阅读说明：本技术 高分子型抗癌药的抗肿瘤效果的增强剂 (Enhancer of antitumor effect of polymer-type anticancer drug ) 是由 吴鑫 于 2020-03-23 设计创作，主要内容包括：一种双药物制剂型癌症治疗药及其药物试剂盒、以及抗肿瘤效果增强剂相关药物的用途。通过在给予高分子型抗癌药的前后或者同时给予含有碳酸磷灰石但不含高分子型抗癌药的增强剂,可有效地将高分子型抗癌药聚积于肿瘤组织,其抗肿瘤效果得到急剧增强。(A dual-drug cancer therapeutic agent, its drug kit, and the use of the related drugs of anti-tumor effect enhancer are provided. By administering an enhancer containing carbonic apatite but not containing a polymer type anticancer drug before, after or simultaneously with the administration of the polymer type anticancer drug, the polymer type anticancer drug can be efficiently accumulated in the tumor tissue, and the antitumor effect thereof can be drastically enhanced.)

高分子型抗癌药的抗肿瘤效果的增强剂

技术领域

本发明涉及一种用于增强高分子型抗癌药的抗肿瘤效果的增强剂。此外，本发明还涉及一种使用了该增强剂的癌症治疗药。

背景技术

近年来，由于癌症治疗药和治疗方法等的进步，癌症患者的生存率呈上升趋势，但癌症仍然在日本占死因的第1位，即便是现在，每年也有30万以上的日本国民因患癌症而死亡。

癌症的治疗方法大体分为手术疗法、放射线疗法、化学疗法。其中，化学疗法是向癌症患者给予抗癌药的疗法，其应用于手术疗法或放射线疗法的前后用于根除其病灶提高治愈力的术前/术后的辅助化学疗法中，或者应用于用手术疗法或放射线疗法不能治疗的全身转移的癌症的治疗中。以往，代谢拮抗剂、烷化药、铂制剂、拓扑异构酶抑制剂、分子靶向药、抗肿瘤性抗生素等各种抗癌药实际应用于临床，对一些癌症已经达到了期待治愈的程度。

然而，尽管以往的抗癌药确认到了一定的治疗效果，但也有治疗效果不充分或者依病例不同而效果存在参差不齐的情况，化学疗法达到的治疗效果有限也是事实。因此，近年来，为了提高化学疗法的治疗效果，研究并提出了各种用于增强抗癌药的抗肿瘤效果的技术。例如，专利文献1中报道了通过二硝酸异山梨醇能够增强铂制剂的抗肿瘤效果。此外，专利文献2中报道了通过醛酮还原酶1C家族抑制剂能够增强抗癌药的抗肿瘤效果。进一步，专利文献3中报道了通过磷酸二酯酶III B抑制剂能够增强顺铂的抗肿瘤效果。

另一方面，近年来，开发了聚合物结合抗癌药、核酸制剂(包括核酸单体和封入脂质体等DDS(药物递送系统)中的核酸)、抗体等高分子型抗癌药。高分子型抗癌药对毛细血管壁的通透性等有限，与分子量在1000道尔顿以下的低分子量抗癌药呈现出不同的体内动态。因此，要想提高高分子型抗癌药达到的治疗效果，需要进行单独的技术开发。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利特开2011-144190号公报

专利文献2：日本专利特开2011-102255号公报

专利文献3：日本专利特开2009-242378号公报

发明内容

发明要解决的技术问题

本发明的目的在于提供一种增强高分子型抗癌药的抗肿瘤效果的增强剂。此外，本发明的目的还在于提供一种使用该增强剂的用于治疗癌症的癌症治疗药。

用于解决技术问题的方案

本发明的发明人为了解决上述技术问题进行了认真细致的研究，结果发现，通过在给予高分子型抗癌药的前后或者同时给予含有碳酸磷灰石、但不含高分子型抗癌药的增强剂，可上调血管通透性因子的表达，提高肿瘤组织内血管通透性，有效地将高分子型抗癌药聚积于肿瘤组织，其抗肿瘤效果得到急剧增强。本发明基于该发现并通过进一步不断研究而得以完成。

即，本发明涉及用于增强高分子型抗癌药的抗肿瘤效果的增强剂，所述增强剂含有碳酸磷灰石，不含高分子型抗癌药。优选地，所述高分子型抗癌药为聚合物结合抗癌药。优选地，所述增强剂还含有白蛋白。

本发明提供一种双药物制剂型癌症治疗药，其含有第一药物制剂和第二药物制剂，其中，所述第一药物制剂含有碳酸磷灰石，不含高分子型抗癌药；所述第二药物制剂含有高分子型抗癌药。优选地，所述高分子型抗癌药为聚合物结合抗癌药。优选地，所述第一药物制剂还含有白蛋白。

本发明还提供一种药物试剂盒，其含有上述双药物制剂型癌症治疗药。

本发明还提供碳酸磷灰石在制造不含高分子型抗癌药的增强剂中的用途，其中，所述增强剂是用于增强高分子型抗癌药的抗肿瘤效果的增强剂。优选地，所述高分子型抗癌药为聚合物结合抗癌药。优选地，所述增强剂还含有白蛋白。

本发明还提供第一药物制剂和第二药物制剂在制造双药物制剂型癌症治疗药中的用途，其中，所述第一药物制剂含有碳酸磷灰石，不含高分子型抗癌药；所述第二药物制剂含有高分子型抗癌药。优选地，所述高分子型抗癌药为聚合物结合抗癌药。优选地，所述第一药物制剂还含有白蛋白。

本发明还提供碳酸磷灰石在制备用于提高肿瘤组织内血管通透性的药物中的用途，其中，所述药物含有碳酸磷灰石。优选地，所述药物还包括白蛋白。

本发明还提供碳酸磷灰石在制备用于上调血管通透性因子表达的试剂中的用途，其中，所述试剂含有碳酸磷灰石。优选地，所述试剂还包括白蛋白。优选地，所述血管通透性因子包括选自IFN-γ、H2O2和TNF的因子。

发明效果

根据本发明，可上调血管通透性因子的表达，提高肿瘤组织内血管通透性，有效地将聚合物结合抗癌药、核酸制剂(包括核酸单体和封入脂质体等DDS中的核酸)、抗体等高分子型抗癌药聚积于肿瘤组织，能够格外显著地增强高分子型抗癌药的抗肿瘤效果。

附图说明

图1是显示测定联合使用碳酸磷灰石(iNaD)所产生的P-THP聚积时的IVIS测定方案的图。

图2是显示图1所示的IVIS测定方案中从给予P-THP开始经1和27小时后的肿瘤成像结果的图。右边所示的曲线图是将成像结果数值化后的曲线图。

图3是显示图1所示的IVIS测定方案中从给予P-THP开始经1和27小时后的正常组织成像结果的图。

图4是显示联合使用iNaD所产生的P-THP抗肿瘤效果的检验结果的图。

图5是显示测定联合使用碳酸磷灰石(iNaD)所产生的L-OHP聚积时的IVIS测定方案的图。

图6是显示图5所示的IVIS测定方案中肿瘤和肝脏中L-OHP聚积量测定结果的图。

图7是显示联合使用iNaD所产生的L-OHP抗肿瘤效果的检验结果的图。

图8是显示进行肿瘤内血管造影的结果以及用荧光强度对肿瘤内的血管通透性进行定量化的结果的图。

图9显示的是微阵列分析和IPA的实验方案(左上)、通过微阵列分析将信号值进行log2变换的值涂色而进行热图(heatmap)分析的结果(左下)、通过使用IPA的通路分析对IFN-γ、H₂O₂和TNF所参与的网(network)进行图示的结果(右上)、以及由IPA结果表明的通过给予iNaD而使表达提高的因子(Z分数(Z-score)在2.0以上)(右下)。

具体实施方式

1.增强剂

本发明的增强剂以增强高分子型抗癌药的抗肿瘤效果的目的而使用，其特征在于，以碳酸磷灰石作为有效成分，不含高分子型抗癌药。下面，对本发明的增强剂进行详细描述。

[碳酸磷灰石]

本发明增强剂中含有碳酸磷灰石，不含高分子型抗癌药。尤其是，本发明中使用不含高分子型抗癌药的碳酸磷灰石。“不含高分子型抗癌药的碳酸磷灰石”是指在粒子内部不含高分子型抗癌药的碳酸磷灰石。在后述的碳酸磷灰石的制备方法中，如果在含有碳酸磷灰石制造原料的水溶液中含有高分子型抗癌药，就会生成含高分子型抗癌药的碳酸磷灰石，因此，本发明中使用在制备工序中不添加高分子型抗癌药而得到的碳酸磷灰石。

碳酸磷灰石具有以CO₃基团取代羟磷灰石(Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂)的一部分羟基而得到的结构，是以通式Ca_10-mX_m(PO₄)₆(CO₃)_1-nY_n表示的化合物。其中，X为可部分取代碳酸磷灰石中Ca的元素，例如可列举Sr、Mn、稀土类元素等。m通常为0以上1以下的数，例如0以上1以下的正数，优选为0以上0.1以下，更优选为0以上0.01以下，进一步优选为0以上0.001以下。Y为可部分取代碳酸磷灰石中CO₃的基团或元素，可列举OH、F、Cl等。n通常为0以上0.1以下的数，例如0以上0.1以下的正数，优选为0以上0.01以下，更优选为0以上0.001以下，进一步优选为0以上0.0001以下。

本发明中使用的碳酸磷灰石粒子的平均粒径只要是给予到生物体内能够向细胞内移动程度的大小，就没有特别限制。具体而言，作为本发明中使用的碳酸磷灰石粒子的平均粒径，可列举通常30nm以上，例如大于30nm，优选为30～3000nm，进一步优选为30～2000nm，特别优选为30～1500nm。

另外，上述的碳酸磷灰石的平均粒径是使用动态光散射法粒子测定(DLS)所测得的值。当存在不适合于使用DLS的测定的巨大粒子(例如粒径在5μm以上)的情况下，将这些巨大粒子从测定对象范围除去。此外，本说明书中，粒径是指用扫描型探针显微镜测定时可作为单个粒子识别的独立粒子的粒径。因此，当多个粒子聚集的情况下，这些粒子的聚集体判定为一个粒子。

对本发明的增强剂的制剂形态没有特别限制，从抑制碳酸磷灰石粒子的再聚集以保持上述平均粒径的状态、并有效地增强高分子型抗癌药的抗肿瘤效果的观点出发，优选分散液态。

对本发明的增强剂中所述碳酸磷灰石的浓度没有特别限制，以斟酌给予方法等能够满足后述给予量的方式进行适当设定即可。例如，本发明的增强剂为分散液的情况下，作为所述碳酸磷灰石的浓度，可列举1×10⁸～1×10¹²个/ml，优选为1×10⁹～1×10¹¹个/ml，更优选为1×10⁹～5×10¹⁰个/ml，进一步优选为3×10⁹～3×10¹⁰个/ml，更进一步优选为6×10⁹～1.5×10¹⁰个/ml。

此外，本发明的增强剂为分散液的情况下，分散所述碳酸磷灰石的溶剂，只要是药学上允许的且可以分散碳酸磷灰石的溶剂就没有特别限制，具体可列举生理盐水、其他缓冲溶液。

对制造上述平均粒径的碳酸磷灰石的方法没有特别限制，具体可列举包括制备碳酸磷灰石粒子分散在药学上允许的溶剂中的分散液的工序及根据需要对该分散液附加超声波振荡处理的工序的方法。

碳酸磷灰石粒子可通过已知的方法得到。例如，可通过在水溶液中使钙离子、磷酸根离子和碳酸氢根离子共存进行制备而得到。水溶液中的各离子浓度只要能形成碳酸磷灰石粒子就没有特别限制，可参考下述进行适当设定。

水溶液中的钙离子浓度可列举通常0.1～1000mM，优选为0.5～100mM，进一步优选为1～10mM。

水溶液中的磷酸根离子浓度可列举通常0.1～1000mM，优选为0.5～100mM，进一步优选为1～10mM。

水溶液中的碳酸氢根离子浓度可列举通常1.0～10000mM，优选为5～1000mM，进一步优选为10～100mM。

作为钙离子、磷酸根离子和碳酸氢根离子的供给源，只要可在水溶液中供给这些离子就没有特别限制，例如可列举这些离子的水溶性盐。具体而言，可使用CaCl₂作为钙离子源，可使用NaH₂PO₄·2H₂O作为磷酸根离子源，可使用NaHCO₃作为碳酸根离子源。

用于制备碳酸磷灰石粒子的水溶液，只要能形成碳酸磷灰石粒子即可，还可含有上述的各离子供给源及其他物质以外的成分。例如，在水溶液中，还可通过在上述组合物中添加氟离子、氯离子、Sr、Mn、聚乙二醇(PEG)等来部分取代碳酸磷灰石中的Ca或CO₃等或者进行修饰。但氟离子、氯离子、Sr、Mn、PEG等的添加量优选为对形成的复合物粒子的pH溶解性、粒径范围不产生显著影响的范围内。此外，用于制备碳酸磷灰石粒子的水溶液只要使用水作为基剂即可，也可使用培养细胞用的各种培养液或缓冲液等。

制备本发明中使用的碳酸磷灰石粒子中，向水溶液中混合各离子供给源及其他物质的顺序没有特别限制，只要能得到目标的碳酸磷灰石粒子，可以以任何的混合顺序制备水溶液。例如，可在制备含有钙离子及其他物质的第一溶液的同时，另外制备含有磷酸根离子及碳酸氢根离子的第二溶液，混合第一溶液与第二溶液来制备水溶液。

碳酸磷灰石粒子可通过将含有上述各离子的水溶液的pH调节至6.0～9.0的范围并放置一定时间(孵育)来得到。作为形成碳酸磷灰石粒子时的该水溶液的pH，例如可列举6.5～9.0，优选为6.7～8.8，进一步优选为6.7～8.6，更进一步优选为6.8～8.5，特别优选为7.0～8.5，最优选为7.1～8.0。

形成碳酸磷灰石粒子时的该水溶液的温度条件，只要能形成碳酸磷灰石粒子就没有特别限制，但通常为0℃以上，例如可列举4℃以上、或者37℃。

用于形成碳酸磷灰石粒子的该水溶液的孵育时间，只要能形成碳酸磷灰石粒子就没有特别限制，但可列举通常1分～24小时，优选为5分～1小时。有无粒子形成例如可通过在显微镜下观察来确认。

此外，作为将碳酸磷灰石粒子的平均粒径控制在上述范围的方法，没有特别限制，例如，可在粒子的制造过程中混入分散剂，也可在形成粒子后再加入。关于分散剂的种类，只要是可分散碳酸磷灰石粒子就没有特别限制，只要是通常添加于医药品的分散剂即可，作为一个例子，可列举白蛋白。分散剂可单独使用一种，也可两种以上组合使用。含有碳酸磷灰石粒子的水溶液中的分散剂的浓度，只要能够获得微细化和/或再聚集抑制效果就没有特别限制，例如可列举0.1～500mg/ml，优选为1～100mg/ml，进一步优选为1～10mg/ml程度；或者为0.001～10重量％程度。粒径控制方法的另一个例子，可列举对上述的水溶液中形成的碳酸磷灰石粒子进行超声波振荡处理的方法。作为超声波振荡处理，具体可列举：使超声波破碎机等的超声波振子直接接触样品向其施加超声波的处理；使用具有超声波振子及水槽(清洗槽)的超声波清洗器，在该水槽中加入液体(例如水)，将收纳有碳酸磷灰石粒子的容器(例如塑料管)浮于其中，经由液体向含有碳酸磷灰石粒子的水溶液施加超声波的处理等。通过这样的超声波振荡处理，可便捷且有效地将碳酸磷灰石粒子的粒径微细化到上述范围。

上述的超声波振荡处理的条件，只要能将粒径控制在所定范围就没有特别限制。例如，使用具有超声波振子及水槽(清洗槽)的超声波清洗器进行处理的情况下，可列举下述的条件。

水槽的温度：例如为5～45℃，优选为10～35℃，进一步优选为20～30℃。

高频输出：例如为10～500W，优选为20～400W，进一步优选为30～300W，更进一步优选为40～100W。

振荡频率：例如为10～60Hz，优选为20～50Hz，进一步优选为30～40Hz。

处理时间：例如为30秒～30分，优选为1～20分，进一步优选为3～10分。

超声波振荡处理时使用的收纳碳酸磷灰石粒子的容器的种类，只要能将粒子微细化至所定的粒径范围就没有特别限制，可根据水溶液的容量和使用目的等适当选择。例如，可使用1～1000ml容量的塑料管。

此外，超声波振荡处理优选在分散剂的存在下(即将分散剂添加于含有碳酸磷灰石粒子的水溶液中的状态)进行。这是因为，通过在分散剂与碳酸磷灰石粒子共存的环境下进行超声波振荡处理，可得到具有更加微细粒径的碳酸磷灰石纳米粒子，还可抑制粒子的再聚集。

[用途/使用方法]

本发明的增强剂以增强高分子型抗癌药的抗肿瘤效果的目的而使用。

“高分子型抗癌药”是指分子量大于1000道尔顿的抗癌药。作为高分子型抗癌药，具体可列举聚合物结合抗癌药、具有抗肿瘤效果的核酸制剂(包括核酸单体和封入脂质体等DDS中的核酸)、具有抗肿瘤效果的抗体、光动力学疗法的敏感性物质(白蛋白结合型ICG、聚合物型锌原卟啉(P-ZnPP))等。

“聚合物结合抗癌药”是指水溶性聚合物直接或经由腙等，通过化学键连接在低分子量抗癌药(分子量在1000道尔顿以下)上的高分子药物。

对于对构成聚合物结合抗癌药的低分子量抗癌药的种类，没有特别限制，可列举代谢拮抗剂、铂制剂、烷化药、微管作用药、抗癌性抗生素、拓扑异构酶抑制剂等。作为代谢拮抗剂，具体可列举5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、去氧氟尿苷、喃氟啶、阿糖孢苷、吉西他滨等。作为铂制剂，具体可列举顺铂、奥沙利铂、卡铂、奈达铂等。作为烷化药，具体可列举环磷酰胺、异环磷酰胺、噻替派、卡波醌、盐酸尼莫司汀等。作为微管作用药，具体可列举多西他赛、紫杉醇、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨等。作为抗癌性抗生素，具体可列举盐酸阿霉素、丝裂霉素、盐酸氨柔比星、盐酸吡柔比星、盐酸表柔比星、盐酸阿柔比星、盐酸米托蒽醌、盐酸博来霉素、硫酸培洛霉素等。作为拓扑异构酶抑制剂，具体可列举伊立替康、盐酸伊立替康、盐酸拓扑替康等。

对构成聚合物结合抗癌药的水溶性聚合物的种类没有特别限制，可列举聚羟丙基甲基丙烯酰胺(聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(Poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide)：PHPMA)、苯乙烯-马来酸共聚物等。

作为聚合物结合抗癌药的平均分子量，例如可列举1000～数十万程度，优选为数千～300,000程度，更优选为5,000～250,000程度，进一步优选为10,000～200,000程度。本说明书中，聚合物结合抗癌药的平均分子量是使用聚乙烯作为标准物，通过GPC法测定的重均分子量。

作为聚合物结合抗癌药可以使用已知的聚合物结合抗癌药。作为聚合物结合抗癌药，具体可列举连接有PHPMA的吡柔比星(P-THP)和连接有PHPMA的锌原卟啉(P-ZnPP)等。

此外，关于具有抗肿瘤效果的核酸，只要是可作为具有抗肿瘤效果的核酸药物使用的核酸即可，例如可列举siRNA、shRNA、dsRNA、microRNA、反义核酸(反义DNA、反义RNA)、稳定化人工核酸BNA、核糖酶、decoy核酸、适配体等。关于具有抗肿瘤效果的核酸，可以使用已知的核酸。在这些核酸为了发挥抗肿瘤效果而需要脂质体等DDS的情况下，封入DDS的核酸可以被看做高分子型抗癌药。

此外，关于具有抗肿瘤效果的抗体，只要是具有抗肿瘤效果的抗体即可，例如可列举抗EGFR抗体、抗CD40抗体、抗CD33抗体、抗HER2抗体、抗VEGF抗体、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CD20抗体等。

作为光动力学疗法靶标的敏感性物质，可列举聚合物型锌原卟啉(P-ZnPP)和白蛋白结合型吲哚菁绿(ICG)等。ICG虽为低分子物质，但与血清中的白蛋白结合而变为高分子。

这些高分子型抗癌药在单独使用一种的情况下和在组合两种以上使用的情况下，都可作为本发明的增强剂增强抗肿瘤效果的对象。这些高分子型抗癌药中，优选聚合物结合抗癌药及核酸医药制剂。

此外，作为本发明的增强剂的治疗对象的癌症种类，只要是作为化学疗法的对象的癌症就没有特别限制，具体可列举大肠癌、结肠癌、胃癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、***癌、***、头颈癌、胆管癌、胆囊癌、口腔癌等固态癌；白血病、恶性淋巴癌等血液癌。其中，固态癌优选作为本发明的增强剂的治疗对象。

对本发明的增强剂的给予方法没有特别限制，可为全身给予，也可为局部给予。本发明的增强剂即使通过全身给予进行给予，也具有特异性地将高分子型抗癌药蓄积于肿瘤组织这个卓越效果，因此优选的给予方法可列举全身给予。全身给予，具体可列举血管内(动脉内或静脉内)给予、皮下给予、腹膜内给予等，优选为血管内给予，更优选为动静脉内给予。另外，血管内给予不仅包括血管内注射，还包括连续点滴。另外，本发明的增强剂的给予方法可与作为抗肿瘤效果增强对象的高分子型抗癌药的给予方法相同，也可不同。

关于本发明的增强剂的给予量可根据作为抗肿瘤效果增强对象的高分子型抗癌药的种类、患者的性别、年龄、症状等适当确定，不能一概而论，但例如以碳酸磷灰石量换算计，为每次10mg～1g/kg(体重)程度即可。此外，每给予1次高分子型抗癌药，本发明的增强剂的给予次数可为1次，并且，每给予1次高分子型抗癌药，本发明的增强剂的给予也可进行2～3次左右。

此外，对本发明的增强剂的给予时机没有特别限制，例如在给予作为抗肿瘤效果增强对象的高分子型抗癌药的同时或者其前后24小时内即可，优选为在给予高分子型抗癌药的同时或其前后12小时内，更优选为在给予高分子型抗癌药的同时或其前后8小时内。本发明的增强剂的优选使用方式，可列举不与高分子型抗癌药混合进行给予的方式。

2.癌症治疗药

本发明的癌症治疗药是含有第一药物制剂和第二药物制剂的双药物制剂型癌症治疗药，其中，所述第一药物制剂含有上述增强剂，所述第二药物制剂含有高分子型抗癌药。本发明中，双药物制剂型癌症治疗药，是指分别作为不同的制剂含有所述第一药物制剂和所述第二药物制剂的由两个制剂构成的癌症治疗药。

关于本发明的癌症治疗药的第一药物制剂的构成和使用方式等，如上述[1.增强剂]的栏中所示。此外，关于本发明的癌症治疗药的第二药物制剂中所含的高分子型抗癌药的种类等，如上述[1.增强剂」的栏中所示，关于其给予方法、给予量等，可根据高分子型抗癌药的种类适当设定即可。

[实施例]

下面列举实施例说明本发明。但本发明并非解释为限定于以下的实施例。

1.实验材料及方法

1-1.细胞培养

在如下所示的实验中，使用HCT116及HT29两种人大肠癌细胞株。HCT116的培养使用DMEM(杜尔贝科改良伊格尔培养基：Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)，HT29的培养使用RPMI1640(洛斯维·帕克纪念研究所培养基：Roswell Park Memorial Institute Medium)(赛默飞世尔科技公司)。两培养基中加入了10％FBS(胎牛血清：Fetal Bovine Serum)(BIO-WEST公司，美国德克萨斯州圣马科斯)，在5％CO₂、37℃的培养器中进行培养。

1-2.碳酸磷灰石粒子的制备

将0.37g的NaHCO₃、90μl的NaH₂PO₄·2H₂O(1M)及180μl的CaCl₂(1M)加到100ml的蒸馏水中，使其完全溶解，用1N的HCl调节至pH7.5，由此制备缓冲液。将得到的缓冲液用直径0.2μm的滤器过滤灭菌，分装，每份25ml。接着，每25ml缓冲液中加入100μl的CaCl₂(1M)，涡旋搅拌3秒钟后，在37℃下孵育30分钟。然后，在4℃下以12,000rpm离心3分钟，弃去上清液，用生理盐水(200～400μl)回收由50ml的缓冲液得到的沉淀物。接着，加入白蛋白使之相对于液量为0.5％，轻轻搅拌，由此制备碳酸磷灰石粒子(下面表示为iNaD(无机纳米粒子药：inorganic nanoparticle drug))的分散液。在进行尾静脉注射前，用超声波机进行10分钟的超声波处理(38kHz、80W)，在10分内进行尾静脉注射。

1-3.荷癌小鼠的制备

在7周龄/雌性的BALB/cAJcl裸鼠(CLEA Japan株式会社，日本大阪)的背部两个位置各皮下注射3×10⁶个HT29或HCT116，制备荷癌小鼠。

1-4.成像系统

在用异氟烷(辉瑞公司，美国纽约)麻醉下，使用IVIS光谱CT仪(珀金埃尔默公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)进行图像拍摄。拍摄是在荧光模式下以激发波长P-THP 500nm进行的。相对荧光单位(Relative fluorescent unit)是通过设定ROI(感兴趣区：Region ofInterest)并从得到的ROI值减去背景的ROI值计算得到的。

1-5.联合使用iNaD所产生的高分子型抗癌药的聚积性的研究

本实验中，P-THP用作高分子型抗癌药。P-THP是水溶性聚合物聚羟丙基甲基丙烯酰胺(聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(Poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide)：PHPMA)经由腙通过共价键连接在低分子量抗癌药吡柔比星(pirarubicin：THP)上的高分子型抗癌药(平均分子量39,000)。

将HT29荷癌小鼠分为如下三组：无治疗组(n＝1)、尾静脉注射(intravenousinjection：i.v.)P-THP的P-THP(i.v.)组(n＝3)、尾静脉注射iNaD后经1小时后再尾静脉注射P-THP的iNaD(i.v.)+P-THP(i.v.)组(n＝3)。尾静脉注射20mg/kg的P-THP。以碳酸磷灰石量计，尾静脉注射120mg/kg的iNaD。从给予P-THP开始经1和27小时后，使小鼠安乐死，摘取肿瘤和正常组织(心脏、肺、肝脏、脾脏、胰脏、肾脏)，通过IVIS测定P-THP聚积量。

1-6.联合使用iNaD所产生的高分子型抗癌药(P-THP)的抗肿瘤效果的研究

当HT29荷癌小鼠的HT29肿瘤体积达到约80mm³时，分为如下三组：无治疗组(n＝7)、P-THP(i.v.)组(n＝5)和iNaD(i.v.)+P-THP(i.v.)组(n＝3)。P-THP(i.v.)组和iNaD(i.v.)+P-THP(i.v.)组，在第0天尾静脉注射10mg/kg的P-THP，在第5及13天尾静脉注射20mg/kg的P-THP。此外，iNaD(i.v.)+P-THP(i.v.)组，在第0、5、13天以碳酸磷灰石量计以120mg/kg的用量尾静脉注射iNaD。在第0、5、13、16和21天测定肿瘤径。肿瘤体积根据算式[肿瘤体积(mm³)＝a×b²/2(a：长径mm，b：短径mm)]计算。

1-7.联合使用iNaD所产生的低分子型抗癌药的聚积性的研究

本实验中，奥沙利铂(Oxaliplatin：L-OHP，分子量397)(Yakult株式会社，日本东京)用作低分子型抗癌药。将HCT116荷癌小鼠分为如下两组：尾静脉注射L-OHP的L-OHP(i.v.)组和尾静脉注射iNaD后过1小时后再尾静脉注射L-OHP的iNaD(i.v.)+L-OHP(i.v.)组。L-OHP尾静脉注射0.15mg/kg。以碳酸磷灰石量计，iNaD尾静脉注射120mg/kg。从给予L-OHP开始经1和4小时后，使小鼠安乐死，摘取肿瘤(n＝4～6)和肝脏(n＝3)，通过电感耦合等离子体质谱分析(ICP-MS)测定铂量。ICP-MS的测定方法如下。

将肿瘤块和肝脏移入半密闭式玻璃容器中，混悬于2ml的HNO₃(关东化学株式会社，日本东京)中。各样品在加热板上共计加热(70～100℃)12小时以上。用HNO₃稀释酸分解物，使其总量为10ml，通过离心进行精制。上清液用2％(v/v)的HNO₃稀释100倍，用作ICP-MS测定的样品。铂量使用ICP-MS(7500CX)(安捷伦科技公司，日本东京)进行测定。测定数据的处理使用分析软件7500series ICP-MS MassHunter Workstation(G7200A)(安捷伦科技公司)进行。测定条件的设定根据作为测定对象物的铂(原子量195)(和光纯药株式会社)和作为内标使用的铊(原子量205)(和光纯药株式会社)进行了优化。结果以1g的肿瘤块(n＝4～6)或肝脏(n＝3)的铂量(μg/g)表示。计算使用了减掉空白对照值后的测定值。

1-8.联合使用iNaD所产生的低分子型抗癌药(L-OHP)的抗肿瘤效果的研究

当HCT116荷癌小鼠的HCT116肿瘤体积达到约80mm³时，分为如下三组：无治疗组(n＝6)、L-OHP(i.v.)组(n＝6)和iNaD(i.v.)+L-OHP(i.v.)组(n＝6)。L-OHP(i.v.)组和iNaD(i.v.)+L-OHP(i.v.)组，在第0、4、8、12、15、19和22天尾静脉注射0.15mg/kg的L-OHP，并于当日测定肿瘤径。此外，iNaD(i.v.)+L-OHP(i.v.)组，在第0、4、8、12、15、19和22天，以碳酸磷灰石量计以120mg/kg的用量尾静脉注射iNaD。

1-9.肿瘤内的血管造影

将HCT116荷癌小鼠分别分为无治疗组(n＝3)和iNaD(i.v.)组(n＝3)，向iNaD(i.v.)组以碳酸磷灰石量计以120mg/kg的用量尾静脉注射iNaD。4小时后，向两组尾静脉注射作为成像试剂的OTN陶瓷探针Y(OTN Ceramic probe Y)(片山化学工业株式会社，日本大阪)，使用体内荧光成像系统(SAI-1000，岛津公司，日本京都)进行肿瘤内的血管造影。此外，使用血管造影图像中的荧光強度进行比较。

1-10.微阵列分析和Ingenuity Pathway Analysis(IPA)

将HT29荷癌小鼠分别分为无治疗组(n＝3)和iNaD(i.v.)组(n＝3)，向iNaD(i.v.)组以碳酸磷灰石量计以120mg/kg的用量尾静脉注射iNaD，4小时后使之安乐死。从两组切除肿瘤，浸于RNAlater(赛默飞世尔科技公司)中，在-80℃下保存。然后，进行微阵列分析和IPA。将Z分数在2以上或2以下的基因判定为有显著性差异的基因。

1-11.统计分析

统计学数值以平均±标准偏差表示。统计学评价使用Student-T检验，如果P<0.05，则判定为有显著性。

2.实验结果

2-1.联合使用iNaD所产生的P-THP的抗肿瘤效果的研究

研究了动物实验中联合使用iNaD所产生的抗肿瘤效果的增强。本实验中，使用高分子型抗癌药(P-THP)，进行了使用IVIS的P-THP聚积量的测定和抗肿瘤效果的研究。

P-THP聚积量的测定中，通过IVIS测定了从给予P-THP开始经1和27小时后的肿瘤和正常组织的P-THP聚积量(图1)。结果发现，与P-THP(i.v.)组和无治疗组相比，iNaD(i.v.)+P-THP(i.v.)组从给予开始经1和27小时后P-THP向肿瘤的聚积都有显著性的提高(图2)。此外，关于正常组织(心脏、肺、肝脏、脾脏、胰脏、肾脏)，iNaD(i.v.)+P-THP(i.v.)组与P-THP(i.v.)组之间没有发现显著性差异(图3)。图2和图3中，成像图中的数字为相对于荧光强度。

此外，关于抗肿瘤效果，与P-THP(i.v.)组相比，iNaD(i.v.)+P-THP(i.v.)组在从给予开始第13、16和21天肿瘤体积有显著性的变小，可见通过iNaD，P-THP的抗肿瘤效果得到增强(图4)。

2-2.联合使用iNaD所产生的奥沙利铂的抗肿瘤效果的研究

本实验中，使用奥沙利铂(L-OHP)作为低分子型抗癌药，进行了使用质谱分析法的L-OHP聚积量的测定和抗肿瘤效果的研究。

L-OHP聚积量的测定中，测定了从给予L-OHP开始1和4小时后向肿瘤和肝脏的聚积(图5)。与L-OHP(i.v.)组相比，iNaD(i.v.)+L-OHP(i.v.)组从给予开始1和4小时后L-OHP向肿瘤的聚积都有显著性的提高(p<0.05，图6)。另一方面，L-OHP向肝脏的聚积在两组之间没有发现有显著性的差异(图6)。

此外，关于抗肿瘤效果，虽然iNaD(i.v.)+L-OHP(i.v.)组与L-OHP(i.v.)组相比抗肿瘤效果得到了增强，但两组之间没有发现如使用P-THP情况下那样特别显著的差异(图7)。

2-3.肿瘤内的血管造影

本实验中，为了阐明iNaD所产生的高分子型抗癌药抗肿瘤效果增强的机理，进行了血管造影，对iNaD所产生的肿瘤内的血管通透性的变化进行了研究。

通过比较无治疗组和iNaD(i.v.)组，发现无治疗组没有清晰地确认到HCT116荷癌小鼠的肿瘤内的血管走行。另一方面，与无治疗组相比，iNaD(i.v.)组确认到了更清晰的血管走行(图8)。进一步对荧光強度进行测定，发现与无治疗组相比，确认到iNaD(i.v.)组具有显著性提高的荧光強度(图8)。

2-4.微阵列分析及Ingenuity Pathway Analysis(IPA)

从血管造影的结果可知，给予iNaD提高了肿瘤内的血管通透性，因此对iNaD对血管通透性因子的表达量所产生的影响进行了研究。

具体而言，对尾静脉注射iNaD后经4小时后的HT29肿瘤(iNaD(i.v.)组)和无治疗的HT29肿瘤(无治疗组)这两组进行微阵列分析和IPA分析(图9左上)。

微阵列分析的结果确认到在无治疗组中低表达的基因在iNaD(i.v.)组中变为高表达，相反，在无治疗组中高表达的基因在iNaD(i.v.)组中变为低表达，表明了通过给予iNaD而使表达发生大幅改变的基因组的存在(图9左下)。

此外，由IPA的结果可知，表达发生改变的基因的上游存在作为血管通透性因子的IFN-γ、H₂O₂和TNF这三个因子，通过iNaD这些因子的表达有所提高(图9右)。

这些结果强有力地表明，通过iNaD，以IFN-γ、H₂O₂和TNF这三个因子为中心的通路发生亢进，由此引起高分子型抗癌药的抗肿瘤效果的增强。