞争性介质或表面，例如带电的表面或介质等。

在一些实施方案中，不是将用于分析的组织收集到例如孔、小瓶或管的容器中，而是例如可以在载玻片上直接进行某些步骤例如细胞裂解。再次，当X区域被消融或变性以去除或失活任何显著浓度的非目标分子以供以后的分析时，这可能是可能的。在一些这样的实施方案中，可以直接在组织载玻片上进行细胞裂解，例如使用适当的试剂盒，以及任选地还提取目标分子例如DNA、RNA或蛋白质。在一些实施方案中，这种过程可以由设备自动控制。例如，在一些实施方案中，可以将载玻片浸没在例如包含在孔或管或小瓶中的裂解缓冲液中，从而可以在载玻片上进行细胞裂解。在一些实施方案中，然后可以在浸没的载玻片上进行后续步骤，例如蛋白酶消化或DNase消化和/或RNA提取。

图5是在掩模508上的入射辐射502的示例性透射照射506和反射照射504的图500。这是因为辐射502被掩模508部分地阻挡，并且透射照射506仅可以到达样品512的某些区域(例如，仅特定百分比的能量可以作为波长的函数被传输)。基底510可以是1mm厚，其向透射照射506提供一些折射。例如，掩模508可以在载玻片510的顶侧上，使得辐射502被掩模508部分地阻挡，且辐射只能到达“X”区域。根据本公开的多个方面，掩模508可以包括光学、热、机械结构和/或化学掩模，以阻挡所施加的相关的热、激光、化学试剂(例如，微珠喷砂)等。应当理解，取决于所采用的工艺，暴露的部分可以被去除或变性。

图6示出了示例性的载玻片600，其具有标记的不需要的“X”区域602和在“X”区域602之间的目标区域(ROI)604(例如，“S”区域)。例如，“X”区域602和ROI 604可以通过上述过程确定。

图7示出了通过将掩模700覆盖在载玻片720上而从载玻片720去除不需要的“X”区域712和714的过程。例如，可以制备具有所描绘的不需要的“X”区域702、704和需要的“S”区域706的掩模载玻片710。例如，“X”区域702、704和“S”区域706可以通过上述过程确定。将掩模700覆盖在载玻片720上允许根据所描绘的部分从载玻片720去除不需要的“X”区域712和714。所得的载玻片720仅包括需要的部分716。应理解，取决于所采用的工艺，“X”区域712和714可以被去除或变性。

自动组织切割(ATD)系统的示例性实施方案利用了带有如图10和图11所示的一次性定制设计铣削工具的小型铣削系统(图12)，图10和图11描绘了与组织载玻片接合的铣削工具的远端切割部分。在该部分的前表面处，可以存在一个或多个切削刃，这些切削刃将在铣削工具的旋转过程中从载玻片上切下组织。该工具中可以有一个或更多个内腔(即通道)，以便通过真空抽吸将切下的组织压入内腔。切割部分可以与该工具的主体接合。该主体的功能是容纳收集的组织，与机器卡盘接合，容纳过滤器元件以及与切割部分接合。可以使用压缩气体或其他惰性气体来迫使切下的组织进入收集管。备选实施方案包括在搅拌、冲洗缓冲液通过下重力转移到收集管中，或将带有收集的组织的铣削工具直接放入试管中。在由一个或多个组织载玻片组成的每种情况下，可使用一个一次性铣削工具。

为减少加工时间，该定制铣刀设计为在直接驱动或气动的情况下以高转速运行。旋转速度可以达到或超过100,000rpm。这样可以提高进料速度；因此，该工具设计为能够承受以高转速运行时产生的工作应力和温度。

远端切割区域可以具有用于收集组织ROI的内腔，并且具有一个或多个径向布置在正面上的切削刃。该材料可以是钢，也可以是比组织硬的任何材料，并且有助于低成本的大批量加工。工程塑料可能是不错的选择，因为它们可以经济地注塑成型。由于对于某些组织类型，ROI可以接近750微米或更小，因此该正面的直径可能非常小。小内腔会严重增加切割部分的压差并限制气流。优选的是，在靠近切割界面的位置迅速缩小并立即增加内腔的尺寸。

主体的远端与切割部分接合。切割部分可以是螺纹的、插入成型的、粘合的、压配合的或任何其他合适的组装技术。在一个案例中，主体的内部空间足够容纳从所有载玻片收集的组织。近端具有与标准机器卡盘接合的特征。该材料可以是钢或保持强度以承受工作应力并有利于以低成本进行大批量加工的任何材料。工程塑料可能是不错的选择，因为它们可以经济地注塑成型。主体的近端还具有内部特征以与过滤器接合。它还具有合适的特征以与真空附件接口，该附件可以是通过直接真空或通过Venturi设备驱动的同轴(in-line)或离轴构造。

过滤器元件将阻止收集的组织通过，但允许空气或惰性气体通过。过滤器开口尺寸可以为50微米或更大。开口尺寸和过滤器的总体尺寸设计成使得收集的组织在处理结束时不会完全堵塞过滤器。过滤器需要承受工作压力和操作力。还可以整合泄压特征以防止堵塞。过滤器可以结合或机械附接到主体。也可以使用替代的夹持部件。

铣削工具的远端切割部分连接到主体。远端切割部分可包含与组织载玻片接合的一个或多个切削刃。远端切割部分设计将切割的组织引向切割部分的中心。在远端位置的一个或更多个切削刃被径向地定向。每个切削刃可以是直的或弯曲的。在操作期间刃与ROI的接触角使得将产生净矢量力，以将组织推向处理元件的中心，从而允许收集ROI。例如，可以将切削刃#1设置为垂直的，切削刃#2可以形成锐角，并且切削刃#3可以设置为钝角，这些位置中的每一个都设置为驱动切割的组织。优选的实施方案是设置由至少像切削刃#1一样设置的一个或多个刃构成的远端切割部分，并且优选的方向设置成像切削刃#2一样具有锐角。远端切割部分可以被设计成提高切割能力，包括锯齿边缘和锯齿位置(包括长度、宽度和深度)的变化。

图10和图11示出了根据各种实施方案的示例性样品铣削装置。如本文所示，设备1000包括第一组件1014和第二组件1010。第一组件1014在相对的端部上具有开口，第二组件1010被固定到第一组件1014的一端。第二组件1010还包括样品收集口1018，该样品收集口1018背向第二组件1010被固定到第一组件1014的位置，样品收集口1018具有沿着样品收集口1018的周边突出的一个或更多个样品刮削元件1020。真空通道1012延伸穿过第一组件1014和第二组件1010，以将样品收集口1018与第一组件1014的另一端上的真空连接口1022相连接。当操作装置1000以从基底收集样品时，旋转装置1000，使得样品刮削元件1020从基底表面机械地移除部分样品，同时通过使用真空泵将真空施加到第一组件1014的真空连接口1022上，通过样品收集口1018和真空通道1012收集所移除的样品部分。在各种实施方案中，可以通过连接到真空连接口1022的过滤器元件1016收集移除的样品部分。在各种实施方案中，移除的样品部分收集在与真空通道1012流体连通的容器中。

在各种实施方案中，第一组件1014和第二组件1010由不同的材料组成。在各种实施方案中，第一组件1014和第二组件101由相同的材料组成。可以使用的材料的实例包括但不限于：金属、聚合物、纤维玻璃等。

在各种实施方案中，第一组件1014和第二组件1010被制造为单个集成部件，而不是两个分离的单独部件。

在各种实施方案中，样品刮削元件1020沿着样品收集口1018的周边均匀地间隔开。在各个实施方案中，样品刮削元件1104沿着样品收集口1018的周边不同地间隔开。

图12示出了根据各种实施方案的示例性样品收集系统。如本文中所描绘，系统1200包括样品铣削装置1000，其位于保持样品1204的基底(即，载玻片)1202上方。样品铣削装置1000包括第一组件1014和第二组件1010。当样品铣削装置1000被操作时，其被旋转和定位(在X，Y和Z轴上)，使得装置1000的尖端接触样品1204以从基底1202的表面机械地去除样品1204的一部分，同时通过使用真空泵1206收集样品的去除部分，该真空泵向铣削装置1000的一端上的开口1208施加真空。

在各种实施方案中，样品铣削装置100可以在X，Y和Z轴方向上移动，使得其仅与样品1204的期望部分接触。在各种实施方案中，保持样品1204的载玻片1202可以在X，Y和Z轴方向移动，以使样品铣削装置1000。

在各种实施方案中，第一组件1014和第二组件1010由不同的材料组成。在各种实施方案中，第一组件1014和第二组件101由相同的材料组成。可以使用的材料的实例包括但不限于：金属、聚合物、纤维玻璃等。

示例性后续样品分析程序

可以收集ROI组织(或S组织)，以便可以各种方式对其进行分析或操作。例如，在一些实施方案中，如上所述，对收集的ROI组织进行细胞裂解，然后进行一个或更多个其他处理。在一些实施方案中，可以直接或在细胞裂解后从ROI组织中提取DNA和/或RNA和/或蛋白质、辅因子、膜脂质等，或者可以原位评估。

在一些实施方案中，本文的系统和方法涉及ROI组织中DNA的分析。例如，本文的系统和方法可以结合以下方式的ROI组织分析来使用：拷贝数变异(CNV)、单核苷酸多态性(SNP)、特定基因中的点突变、基因中缺失或插入突变的检测、转座的检测、易位、外来DNA(例如病毒或细菌DNA)的存在、DNA的甲基化等。在一些实施方案中，本文的系统和方法可以与ROI组织中的RNA种类的分析结合使用，例如确定基因的特定RNA转录物的水平或检测特定的可变剪接的RNA转录物及其相对水平，或干扰RNA的存在。RNA分析可以例如通过包括逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法(例如定量RT-PCR)，或通过整个转录组测序方法进行。在一些实施方案中，可以通过诸如免疫沉淀，ELISA，Western印迹，核酸等方法，诸如在原位或在细胞裂解程序之后，评估ROI组织中特定蛋白质的存在或水平。在一些实施方案中，可以评估ROI组织以检测其他分子(例如生物辅因子，细胞膜脂质或其他组分等)的存在或水平。

在图8A和图8B中示出了用于分析生物样品例如安装在载玻片上的FFPE组织的示例性系统和方法。

图8A示出了根据上述方法的用于处理和/或分析患者样品(例如肿瘤活检样品)的示例性方法。用包含颗粒和空气的接触介质对生物样品进行微喷砂处理。在一些实施方案中，接触介质可以包含非常适合用于分离患者样品中存在的特定目标分析物的颗粒。例如，二氧化硅颗粒或二氧化硅包被的颗粒，例如二氧化硅包被的铁磁珠，非常适合分离核酸标志物，例如带有错义突变或功能丧失突变的mRNA。颗粒微喷射器装载有这种颗粒，并且微喷射器的喷嘴指向期望的组织区域。例如，在病理样本的情况下，期望的区域可以是包含核酸的区域，例如已经被适当的染色剂染色的细胞核。备选地，在患者样本包含不同组织类型的情况下，所期望的区域可以是包含目标细胞的组织类型或组织层，例如，在胰腺癌的情况下，内衬胰管的上皮细胞。用接触介质(含有压缩气体和颗粒)对目标区域进行微喷砂，以去除目标细胞，然后将其收集并与组织裂解缓冲液合并以破坏细胞。这产生了细胞裂解物溶液，其中目标分析物(例如，在胰腺癌的情况下，编码KRAS、TP53、CDKN2A、SMAD4、BRCA1和/或BRCA2的突变核酸；参见Cicenas等人，Cancers(Basel)，28，9(5)，2017)被吸附到颗粒上。为了提高吸附速率，可以将缓冲溶液的pH调节至二氧化硅颗粒中的表面硅烷醇基团的pKa处或pKa以下，并且增加缓冲剂的盐含量。然后用溶液洗涤颗粒，使分析物吸附在其表面上，同时洗去裂解物溶液的其他组分，例如非分析物，例如蛋白质和脂质。可以使用下游分析技术例如PCR直接分析分析物。备选地，在用诸如PCR的核酸检测技术进行下游分析之前，用合适的洗脱液洗脱吸附在二氧化硅颗粒表面上的核酸。使用低离子强度和低pH的缓冲液可促进洗脱。如果需要，在微喷砂之前，可以使用显微切割技术(例如激光显微切割)对样品进行预处理，以进一步改善和/或靶向目标区域(ROI)。

图8B示出了根据上述方法的用于处理和/或分析生物样品(例如，用于博物馆档案的固定昆虫学样品或包含土壤微生物的接触载玻片)的示例性方法。用含有颗粒和气体的接触介质对生物样品进行微喷砂。在一些实施方案中，接触介质可以包含非常适合用于分离患者样品中存在的特定目标分析物的颗粒。例如，已被氨基、羧基、磺酸根和磷酸基团官能化的铝颗粒可用于分离特定的多肽标志物。颗粒微喷射器装载有这种颗粒，并且微喷射器的喷嘴指向期望的组织区域。例如，在固定的昆虫样本的情况下，期望的区域可以是包含目标标志物的区域，例如腹部。用接触介质(含有压缩气体和颗粒)对目标区域进行微喷砂，以去除目标细胞，然后将其收集并与组织裂解缓冲液合并以破坏细胞。这产生了细胞裂解物溶液，其中目标分析物被吸附到颗粒上(例如，肽被吸附到功能化的铝颗粒上)。为了提高吸附速率，取决于靶标的理化性质(例如，在可溶性蛋白的情况下为亲水性；在膜蛋白的情况下为疏水性)，可以使颗粒衍生化。然后用溶液洗涤颗粒，使得分析物吸附在其表面上，同时洗去裂解物溶液的其他组分，例如非分析物，例如脂质。可以使用下游分析技术例如质谱直接分析分析物。备选地，在用肽检测技术例如免疫印迹或质谱法进行下游分析之前，用合适的洗脱液洗脱吸附在铝颗粒表面上的多肽。如果需要，在微喷砂之前，可以使用显微切割技术(例如激光显微切割)对样品进行预处理，以进一步改善和/或靶向ROI。

计算机实现的系统

图9是示出计算机系统400的框图，在其上可以实现本教导的实施方案。在本教导的各种实施方案中，计算机系统400可以包括用于传达信息的总线402或其他通信机制，以及与总线402耦合以用于处理信息的处理器404。在各种实施方案中，计算机系统400还可以包括存储器，该存储器可以是随机存取存储器(RAM)406或其他动态存储设备，其耦合到总线402以确定用于由处理器404执行的指令。存储器也可以用于在由处理器404执行的指令执行期间存储临时变量或其他中间信息。在各种实施方案中，计算机系统400还可以包括只读存储器(ROM)408或其他静态存储设备，其耦合到总线402，用于存储静态信息和用于处理器404的指令。可以提供诸如磁盘或光盘之类的存储设备410，并将其耦合到总线402以存储信息和指令。

在各种实施方案中，计算机系统400可以经由总线402耦合到显示器412，例如阴极射线管(CRT)或液晶显示器(LCD)，以向计算机用户显示信息。可以将包括字母数字键和其他键的输入设备414耦合到总线402，以将信息和命令选择传达给处理器404。另一种类型的用户输入设备是光标控件416，例如鼠标，轨迹球或光标方向键，用于将方向信息和命令选择传达给处理器404并控制显示器412上的光标移动。此输入设备414通常在两个轴(第一轴(即x)和第二轴(即y))上具有两个自由度，使设备可以指定平面中的位置。然而，应当理解，这里还考虑了允许3维(x，y和z)光标移动的输入设备414。

与本教导的某些实施方式一致，响应于处理器404执行存储器406中包含的一个或更多个指令的一个或更多个序列，计算机系统400可以提供结果。这样的指令可以从另一计算机可读介质或计算机可读存储介质(例如存储设备410)读取到存储器406中。存储器406中包含的指令序列的执行可以使处理器404执行本文所述的过程。备选地，可以使用硬连线电路代替软件指令或与软件指令结合使用以实现本教导。因此，本教导的实施不限于硬件电路和软件的任何特定组合。

如本文所用，术语“计算机可读介质”(例如，数据存储，数据储存等)或“计算机可读存储介质”是指参与向处理器404提供指令以供执行的任何介质。这样的介质可以采取许多形式，包括但不限于非易失性介质、易失性介质和传输介质。非易失性介质的实例可以包括但不限于光学，固态，磁盘，例如存储设备410。易失性介质的实例可以包括但不限于动态存储器，例如存储器406。传输介质的实例可以包括但不限于同轴电缆，铜线和光纤，包括包含总线402的线。

计算机可读介质的常见形式包括，例如，软盘，软磁盘，硬盘，磁带或任何其他磁性介质，CD-ROM，任何其他光学介质，打孔卡，纸带，任何其他带有孔图案的物理介质，RAM，PROM和EPROM，FLASH-EPROM，任何其他内存芯片或磁带，或计算机可以从中读取的任何其他有形介质。

除了计算机可读介质之外，指令或数据还可以作为信号提供在通信设备或系统中包括的传输介质上，以将一个或更多个指令的序列提供给计算机系统400的处理器404以便执行。例如，通信设备可以包括具有指示指令和数据的信号的收发器。指令和数据被配置为使一个或更多个处理器实现本文公开中概述的功能。数据通信传输连接的代表性实例可以包括但不限于电话调制解调器连接、广域网(WAN)、局域网(LAN)、红外数据连接、NFC连接等。

应当理解，可以使用计算机系统400作为独立设备或者在诸如云计算网络的共享计算机处理资源的分布式网络上实现本文描述的流程图、图表和所附公开的方法。

取决于应用，可以通过各种手段来实现本文描述的方法。例如，这些方法可以在硬件、固件、软件或其任何组合中来实现。对于硬件实施，处理单元可以在一个或更多个专用集成电路(ASIC)，数字信号处理器(DSP)，数字信号处理设备(DSPD)，可编程逻辑设备(PLD)，现场可编程门阵列(FPGA)，处理器，控制器，微控制器，微处理器，电子设备，设计为执行本文所述功能的其他电子单元，或其组合中实现。

在各种实施方案中，本教导的方法可以被实现为固件和/或以诸如C，C++，Python等的常规编程语言编写的软件程序以及应用。如果被实现为固件和/或软件，则所描述的实施方案可以在存储有用于使计算机执行上述方法的程序的非暂时性计算机可读介质上实现。应当理解，可以在诸如图9的计算机系统400之类的计算机系统上提供本文描述的各种引擎，由此处理器404将根据由存储组件406/408/410和通过输入设备414提供的用户输入中的任何一项或其组合提供的指令来执行由这些引擎提供的分析和测定。

尽管结合各种实施方案描述了本教导，但是并不意图将本教导限于这样的实施方案。相反，如本领域技术人员将理解，本教导涵盖各种备选方案、修改和等同方案。

此外，在描述各种实施方案时，说明书可能已经提出了作为步骤的特定顺序的方法和/或过程。然而，在该方法或过程不依赖于此处阐述的步骤的特定顺序的程度上，该方法或过程不应限于所描述的步骤的特定顺序。如本领域普通技术人员将理解的，步骤的其他顺序是可能的。因此，说明书中阐述的步骤的特定顺序不应被解释为对权利要求的限制。另外，针对所述方法和/或过程的权利要求不应限于以所写顺序执行其步骤，并且本领域技术人员可以容易地理解，所述顺序可以变化，并且仍然在各种实施方案的精神和范围之内。

可以利用包括手持式设备、微处理器系统、基于微处理器的或可编程的消费电子产品、小型计算机、大型计算机等的其他计算机系统配置来实施本文描述的实施方案。这些实施方案也可以在分布式计算环境中实施，其中任务由通过网络连接的远程处理设备执行。

还应该理解，本文描述的实施方案可以采用涉及存储在计算机系统中的数据的各种计算机实现的操作。这些操作是需要物理操作物理量的操作。通常，尽管不是必须的，这些量采取能够被存储、传输、组合、比较和以其他方式操作的电或磁信号的形式。此外，所执行的操作通常用以下术语来指代，例如产生、鉴定、确定或比较。

形成本文描述的实施方案的一部分的任何操作都是有用的机器操作。本文描述的实施方案还涉及用于执行这些操作的设备或装置。本文描述的系统和方法可以被特定地构造用于所需目的，或者它可以是由存储在计算机中的计算机程序选择性地激活或配置的通用计算机。特别地，各种通用机器可以与根据本文的教导编写的计算机程序一起使用，或者构造更专用的装置以执行所需的操作可能更方便。

某些实施方案还可以体现为计算机可读介质上的计算机可读代码。所述计算机可读介质是可以存储数据的任何数据存储设备，所述数据随后可以被计算机系统读取。计算机可读介质的实例包括硬盘驱动器、网络附加存储(NAS)、只读存储器、随机存取存储器、CD-ROM、CD-R、CD-RW、磁带以及其他光学、闪存和非光学数据存储设备。计算机可读介质也可以分布在网络耦合的计算机系统上，从而以分布式方式存储和执行计算机可读代码。

实施例

本文描述的结构、材料、组成和方法旨在作为本公开的代表性实例，并且将理解，本公开的范围不限于实例的范围。本领域技术人员将认识到，可以通过对所公开的结构、材料、组成和方法进行变型来实践本公开，并且这种变型被认为在本公开的范围内。

实施例1：处理生物样品以获得核酸分析物

根据上述方法处理含有目标核酸的组织学样品。在此，接触介质包含非常适合用于核酸分离的颗粒。这些颗粒包括二氧化硅颗粒或二氧化硅包被的颗粒，例如二氧化硅包被的铁磁珠。颗粒微喷射器装有二氧化硅微粒，以提供从组织样本中分离核酸的有效方法。首先，通过利用二氧化硅颗粒的微喷砂从载玻片上除去所需的组织区域，然后将其收集并与组织裂解缓冲液合并以破坏细胞。这产生了细胞裂解物溶液，其中核酸被吸附到二氧化硅颗粒上。然后用溶液洗涤二氧化硅颗粒，该溶液使核酸吸附在其表面上，同时洗去裂解物溶液的其他成分，例如蛋白质和脂质。可以使用下游分析技术例如PCR直接分析核酸。备选地，在用诸如PCR的核酸检测技术进行下游分析之前，用合适的洗脱液洗脱吸附在二氧化硅颗粒表面上的核酸。如果需要，可以使用显微切割技术(例如激光显微切割)对样品进行预处理。

实施例2：处理生物样品以获得核酸和肽分析物

备选地，将上述实施例1中用于微喷砂处理的颗粒收集在一个容器中，并与最适合于选择性结合各种潜在分析物(例如核酸或蛋白质)的其他颗粒合并，所得颗粒的混合物用于分离目标分析物。如实施例1，在该备选设置中，首先选择与目标分析物结合(例如，基于电荷或疏水性或亲和力)的微喷砂颗粒。将微喷砂后产生的组织和颗粒的混合物与裂解缓冲液合并以破坏细胞，然后将所得的裂解物溶液与表面结合有寡核苷酸或抗体的颗粒合并，其中寡核苷酸或抗体特异性结合目标分析物。然后对颗粒对进行直接分析(例如色谱或光谱法)。备选地，使这些颗粒对经历一系列结合、洗涤和洗脱步骤以洗脱目标分析物，然后使用常规技术对其进行分析。最后，在目标分析物是蛋白质的情况下，裂解物溶液也可以进行其他分析步骤，例如酶测定、结合测定、功能测定等。

上述方法可以与任何分离和/或纯化步骤组合，这些步骤可以在工作流程的任何阶段进行，优选在最终分析步骤例如PCR(在核酸分析物的情况下)或ELISA(在蛋白质分析物的情况下)之前进行。例如，目标核酸通常通过一系列步骤从组织中分离，所述步骤包括：(a)组织裂解，其中通过各种方法破坏组织的细胞以使细胞破裂打开并将其内容物释放到溶液中；(b)将核酸吸附到固相表面上；(c)用溶液洗涤该固相，使核酸吸附在固相上，但除去其他生物分子；和(d)用溶液洗涤该固相，从固相洗脱核酸，使得收集的洗脱液包含分离的核酸。在这种方法中，通常使用二氧化硅膜和二氧化硅颗粒作为固相。也通常使用其他类型的颗粒，包括二氧化硅包被的或聚合物包被的铁磁珠。

根据前述描述，本领域技术人员可以容易地确定所述方法的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本公开的实践或测试中，但是在前述段落中描述了合适的方法和材料。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并不意图是限制性的。在有冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。

本文引用的所有美国专利和已公开或未公开的美国专利申请均通过引用并入本文。本文引用的所有公开的外国专利和专利申请均通过引用并入本文。本文引用的所有公开的参考文献、文件、手稿、科学文献均通过引用并入本文。与本文引用的科学数据库(例如，PUBMED，NCBI)有关的所有标识符和登录号通过引用并入本文。

选定实施方案的叙述

实施方案1.一种用于处理固定在基底上的样品的系统，包括：用于固定基底的支架单元；定位在所述支架单元附近的照相机；处理元件，其被配置为去除固定在所述基底上的一部分样品；以及通信连接到所述支架单元、所述照相机和所述处理元件的计算设备，包括图像捕获引擎，该图像捕获引擎被配置为使用相机获得具有第一固定样品的第一基底的第一图像和具有第二固定样品的第二基底的第二图像；数字标记引擎，该数字标记引擎被配置为允许用户生成包含所述第一张图像和所述第一固定样品的一部分的数字轮廓的标记图像；图像叠加引擎，该图像叠加引擎被配置为将所述标记图像叠加到所述第二图像上，以使所述第一固定样品和所述第二固定样品的图像轮廓对齐；以及样品去除引擎，该样品去除引擎配置为控制所述支架单元和所述处理元件的位置，以仅除去位于所述第一固定样品的数字轮廓中的所述第二固定样品的一部分。

实施方案2.根据实施方案1所述的系统，其中，所述处理元件被配置为利用机械工具去除所述样品的一部分。

实施方案3.根据实施方案2所述的系统，其中，所述机械工具包括喷砂、剃刀刀片、铣削工具、刮匙、打孔器、勺子、真空中的至少一种。

实施方案4.根据实施方案1至3中任一项所述的系统，其中，所述处理元件被配置为利用非机械工具去除所述样品的所述部分。

实施方案5.根据实施方案4所述的系统，其中，所述非机械工具包括激光或水射流中的至少一种。

实施方案6.一种用于处理固定在基底上的样品的方法，包括：获得具有第一固定样品的第一基底的第一图像；获得具有第二固定样品的第二基底的第二图像；产生包含第一图像和第一固定样品的一部分的数字轮廓的标记图像；将所述标记图像叠加在所述第二图像上，以使第一固定样品和第二固定样品的图像轮廓对齐；使用处理元件仅去除位于所述第一固定样品的数字轮廓中的所述第二固定样品的一部分。

实施方案7.根据实施方案6所述的方法，其中，所述去除包括利用机械工具去除所述第二固定样品的所述部分。

实施方案8.根据实施方案6或实施方案7所述的方法，该方法还包括：用喷砂、剃刀刀片、刮匙、打孔器、勺子、真空或以上组合中的至少一种去除所述第二固定样品的所述部分。

实施方案9.根据实施方案6所述的方法，其中，所述去除包括利用非机械工具去除所述第二固定样品的所述部分。

实施方案10.根据实施方案6或实施方案9所述的方法，该方法还包括用激光或水射流中的至少一种去除第二固定样品的所述部分。

实施方案11.一种用于处理固定在基底上的样品的系统，包括：用于固定基底的支架单元；定位在所述支架单元附近的照相机；处理元件，其被配置为提供核酸变性剂以使固定在所述基底上的一部分样品上的核酸变性；以及通信地连接到所述支架单元、所述照相机和所述处理元件的计算设备，包括图像捕获引擎，该图像捕获引擎被配置为使用相机获得具有第一固定样品的第一基底的第一图像和具有第二固定样品的第二基底的第二图像；数字标记引擎，该数字标记引擎被配置为允许用户生成包含所述第一图像和所述第一固定样品的一部分的数字轮廓的标记图像；图像叠加引擎，该图像叠加引擎被配置为将所述标记图像叠加到所述第二图像上，以使所述第一固定样品和所述第二固定样品的图像轮廓对齐；以及核酸变性引擎，该核酸变性引擎被配置为控制所述支架单元和所述处理元件的位置，从而仅使位于所述第一固定样品的数字轮廓中的第二固定样品的一部分中的核酸变性，所述核酸变性引擎包括用于进行化学分析的化学分析仪、质谱仪和/或用于进行细胞分析的细胞分析仪。

实施方案12.如实施方案11所述的系统，其中，所述核酸变性剂包括化学试剂。

实施方案13.根据实施方案12所述的系统，其中，所述化学试剂包括漂白剂、酸、碱或酶中的至少一种。

实施方案14.根据实施方案11至13中的任一项所述的系统，其中，所述处理元件被配置为利用非化学工具去除所述样品的所述部分。

实施方案15.根据实施方案14所述的系统，其中，所述非化学工具包括激光、热加热器、射频(RF)波、超声、低温或等离子体中的至少一种。

实施方案16：一种用于处理固定在基底上的样品的方法，包括：获得具有第一固定样品的第一基底的第一图像；获得具有第二固定样品的第二基底的第二图像；产生包含所述第一图像和所述第一固定样品的一部分的数字轮廓的标记图像；将所述标记图像叠加在所述第二图像上，以使第一固定样品和第二固定样品的图像轮廓对齐；使用处理元件使仅位于所述第一固定样品的数字轮廓中的所述第二固定样品的一部分中的核酸的变性。

实施方案17.根据实施方案16所述的方法，其中，所述变性包括将所述第二固定样品的所述部分暴露于化学试剂。

实施方案18：实施方案16或实施方案17的方法，所述方法还包括将第二固定样品的所述部分暴露于漂白剂、酸、碱或酶中的至少一种。

实施方案19.实施方案16的方法，其中，所述变性包括将所述第二固定样品的所述部分暴露于非化学工具。

实施方案20.根据实施方案16或实施方案19所述的方法，其进一步包括将所述第二固定样品的所述部分暴露于激光、热加热器、射频(RF)波、超声、低温或等离子体中的至少一种。

实施方案21：一种样品处理装置，包括：第一组件，其在相对的端部上具有开口；第二组件，其固定到所述第一组件的一端，其中第二组件还包括样品收集口，该样品收集口背向所述第二组件固定到所述第一组件的位置，该样品收集口具有沿着样品收集口的周边突出的一个或更多个样品刮削元件；真空通道，该真空通道延伸穿过第一和第二组件，以将所述样品收集口与所述第一组件的另一端上的真空连接口连接。

实施方案22.根据实施方案21所述的样品处理装置，其中，所述第一组件和所述第二组件由不同的材料组成。

实施方案23.根据实施方案22所述的样品处理装置，其中，所述第一组件和所述第二组件由相同的材料组成。

实施方案24：根据实施方案21至23中的任一项所述的样品处理装置，其中，所述样品刮削元件沿着所述样品收集口的周边均匀地间隔开。

实施方案25：根据实施方案21至23中的任一项所述的样品处理装置，其中，所述样品刮削元件沿着所述样品收集口的周边不同地间隔。

实施方案26.根据实施方案21至25中任一项所述的样品处理装置，还包括过滤器，该过滤器附接到所述第一组件的一端上的开口。

实施方案27.根据实施方案21所述的样品处理装置，其中，所述第一组件和所述第二组件被制造为单个集成装置。