生体组织试样的观察方法
阅读说明：本技术 生体组织试样的观察方法 (Method for observing biological tissue sample ) 是由 满欣 麻畑达也 于 2021-03-16 设计创作，主要内容包括：提供生体组织试样的观察方法。能够容易地掌握存在于生体组织内的观察对象区域,并且,能够容易地从生体组织的试样块切出多个试样片。具有以下工序：树脂包埋工序,形成试样块；固定工序,将所述试样块切分成多个试样片,将各个试样片固定于试样片放置部件,形成多个观察试样；观察对象区域确定工序,确定进行精密观察的观察对象区域；坐标确定工序,按照各个所述观察试样确定所述观察对象区域在所述试样片上的坐标并进行登记；铣削工序,参照所述坐标,对所述试样片的所述观察对象区域照射以气体为离子源的离子束或中性粒子束,使位于所述试样片的内部的观察面露出；以及拍摄工序,通过扫描型电子显微镜取得所述观察面的SEM像。(Provided is a method for observing a biological tissue sample. An observation target region existing in a living tissue can be easily grasped, and a plurality of sample pieces can be easily cut out from a sample block of the living tissue. Comprises the following steps: a resin embedding step of forming a sample block; a fixing step of cutting the sample block into a plurality of sample pieces, fixing each sample piece to a sample piece mounting member, and forming a plurality of observation samples; an observation target region determining step of determining an observation target region to be subjected to precision observation; a coordinate determination step of determining and registering coordinates of the observation target region on the sample piece for each of the observation samples; a milling step of irradiating the region of the sample piece to be observed with an ion beam or a neutral particle beam using a gas as an ion source with reference to the coordinates to expose an observation surface located inside the sample piece; and an imaging step of acquiring an SEM image of the observation surface by a scanning electron microscope.)
技术领域
本发明涉及生体组织试样的观察方法。
背景技术
在医学生物学领域、再生医疗、制药领域的生体组织的调查研究中，要求立体地观察生体组织的形态。例如，在再生医疗中，根据iPS(induced pluripotent stem cells：诱导性多能干细胞)细胞制作作为脏器的基础的微脏器。微脏器还用于制药中的研究开发的筛选。将这种微脏器进一步切成若干个而立体地掌握脏器或组织的微细构造的需求非常高。
但是，由于观察中使用的显微镜的能力(倍率、焦点深度、分辨率)等理由，生体组织的立体观察不一定容易，存在各种课题。例如，为了立体地捕捉脏器等生体组织的构造，要求在深度方向上以数十μm为单位统一进行观察。
在光学显微镜中，由于光的波长的制约，数百nm左右是分辨率的极限，最大倍率达到千倍左右。由于肉眼的分辨率为0.1mm左右，因此，很难通过光学显微镜详细地观察生体组织。此外，在通常的光学显微镜中，焦点深度不足，很难立体地观察生体组织。
因此，例如，还提出了使用透过型电子显微镜(TEM)立体地观察生体组织的方法。透过型电子显微镜(TEM)的分辨率大约为0.1nm左右，最大能够以五十万倍左右的倍率进行观察。但是，在基于TEM的观察方法中，虽然分辨率足够高，但是，因透过能力，试样厚度存在制约。具体而言，由于需要使与试样产生非常强的相互作用的电子线透过，因此需要将试样的厚度抑制为小于1μm。因此，虽然TEM适合细胞内部的构造分析，但是，不适用于观察组织的立体构造的目的。
另一方面，扫描型电子显微镜(SEM)具有能够立体且高分辨率地进行组织级别的分析的能力。在SEM中，使电子束的直径收敛于2～3nm以下进行像观察，电子束的直径成为分辨率的极限，因此，最大能够以十万倍以上的倍率观察对象物。
但是，在利用SEM的生体组织的观察中，以往，为了进行立体构造的观察，需要使用冰冻切断法。该情况下，需要用于冰冻试样的专用的冰冻装置，存在很难瞄准希望观察的部位而进行切断这样的课题。此外，在冰冻切断法中，需要利用金属涂敷试样表面，只能观察表面的形态，不适合于观察组织的立体构造的目的。
因此，例如，在专利文献1中公开了如下的生物组织试样的观察方法：对从生物组织切出的试样进行固定、脱水和石蜡包埋而得到试样块，从该试样块切出厚度为15～50μm左右的试样，将其转载于载玻片，进行脱石蜡处理后，利用重金属系的染色剂对试样进行染色，利用SEM进行观察。
专利文献1：国际公开第2019/082293号
但是，在专利文献1所记载的生物组织试样的观察方法中，在切出生物组织时需要熟练技术，很难为了更加精密地观察试样而减薄试样的厚度。此外，得到的试样的朝向不固定，需要在观察时进行SEM像的对准。并且，在作为观察对象的生物组织在样本中存在于较窄范围处的情况下，为了使作为观察对象的生物组织露出，需要在较宽范围处切断整个样本。
发明内容
本发明是鉴于上述课题而完成的，其目的在于，提供如下的生体组织试样的观察方法：能够容易地掌握存在于生体组织内的观察对象区域，并且，能够容易地从生体组织的试样块切出多个试样片。
为了解决上述课题，本发明提出以下手段。
即，本发明的生体组织试样的观察方法观察生体组织试样的立体形态，其特征在于，所述生体组织试样的观察方法具有以下工序：树脂包埋工序，在对从生体组织切出的试样进行染色后，将该试样包埋于树脂中，形成试样块；固定工序，将所述试样块切分成多个试样片，将各个试样片固定于试样片放置部件，形成多个观察试样；观察对象区域确定工序，通过光学显微镜观察各个观察试样，确定进行精密观察的观察对象区域；坐标确定工序，通过扫描型电子显微镜观察所述观察对象区域，按照各个所述观察试样确定所述观察对象区域在所述试样片上的坐标并登记该坐标；铣削工序，参照所述坐标，对所述试样片的所述观察对象区域照射以气体为离子源的离子束或中性粒子束，使位于所述试样片的内部的观察面露出；以及拍摄工序，通过扫描型电子显微镜取得所述观察面的SEM像。
根据本发明，将包埋有生体组织的试样块切分成多个试样片，通过对各个试样片进行铣削而在深度方向上进行切削，并且取得SEM像，因此，在从试样块切分多个试样片时，与以往相比，能够较厚地切出各个试样片的厚度。由此，能够使以往需要高级技术的试样片的切出变得容易。
此外，为了在深度方向上切削各个试样片的观察对象区域，通过将气体作为离子源的离子束或中性粒子束进行铣削，因此，能够使在深度方向的内部设定的观察面露出，而不损伤比较柔软的试样即生体组织的树脂包埋物的细胞等。
此外，先利用光学显微镜观察试样片并确定观察对象区域，通过SEM观察来寻找最初所确定的观察对象区域，记录其坐标，由此，在铣削工序和拍摄工序中，能够在深度方向上准确地切削观察对象区域并得到SEM像。
此外，在本发明中，也可以交替地多次进行所述铣削工序和所述拍摄工序，取得所述试样片的所述观察对象区域的在厚度方向上连续的SEM像。
此外，在本发明中，也可以在交替地多次进行所述铣削工序和所述拍摄工序后，将所述试样片保留于所述试样片放置部件。
此外，在本发明中，试样片的厚度也可以为100nm以上且300nm以下的范围。
此外，在本发明中，所述铣削工序中的所述气体也可以是氩或氙。
发明效果
根据本发明，能够提供如下的生体组织试样的观察方法：能够容易地掌握存在于生体组织内的观察对象区域，并且，能够容易地从生体组织的试样块切出多个试样片。
附图说明
图1是阶段地示出本发明的生体组织试样的观察方法的流程图。
图2是示出固定有试样片的多个观察试样的外观图。
图3是示出扫描型电子显微镜的概略结构图。
标号说明
11：玻璃板(试样片放置部件)；
12a～12f：试样片；
13a～13f：观察试样；
20：扫描型电子显微镜；
21：电子束镜筒；
22：检测管；
23：控制部；
24：气体离子束镜筒；
EB：电子束；
GB：气体离子束。
具体实施方式
下面，适当参照附图对本实施方式进行详细说明。在以下说明所使用的附图中，为了容易理解本发明的特征，有时为了方便而将作为特征的部分放大示出，各结构要素的尺寸比率等有时与实际不同。以下说明中例示的材质、尺寸等是一例，本发明不限于此，能够在发挥其效果的范围内适当地变更实施。
图1是阶段地示出本发明的生体组织试样的观察方法的流程图。
作为应用于本实施方式的生体组织，例如列举有各种脏器、由iPS细胞制造出的微脏器等组织片或细胞块等。首先，使用刀、例如单刃刀等对这样的生体组织进行整形(修整)，以使其成为直径为数mm左右的圆筒形、数mm见方的长方体(修整工序S1)。另外，像微脏器等那样原本的大小就是1mm左右的情况下，能够省略修整工序S1。
接着，在利用福尔马林液等固定了修整后的生体组织后，进行染色处理(染色工序S2)。生体组织的染色能够使用各种染料，例如能够使用甲苯胺蓝溶液。甲苯胺蓝是碱性焦油系色素，针对生体组织中的酸性粘液多糖类、例如结缔组织(透明质酸、硫酸软骨素B)、软骨基质(硫酸粘液素、硫酸软骨素A、C)、肥胖细胞(肝素)、上皮内粘液等示出异染色(异染性)。
接着，对染色后的生体组织进行脱水处理(脱水工序S3)。例如通过乙醇脱水来进行生体组织的脱水。此时，树脂的包埋是否成功取决于是否严格地进行了基于浓度100wt％的乙醇的脱水，因此，预先使用无水硫酸铜制作浓度100wt％的乙醇来使用即可。
接着，利用树脂包埋脱水后的生体组织，得到试样块(包埋工序S4)。在包埋工序S4中，需要预先促进包埋树脂对生体组织的浸透。例如，即使是浓度100wt％的乙醇，环氧类树脂这种疏水性树脂也不容易溶解。为了在电子显微镜级别下使包埋用的树脂遍及到生体组织的各个部位，需要置换为针对乙醇和树脂亲和性均较高的溶剂(置换剂)。
在包埋用的树脂使用环氧类树脂的情况下，作为这样的置换剂，优选使用氧化丙烯。例如，使环氧类树脂溶解于氧化丙烯，使其与生体组织混合。然后，在使氧化丙烯蒸发后利用环氧类树脂进行包埋。然后，以60～80℃左右进行干燥，由此，得到生体组织被树脂包埋的试样块。
接着，在将试样块切分成多个试样片后，将各个试样片固定于试样片放置部件即玻璃板，形成多个观察试样(固定工序S5)。另外，也可以代替玻璃板而使用塑料制的载玻片等。首先，在将由树脂包埋的试样块切分成多个试样片时，例如，要将被树脂包埋的试样块装配于切片机。在从试样块切出试样片时，例如，使用玻璃刀，以厚度成为例如100nm以上且300nm以下的范围的方式从试样块切出在深度方向上连续的多个试样片。
将被切出的试样片放置于滴在玻璃板(载玻片)上的水滴上，并使水分蒸发。由此，如图2所示，得到在玻璃板11固定连续的试样片12a～12f而得到的多个观察试样13a～13f。
关于以此方式得到的观察试样13a～13f，在接下来，通过光学显微镜观察各个观察试样，确定进行精密观察的观察对象区域(观察对象区域确定工序S6)。在该观察对象区域确定工序S6中，在光学显微镜的试样台依次设置观察试样13a～13f，分别观察试样片12a～12f，决定进行深度方向的立体观察的观察对象区域。
接着，使用扫描型电子显微镜(SEM)对在观察对象区域确定工序S6中确定的进行立体观察的观察对象区域进行观察，按照各个观察试样13a～13f，确定观察对象区域在试样片12a～12f上的坐标并进行登记(坐标确定工序S7)。
在该坐标确定工序S7中，通过SEM取得每个观察试样13a～13f的表面的SEM像，根据该SEM像，将在观察对象区域确定工序S6中确定的观察对象区域在试样片12a～12f上的坐标值(X轴、Y轴)存储在SEM的控制部中。
接着，如图3所示，在扫描型电子显微镜(SEM)20中依次设置观察试样13a～13f(参照图2)，取得试样片12a～12f上的观察面的SEM像(拍摄工序S8)。
在使用SEM20进行的生体组织的观察中，通过使用低真空扫描电子显微镜(低真空SEM)，能够抑制生体组织的带电。在SEM20中，从电子束镜筒21对试样片12a～12f照射电子束EB，利用检测管22检测从试样片12a～12f产生的反射电子BE和二次电子SE。
由此，得到基于反射电子的图像信号和基于二次电子的图像信号。SEM像可以是仅利用基于反射电子的图像信号得到的反射电子SEM像，也可以是基于二次电子的二次电子SEM像。此外，也可以是基于如下图像信号的SEM像，该图像信号是对基于反射电子的图像信号和基于二次电子的图像信号进行相加得到的。SEM20的控制部23存储所得到的试样片12a～12f的SEM像(第1次)的图像数据。
另外，在拍摄工序S8中，针对从电子束镜筒21照射的电子束EB在试样片12a～12f上的照射位置，读出在坐标确定工序S7中得到的观察对象区域在试样片12a～12f上的坐标值(X轴、Y轴)。由此，能够准确地对在观察对象区域确定工序S6中确定的进行立体观察的观察对象区域照射电子束EB，得到作为目标的SEM像。
接着，从气体离子束镜筒24对试样片12a～12f的观察对象区域照射以气体、例如氩或氙为离子源的气体离子束GB，使位于试样片12a～12f的内部的新的观察面露出(铣削工序S9)。
另外，在铣削工序S9中，除了使用气体离子束GB以外，还能够使用氩等稀有气体元素、氧等中性粒子束。通过使用中性粒子束，能够减少充电的影响。
气体离子束镜筒24能够使氩气等气体(gas)离子化并以1kV左右的低加速电压进行照射。与试样加工中使用的会聚离子束(FIB)等相比，这样的气体离子束GB的会聚性低，因此，针对试样片12a～12f的蚀刻速率变低。由此，能够在不对生体组织等柔软的试样片12a～12f造成较大损伤的前提下进行精密的切削加工。
另外，在铣削工序S9中，也针对从气体离子束镜筒24照射的气体离子束GB针对试样片12a～12f的照射位置，读出在坐标确定工序S7中得到的观察对象区域在试样片12a～12f上的坐标值(X轴、Y轴)。由此，能够准确地对在观察对象区域确定工序S6中确定的进行立体观察的观察对象区域照射气体离子束GB，能够以减小观察对象区域的厚度的方式进行切削。
此外，在铣削工序S9之后，优选适当地确认试样片12a～12f的厚度(厚度确认工序S10)。在该厚度确认工序S10中，能够通过能量分散型X射线分析(Energy dispersive X-ray spectroscopy：EDS)、反射电子的强度变化来进行测定。
接着，取得通过铣削工序S9而露出的、通过在深度方向上对试样片12a～12f进行切削而得到的新的观察面的SEM像(拍摄工序S8)。然后，存储该新的观察面的SEM像(第2次)的图像数据。
如上所述，反复进行铣削工序S9和拍摄工序S8，直到达到试样片12a～12f的预先设定的规定的深度或预先设定的规定的摄像次数。由此，得到在试样片12a～12f的观察对象区域中的深度方向上连续的规定次数的SEM像(n次的像)。
然后，在控制部23中，针对试样片12a～12f，分别将n次的SEM像作为三维SEM图像进行图像处理，然后，对试样片12a～12f进行将各个三维SEM图像在深度方向上排列的图像处理，由此，能够得到试样块整体的观察对象区域中的深度方向的三维SEM图像。
另外，优选设定为在得到全部的摄像次数的SEM像后分别以规定的厚度保留试样片12a～12f。由此，能够将具有保留的试样片12a～12f的观察试样13a～13f作为其他的观察材料使用以及保存，能够在以后进行再次验证等。
如以上说明的那样，根据本实施方式的生体组织试样的观察方法，将利用树脂包埋生体组织而得到的试样块切分成多个试样片，通过对各个试样片进行铣削而在深度方向上切削，并且取得SEM像，因此，在从试样块切分多个试样片时，与以往相比，能够较厚(100nm～200nm左右)地切出各个试样片的厚度。由此，能够使将以往需要高级技术的试样片的切出变得更为容易。
此外，为了在深度方向上切削各个试样片的观察对象区域，通过气体离子束进行铣削，因此，能够使在深度方向的内部设定的观察面露出，而不损伤比较柔软的试样即生体组织的树脂包埋物的细胞等。然后，对全部的观察面的SEM像合成为三维像，由此，能够容易地得到存在于样本的生体组织内的观察对象区域的三维SEM图像。
此外，通过先利用光学显微镜观察试样片并决定观察对象区域，利用SEM记录该观察对象区域坐标，在铣削工序S9和拍摄工序S8中，能够在深度方向上准确地切削观察对象区域并得到SEM像。
并且，如果设定为在得到全部摄像次数的SEM像后以规定的厚度保留试样片，则还能够保存所保留的试样片，在以后进行再次验证等。
以上说明了本发明的实施方式，但是，这些实施方式是作为例子进行提出的，并不意图限定发明的范围。这些实施方式能够以其他各种方式实施，能够在不脱离发明主旨的范围内进行各种省略、置换、变更。这些实施方式及其变形包含在发明的范围和主旨内，同样包含在权利要求书记载的发明及其均等的范围内。