一种靶向抑制骨肿瘤的复合纳米粒子及制备方法
阅读说明：本技术 一种靶向抑制骨肿瘤的复合纳米粒子及制备方法 (Composite nano particle for targeted inhibition of bone tumor and preparation method thereof ) 是由 吴宏伟 钟午 许彦 黄钢 黄少兵 于 2020-05-15 设计创作，主要内容包括：本发明实施例公开了一种靶向抑制骨肿瘤的复合纳米粒子,按照重量份数包括如下组分：透明质酸3～5份、四丁基氢氧化铵水溶液25～35份、聚乙二醇3～5份、二甲氨基吡啶0.8～1.2份、纳米羟基磷灰石3～5份、氮氮羰基二咪唑3～5份、无水二甲基亚砜180～240份,其制备方法包括依次制备HA-TBA混合产物、PEG-HA复合物、PEG-HA-HAP纳米粒子和载唑来膦酸PEG-HA-HAP/Zol纳米粒子；本发明将纳米羟基磷灰石制成了靶向制剂发挥骨肿瘤抑制作用,既可局部给药抑制肿瘤和骨破坏,也可全身给药靶向聚集在骨肿瘤部位,促进骨修复,是一种潜在的既能抗肿瘤,又能修复骨质的新型纳米靶向制剂。(The embodiment of the invention discloses a composite nanoparticle for targeted inhibition of bone tumor, which comprises the following components in parts by weight: 3-5 parts of hyaluronic acid, 25-35 parts of tetrabutylammonium hydroxide aqueous solution, 3-5 parts of polyethylene glycol, 0.8-1.2 parts of dimethylaminopyridine, 3-5 parts of nano-hydroxyapatite, 3-5 parts of azodicarbonyl diimidazole and 180-240 parts of anhydrous dimethyl sulfoxide, wherein the preparation method comprises the steps of sequentially preparing an HA-TBA mixed product, a PEG-HA compound, PEG-HA-HAP nanoparticles and zoledronic acid-loaded PEG-HA-HAP/Zol nanoparticles; the nano hydroxyapatite is prepared into a targeting preparation to play a role in inhibiting bone tumor, can be locally administered to inhibit tumor and bone destruction, can be systemically administered to target and gather at the bone tumor part to promote bone repair, and is a potential novel nano targeting preparation which can resist tumor and repair bone.)
技术领域
本发明实施例涉及纳米粒子制备技术领域，具体涉及一种靶向抑制骨肿瘤的复合纳米粒子及制备方法。
背景技术
目前临床治疗对原发及转移性骨肿瘤还存在诸多挑战，骨肉瘤、骨转移瘤还通常要化疗或靶向药物治疗以杀死肿瘤细胞，以减轻肿瘤性的骨质破坏。这些药物无论是全身治疗还是局部治疗，都需要药物尽可能的靶向到肿瘤部位，增加肿瘤杀伤作用，减小全身副作用。
唑来膦酸是一种常见抑制破骨细胞的药物，对治疗骨巨细胞瘤、骨质疏松、恶性骨肿瘤的溶骨性骨破坏具有明显的治疗作用。但是，唑来膦酸全身用药会产生明显的毒副作用如下颌骨坏死，异位骨化、发热、恶心、呕吐食道灼伤等不良反应，且由于水溶性差，经肠吸收差、生物利度低，静脉注射很快就会被肾脏清除，因此，如何解决唑来膦酸靶向给药是目前函待解决的问题。
纳米羟基磷灰石是正常骨组织的主要成分之一，其纳米尺度的结构可以和高分子物质结合，并将药物负载进该纳米粒中，可以实现药物的缓慢释放。但是，单纯用纳米羟基磷灰石体内注射对身体有损伤。
透明质酸(HA)和聚乙醇酸(PEG)是在药物缓释领域应用非常广泛的两种材料。透明质酸是内源性高分子聚合物，其生物相容性好，能广泛与细胞表面尤其是肿瘤细胞表面的CD44结合。因此，选用其与纳米羟基磷灰石组合，可使纳米粒子具有主动靶向结合肿瘤细胞的能力。此外，经透明质酸和聚乙二醇修饰的纳米羟基磷灰石复合靶向纳米粒子还具有修复骨破坏的功能。
该纳米靶向制剂可以利用实体瘤组织中血管丰富、血管壁间隙较宽、结构完整性差的特点，使得粒径在50-500nm的纳米粒子可以透过骨肿瘤的毛细血管壁，实现其在肿瘤组织处的富集，这是一种被动靶向行为。
所以，基于该纳米粒子对骨肿瘤组织的主动靶向和被动靶向两种能力，有望成为一种新型的纳米靶向制剂，使其既可靶向骨肿瘤病灶杀死肿瘤细胞，又可对骨破坏的区域产生骨修复作用，可以满足唑来膦酸定时、定位、定量释放的要求。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种靶向抑制骨肿瘤的复合纳米粒子及制备方法，以解决现有技术中的问题。
为了实现上述目的，本发明的实施方式提供如下技术方案：
在本发明实施例的第一个方面，提供了一种靶向抑制骨肿瘤的复合纳米粒子，按照重量份数包括如下组分：
透明质酸3～5份、四丁基氢氧化铵水溶液25～35份、聚乙二醇3～5份、二甲氨基吡啶0.8～1.2份、纳米羟基磷灰石3～5份、氮氮羰基二咪唑3～5份、无水二甲基亚砜180～240份。
作为本发明一种优选的方案，按照质量分数计包括如下组分：
透明质酸HA4份、四丁基氢氧化铵水溶液30份、聚乙二醇4份、二甲氨基吡啶1份、纳米羟基磷灰石4份、氮氮羰基二咪唑4份、无水二甲基亚砜210份。
作为本发明一种优选的方案，所述四丁基氢氧化铵水溶液的浓度为40％。
在本发明实施例的第二个方面，提供了一种靶向抑制骨肿瘤的复合纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
步骤100、制备HA-TBA混合产物，取0.4g透明质酸、3mL 40％四丁基氢氧化铵水溶液混匀搅拌溶解，取450nm无菌滤头对搅拌溶解后的混合溶液进行过滤，然后冻干得到HA-TBA混合产物；
步骤200、制备PEG-HA复合物，取所述HA-TBA混合产物、以及0.4g的聚乙二醇8000溶解于10mL无水二甲基亚砜中，加入0.1g二甲氨基吡啶，搅拌反应1天，得到PEG-HA复合物；
步骤300、制备PEG-HA-HAP纳米粒子，取0.4g纳米羟基磷灰石，0.4g氮氮羰基二咪唑加入10mL无水二甲基亚砜中进行初步反应，然后再加入PEG-HA复合物二次搅拌反应24h后，停止反应，将产物溶液依次经过离心，去除上清液，超声分散后进行透析处理，最后冻干获得PEG-HA-HAP纳米粒子；
步骤400、制备载药PEG-HA-HAP/Zol纳米粒子，取0.4g PEG-HA-HAP纳米粒子，0.2g的唑来膦酸钠，分散搅拌后离心，取沉淀物冻干处理，获取最终产物载药PEG-HA-HAP/Zol纳米粒子，即为能够靶向抑制骨肿瘤的复合纳米粒子。
作为本发明一种优选的方案，所述步骤100中，搅拌溶解是在室温下搅拌30分钟完成。
作为本发明一种优选的方案，所述步骤200中，搅拌反应1天是在37度的恒温环境下。
作为本发明一种优选的方案，所述步骤300中，初步反应是先冰浴超声20min，40度搅拌反应4h。
作为本发明一种优选的方案，所述步骤300中，去除上清液后再次加入10mL无水二甲基亚砜，超声分散三次，并用1mL无水二甲基亚砜重新分散。
作为本发明一种优选的方案，透析处理的方法包括：将重新分散后的液体装好在分子量为3500的透析袋内，用去离子水透析1天，且每隔1h换一次水，冻干得到产物PEG-HA-HAP/Zol纳米粒子。
作为本发明一种优选的方案，所述步骤400中，分散搅拌包括：2mL去离子水分散和低转速搅拌2h。
本发明的实施方式具有如下优点：
本发明将纳米羟基磷灰石制成了靶向制剂发挥骨填充作用，避免了传统载药人工骨系统难以灵活给药的缺点，是一种既能抗肿瘤，又能修复骨质的纳米靶向制剂。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明实施方式中制备方法的流程示意图；
图2为本发明实施方式中纳米羟基磷灰石粒子的透射电镜图；
图3为本发明实施方式中载药PEG-HA-HAP/Zol纳米粒子粒径分布曲线；
图4为本发明实施方式中不同组分纳米粒子红外光谱图；
图5为本发明实施方式中纳米粒核磁图谱；
图6为本发明实施方式中载唑来膦酸的PEG-HA-HAP/Zol纳米粒药物释放曲线；
图7为本发明实施方式中经载唑来膦酸的PEG-HA-HAP/Zol纳米粒处理的骨肉瘤143b细胞毒性实验示意图。
图8为骨肉瘤143b细胞经本本发明纳米粒子和其它纳米粒子处理后的细胞凋亡结果。
图9为骨肉瘤143b细胞经本本发明纳米粒子和其它纳米粒子处理后的凋亡相关蛋白结果。
图10为本发明的纳米粒子经灌胃和尾静脉注射小鼠后不同时间点的纳米粒子分布图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种靶向抑制骨肿瘤的复合纳米粒子，按照重量份数包括如下组分：
透明质酸3～5份、四丁基氢氧化铵水溶液25～35份、聚乙二醇3～5份、二甲氨基吡啶0.8～1.2份、纳米羟基磷灰石3～5份、氮氮羰基二咪唑3～5份、无水二甲基亚砜180～240份；所述四丁基氢氧化铵水溶液的浓度为40％。
实施例1：
该靶向抑制骨肿瘤的复合纳米粒子按照质量分数计包括如下组分：
透明质酸3份、四丁基氢氧化铵水溶液25份、聚乙二醇3份、二甲氨基吡啶0.8份、纳米羟基磷灰石3份、氮氮羰基二咪唑3份、无水二甲基亚砜180份；所述四丁基氢氧化铵水溶液的浓度为40％。
实施例2：
该靶向抑制骨肿瘤的复合纳米粒子按照质量分数计包括如下组分：
透明质酸HA4份、四丁基氢氧化铵水溶液30份、聚乙二醇4份、二甲氨基吡啶1份、纳米羟基磷灰石4份、氮氮羰基二咪唑4份、无水二甲基亚砜210份。
实施例3：
该靶向抑制骨肿瘤的复合纳米粒子按照质量分数计包括如下组分：
透明质酸5份、四丁基氢氧化铵水溶液35份、聚乙二醇5份、二甲氨基吡啶1.2份、纳米羟基磷灰石5份、氮氮羰基二咪唑5份、无水二甲基亚砜240份；所述四丁基氢氧化铵水溶液的浓度为40％。
本发明提供了一种靶向抑制骨肿瘤的复合纳米粒子的制备方法，具体的组分以实施例2为例，如图1所示，包括如下步骤：
步骤100、制备HA-TBA混合产物
取0.4g透明质酸(HA)、3mL40％四丁基氢氧化铵水溶液(TBA)混匀搅拌溶解，室温搅拌30min后，取Millex-HV的450nm无菌滤头对上述溶液进行过滤，冻干，得到HA-TBA混合产物。
步骤200、制备PEG-HA复合物
取上一步得到的HA-TBA混合产物、以及0.4g的PEG8000溶解于10mL无水DMSO中，加入0.1g二甲氨基吡啶(DMAP)，37度搅拌反应1d，备用。
步骤300、制备PEG-HA-HAP纳米粒子
取0.4g纳米羟基磷灰石,0.4g氮氮羰基二咪唑(CDI)加入10mL无水DMSO中，冰浴超声20min，40度搅拌反应4h。取上一步PEG-HA复合物反应液，加入反应液中继续搅拌反应24h，关闭反应装置。将产物溶液离心，弃去上清液，并再加入10mL无水DMSO，使用超声分散仪分散，重复三次，并用1mL无水DMSO重新分散。将该液体装好，并用去离子水透析1d(透析袋的分子量为3500)，每1h换一次水，冻干，得到产物PEG-HA-HAP纳米粒子。
步骤400、制备载药PEG-HA-HAP/Zol纳米粒子，即为最终产物。
取PEG-HA-HAP纳米粒子0.4g，唑来膦酸钠(ZOL)0.2g，并加入2mL去离子水分散，低转速搅拌2h，离心，取沉淀冻干，得到载药PEG-HA-HAP/Zol纳米粒子。
对获取的载药PEG-HA-HAP/Zol纳米粒子分别进行粒径、红外光谱、核磁共振氢谱、动态光散射、透射电镜和体外释放率的测试，结果分别如下：
(1)粒径的结果如图3的分布曲线所示。
(2)红外光谱。
取少量固体HAP、PEG、HA、HA-TAB、PEG-HA-HAP纳米粒子、载药PEG-HA-HAP/Zol纳米粒子样品，样品与红外干燥的溴化钾粉末，混均研细后，压成透明的样品溴化钾片，测样品红外图谱如图4所示。
(3)核磁共振氢谱。
取少量固体HAP、PEG、HA、HA-TAB、PEG-HA-HAP纳米粒子、载Zol的PEG-HA-HAP/Zol纳米粒子样品、游离Zol，溶解于重水中，并测定核磁共振氢谱。跟据核磁共振氢谱求出各组分含量，载药量。
如图5所示，a：载唑来膦酸PEG-HA-HAP/Zol纳米粒；b：唑来膦酸。
(4)动态光散射。
将制备的载药PEG-HA-HAP/Zol纳米粒子放入比色杯中，将比色杯放入动态光散射粒度仪样品中进行测试，每个样品测试3次，每次1min。测试条件：氩离子激光器，波长658nm、温度25±0.1度、动态光散射角90度。同时测定Zeta电位，操作条件：11.4v/cm,13.0mA，25度C，样本溶剂用蒸馏水稀释。
(5)透射电镜。
将PEG-HA-HAP纳米粒子、载药PEG-HA-HAP/Zol纳米粒子滴在涂有碳支撑膜的铜网上，2％磷乌酸染色，自然干燥后于透射电镜下观察其形态，如图2所示。
(6)体外释放率。
精确量取载药PEG-HA-HAP/Zol纳米粒子，放入透析袋(截留分子量8000-12000kDa)中，将透析袋分别置入Ph为7.4、5.6的HCl-PBS缓冲溶液中，在37度，100rpm的条件下避光振荡，分别在0、0.5、1、2、4、8、12、24、48h将整个释放介质用新鲜介质置换，采用紫外-可见分光光度计测定释放量，计算释放率。
如图6所示，图中上方的曲线为：单纯唑来膦酸水溶液释放曲线；中间的为：PH＝7.4时的纳米粒药物释放曲线。下方的为：PH＝5.4时的纳米粒药物释放曲线。
纳米粒子在血液循环中：血浆中的调理素、整合素等会吸附于纳米粒子表面，使其易于被吞噬细胞识别，进而被单核吞噬细胞系统(MPS)及网状内皮系统(RES)吞噬，极大地降低了药物的生物利用率。对于纳米粒子的体内清除，目前主要采取的手段是通过对纳米粒子表面进行修饰，即通过多种方法使亲水性聚合物黏附于粒子表面，使体内清除最小化。聚乙二醇(PEG)是一种用途极为广泛的高分子化合物，具有优异的生物相容性。实验证明，将PEG接枝到纳米粒子表面时，其柔软的PEG链段能高度修饰、交替重叠覆盖在纳米粒子表面，形成致密的构象云，通过立***阻减少血浆中蛋白的吸附，从而使其在血液中的驻留时间延长，达到长循环的效果。
经载唑来膦酸的PEG-HA-HAP/Zol纳米粒处理的骨肉瘤143b细胞毒性实验结果如图7至图10所示：
A：对照组未处理；
B：1ug/ml纳米粒；
C：5ug/ml纳米粒；
D：各组细胞体外毒性CCK曲线。
143b：人骨肉瘤细胞；HSF：人成纤维细胞；ASC：大鼠脂肪干细胞。HSF、ASC为对照。
纳米粒子被动靶向肿瘤组织后，骨巨细胞瘤的高效摄取可通过其主动靶向机制实现，CD44是乳腺癌干细胞表达的特征性表面标志物之一，其作为肿瘤标靶的应用前景得到学术界的广泛认可，研究表明CD 44促进侵袭性肿瘤转移,抑制CD 44的活性则诱导侵袭性肿瘤凋亡。透明质酸(HA)俗称波尿酸，常用于美容手术等，是一种体内广泛存在的糖胺多糖,对于维持细胞外基质结构及调节细胞内活动有一定的作用。由于CD 44是透明质酸的受体，可以使用透明质酸制成两亲性嵌段共聚物，便能高效的靶向骨巨细胞瘤。能够灵活给药、并高效治疗骨巨细胞瘤。
本发明将纳米羟基磷灰石制成了靶向制剂发挥骨填充作用，避免了传统载药人工骨系统难以灵活给药的缺点，是一种既能抗肿瘤，又能修复骨质的纳米靶向制剂。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。