纳米羟基磷灰石在制备预防或治疗基底细胞癌的药物中的用途
阅读说明：本技术 纳米羟基磷灰石在制备预防或治疗基底细胞癌的药物中的用途 (Application of nano-hydroxyapatite in preparation of drugs for preventing or treating basal cell carcinoma ) 是由 解瑶 唐教清 王琳 于 2020-07-01 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种纳米羟基磷灰石在制备预防或治疗基底细胞癌的药物中的用途。为了开发一种适用于预防或治疗基底细胞癌的药物,本发明提供了一种纳米羟基磷灰石在制备预防或治疗基底细胞癌的药物中的用途。本发明并具体给出了该纳米羟基磷灰石的粒径、形状等特征,通过构建小鼠基底细胞癌模型,摸索得出纳米羟基磷灰石在抑制基底细胞癌细胞中的使用剂量。本发明提供了一种纳米羟基磷灰石在制备预防或治疗基底细胞癌的药物中的用途,拓宽了纳米羟基磷灰石的应用领域,也为预防或治疗基底细胞癌的药物开发提供了基础和方向,具有重要的意义。(The invention belongs to the technical field of biological medicines, and particularly relates to application of nano-hydroxyapatite in preparation of a medicine for preventing or treating basal cell carcinoma. In order to develop a medicament suitable for preventing or treating basal cell carcinoma, the invention provides application of nano-hydroxyapatite in preparing a medicament for preventing or treating basal cell carcinoma. The invention also provides the characteristics of the nano hydroxyapatite such as particle size, shape and the like, and the dosage of the nano hydroxyapatite in the basal cell carcinoma inhibiting cell is obtained by constructing a mouse basal cell carcinoma model and searching. The invention provides the application of nano hydroxyapatite in preparing the drugs for preventing or treating basal cell carcinoma, widens the application field of nano hydroxyapatite, provides a basis and a direction for the development of the drugs for preventing or treating basal cell carcinoma, and has important significance.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种纳米羟基磷灰石在制备预防或治疗基底细胞癌的药物中的用途。
背景技术
基底细胞癌属于非黑素瘤性皮肤癌，发病率高，疾病负担重。基底细胞癌常浸润、侵袭和破坏皮肤及周围结构，包括骨组织，严重影响患者的美观。目前，临床上治疗基底细胞癌仍以手术切除为主，但手术切除后仍有可能存在局部复发，影响预后。因此，探索适用于预防或治疗基底细胞癌的药物极为重要。
羟基磷灰石是一种钙磷酸盐化合物，是人体骨骼及牙齿的主要无机矿物成分，具有良好的生物相容性，广泛应用于生物医药材料领域。而纳米羟基磷灰石是一种新型生物材料，有独特生物学活性，摆脱了传统羟基磷灰石难塑性和脆性大等特点。研究报道纳米羟基磷灰石可表现出特殊的生物活性，对骨肉瘤、胃癌、肝癌等具有抗肿瘤作用。但因纳米羟基磷灰石的生物安全性仍存在争议，上述研究大多局限于体外研究。因此，纳米羟基磷灰石的抗肿瘤作用还有待进一步确认。
目前，有关纳米羟基磷灰石***的体内研究较少，并且缺乏基底细胞癌的动物模型。对于纳米羟基磷灰石能够用于制备预防或治疗基底细胞癌的药物还未见报道，有待研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题为：开发一种适用于预防或治疗基底细胞癌的药物。
本发明提供了一种纳米羟基磷灰石在制备预防或治疗基底细胞癌的药物中的用途。
其中，上述用途中，所述的纳米羟基磷灰石粒径为20～80nm。
其中，上述用途中，所述的纳米羟基磷灰石粒径中30～60nm的占比≥80％。
优选的，上述用途中，所述的纳米羟基磷灰石平均粒径45.13nm。
其中，上述用途中，所述纳米羟基磷灰石形状为：颗粒状、针状或柱状。
优选的，上述用途中，所述纳米羟基磷灰石形状为针状。
其中，上述用途中，所述纳米羟基磷灰石的体外使用剂量为60～480ug/ml。
优选的，上述用途中，所述纳米羟基磷灰石的体外使用剂量为120ug/ml。
其中，上述用途中，所述纳米羟基磷灰石的体内使用剂量为≥25mg/kg。
其中，上述用途中，所述纳米羟基磷灰石由可溶性钙盐与可溶性磷酸盐经化学沉淀法制备而成。
进一步的，上述用途中，所述纳米羟基磷灰石由Ca(NO3)2·4H2O与(NH4)2HPO4制备而成。
特别的，上述用途中，所述纳米羟基磷灰石的制备方法包括以下步骤：
a、配制0.5ml/l Ca(NO3)2·4H2O 160ml和0.5mol/l的(NH4)2HPO4 96ml，磁力搅拌以1000r/min的速率不断搅拌Ca(NO3)2·4H2O溶液，在室温下将(NH4)2HPO4溶液以4ml/min的速率缓慢匀速滴加入Ca(NO3)2·4H2O溶液中，反应过程中随时用氨水NH3·H2O调节反应体系pH值为10；
b、待(NH4)2HPO4溶液滴加完毕后，常温下静置陈化24h，超纯水反复离心洗涤沉淀6次，直至浆料pH值被洗至中性后，60℃恒温干燥箱干燥10h，制备得到颗粒状纳米羟基磷灰石；
或a、配制0.5ml/l Ca(NO3)2·4H2O 160ml和0.5mol/l的(NH4)2HPO4 96ml，磁力搅拌以1000r/min的速率不断搅拌Ca(NO3)2·4H2O溶液，在室温下将(NH4)2HPO4溶液以4ml/min的速率缓慢匀速滴加入Ca(NO3)2·4H2O溶液中，反应过程中随时用氨水NH3·H2O调节反应体系pH值为10；
b、待(NH4)2HPO4溶液滴加完毕后，常温下搅拌陈化2h，然后将所得的乳白色浆料转移到水热反应壶中，150℃水热反应12h，自然冷却后弃上清液，用超纯水反复离心洗涤沉淀6次，直至浆料pH值被洗涤至中性后，60℃恒温干燥箱干燥10h，制备得到针状纳米羟基磷灰石；
或a、配制0.5ml/l Ca(NO3)2·4H2O 160ml和0.5mol/l的(NH4)2HPO4 96ml，磁力搅拌以1000r/min的速率不断搅拌Ca(NO3)2·4H2O溶液，在室温下将(NH4)2HPO4溶液以4ml/min的速率缓慢匀速滴加入Ca(NO3)2·4H2O溶液中，反应过程中随时用氨水NH3·H2O调节反应体系pH值为10；
b、待(NH4)2HPO4溶液滴加完毕后，常温下搅拌陈化24h，超纯水反复离心洗涤沉淀6次，直至浆料pH值被洗涤至中性后，150℃水热反应12h，然后60℃恒温干燥箱干燥10h，制备得到柱状纳米羟基磷灰石。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种纳米羟基磷灰石在基底细胞癌中的新用途，本发明首次发现特定形态的纳米羟基磷灰石能够抑制基底细胞癌，通过正常人成纤维细胞及人角质形成细胞细胞株验证了此效果。本发明还首次建立了基底细胞癌动物模型，首次体内研究了纳米羟基磷灰石对小鼠模型重要脏器的影响，确定了纳米羟基磷灰石在基底细胞癌应用领域的安全性。本发明提供了一种纳米羟基磷灰石在制备预防或治疗基底细胞癌的药物中的用途，拓宽了纳米羟基磷灰石的应用领域，也为预防或治疗基底细胞癌的药物开发提供了基础和方向，具有重要的意义。
附图说明
图1所示为不同方法制备得到的不同形态的纳米羟基磷灰石。A为颗粒状，B为针状，C为柱状。
图2所示为倒置显微镜下观察细胞生长形态(×200)。倒置相差显微镜下观察TE354.T、HaCat及HSF细胞形态，TE 354.T、HSF细胞均呈单层贴壁生长，TE 354.T细胞正常情况下呈多角形、成团生长，HaCat细胞正常情况下呈上皮样生长，HSF细胞正常情况下呈梭形生长，均可见向外伸出的2～4个长短不一突起。(a)TE 354.T细胞；(b)HaCat细胞；(c)HSF细胞。
图3所示为不同浓度的nHAP对基底细胞癌细胞株TE 354.T肿瘤细胞增殖能力的影响。与对照组相比，实验组中较高浓度nHAP材料(60、120、240和480μg/mL)作用TE 354.T细胞48h后均对其具有抑制增殖作用，差异均有统计学意义(P<0.05)。且随着材料浓度增加，对TE 354.T细胞增殖抑制有逐渐增强趋势。以上结果说明较高浓度nHAP有抑制TE 354.T细胞增殖的作用。较低浓度(30μg/mL)与对照组相比无显著性差异(P>0.05)，对细胞增殖无明显影响。
图4所示为不同浓度的nHAP对正常人角质形成细胞增殖能力的影响。与对照组相比，各浓度nHAP材料(30、60、120、240和480μg/mL)的实验组作用HaCat细胞48h后均不明显抑制或者促进细胞增殖，差异均无统计学意义(P>0.05)。说明各浓度nHAP材料对HaCat细胞的增殖无明显影响。
图5所示为不同浓度的nHAP对正常人成纤维细胞增殖能力的影响。与对照组相比，大部分实验组中nHAP材料(30、60、240和480μg/mL)作用HSF细胞48h后均对其具有促进增殖作用，差异均有统计学意义(P<0.05)。实验组中个别浓度(120μg/mL)与对照组相比无显著性差异(P>0.05)，该浓度无明显促进或者抑制HSF细胞增殖。
图6所示为nHAP对TE 354.T细胞凋亡(总凋亡)的影响。与对照组相比，各浓度nHAP实验组中nHAP材料作用TE 354.T细胞48h后，处于总凋亡(早期+晚期凋亡)的细胞比例均显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。说明较高浓度nHAP(60、120、240和480μg/mL)可促进基底细胞癌细胞株TE 354.T肿瘤细胞凋亡，(**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001)。
图7所示为nHAP对TE 354.T细胞周期(G2期)的影响。与对照组相比，较高浓度nHAP(60、120、240和480μg/mL)实验组中nHAP材料作用TE 354.T细胞48h后，处于细胞周期G2期的细胞比例显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。说明较高浓度nHAP可能通过影响TE354.T肿瘤细胞的细胞周期进而抑制细胞增殖。(*P<0.05，**P<0.01)。
图8所示为对照组裸鼠肿瘤生长前后对比。可见未予nHAP治疗的基底细胞癌负瘤小鼠在观察期结束时肿瘤明显增大。
图9所示为实验组裸鼠肿瘤生长前后对比。予25mg/kg nHAP治疗的基底细胞癌负瘤小鼠在观察期结束后，肿瘤生长明显受到抑制。
图10所示为对照组与实验组裸鼠处死后肿瘤组织的对比。可见实验组肿瘤体积明显小于对照组，体内实验进一步证实nHAP对基底细胞癌具有显著的抑制作用。
具体实施方式
本发明提供了一种纳米羟基磷灰石在制备预防或治疗基底细胞癌的药物中的用途。
特别的，本发明还确定了纳米羟基磷灰石为粒径为20～80nm的纳米羟基磷灰石。发明人经过大量试验发现，纳米羟基磷灰石粒径太小时，在血液循环和肿瘤组织中会很快被清除或到周围组织，效果及安全性差；粒径太大时，在肿瘤组织中的渗透性不佳，影响肿瘤抑制效果。本发明采用20～80nm的纳米羟基磷灰石，保障了材料在肿瘤中的穿透深度的同时有利于肿瘤细胞对该材料的内吞，同时该大小的纳米粒子可通过EPR效应具有肿瘤组织靶向作用，避免了纳米羟基磷灰石在非肿瘤组织中的沉积，保障了生物安全性。
为了得到合适的纳米羟基磷灰石，发明人采用Ca(NO3)2·4H2O与(NH4)2HPO4制备纳米羟基磷灰石，制备方法如下：
特别的，上述用途中，所述纳米羟基磷灰石的制备方法包括以下步骤：
a、配制0.5ml/l Ca(NO3)2·4H2O 160ml和0.5mol/l的(NH4)2HPO4 96ml，磁力搅拌以1000r/min的速率不断搅拌Ca(NO3)2·4H2O溶液，在室温下将(NH4)2HPO4溶液以4ml/min的速率缓慢匀速滴加入Ca(NO3)2·4H2O溶液中，反应过程中随时用氨水NH3·H2O调节反应体系pH值为10；
b、待(NH4)2HPO4溶液滴加完毕后，常温下静置陈化24h，超纯水反复离心洗涤沉淀6次，直至浆料pH值被洗至中性后，60℃恒温干燥箱干燥10h，制备得到颗粒状纳米羟基磷灰石；
或a、配制0.5ml/l Ca(NO3)2·4H2O 160ml和0.5mol/l的(NH4)2HPO4 96ml，磁力搅拌以1000r/min的速率不断搅拌Ca(NO3)2·4H2O溶液，在室温下将(NH4)2HPO4溶液以4ml/min的速率缓慢匀速滴加入Ca(NO3)2·4H2O溶液中，反应过程中随时用氨水NH3·H2O调节反应体系pH值为10；
b、待(NH4)2HPO4溶液滴加完毕后，常温下搅拌陈化2h，然后将所得的乳白色浆料转移到水热反应壶中，150℃水热反应12h，自然冷却后弃上清液，用超纯水反复离心洗涤沉淀6次，直至浆料pH值被洗涤至中性后，60℃恒温干燥箱干燥10h，制备得到针状纳米羟基磷灰石；
或a、配制0.5ml/l Ca(NO3)2·4H2O 160ml和0.5mol/l的(NH4)2HPO4 96ml，磁力搅拌以1000r/min的速率不断搅拌Ca(NO3)2·4H2O溶液，在室温下将(NH4)2HPO4溶液以4ml/min的速率缓慢匀速滴加入Ca(NO3)2·4H2O溶液中，反应过程中随时用氨水NH3·H2O调节反应体系pH值为10；
b、待(NH4)2HPO4溶液滴加完毕后，常温下搅拌陈化24h，超纯水反复离心洗涤沉淀6次，直至浆料pH值被洗涤至中性后，150℃水热反应12h，然后60℃恒温干燥箱干燥10h，制备得到柱状纳米羟基磷灰石。
本发明体内外实验所采用的基底细胞癌细胞系为成熟稳定的基底细胞癌细胞株TE354.T。
本发明采用细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡等实验来评价纳米羟基磷灰石对基底细胞癌细胞株表型的影响，评估指标较全面。
本发明成功建立了基底细胞癌动物模型，且进一步通过动物实验验证了纳米羟基磷灰石在基底细胞癌研究领域应用的可行性。本发明在体实验中设立了不同的纳米羟基磷灰石浓度(30、60、120、240和480μg/mL)，摸索得到了纳米羟基磷灰石在基底细胞癌应用领域中的最佳应用浓度为120μg/mL时，抑制基底细胞癌肿瘤细胞增殖及促进该肿瘤细胞凋亡的作用最强，且对基底细胞癌肿瘤细胞周期的影响最显著；体内应用剂量为25mg/kg体重时即表现出显著的抗肿瘤作用。
本发明还同时解决了纳米羟基磷灰石在基底细胞癌中应用的安全性问题，通过体外实验人正常成纤维细胞及人角质形成细胞中的应用，发现该纳米材料对人角质形成细胞无明显影响的同时可促进人正常成纤维细胞增生。说明本发明的纳米材料具有生物安全性，对组织也有潜在的可修复作用。并进一步通过体内动物实验验证在治疗结束后小鼠重要脏器中未发生该纳米材料的沉积，且各重要脏器未发生明显损伤，进一步验证了本发明所述纳米羟基磷灰石的的靶向性及安全性。
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
实施例中所用的纳米羟基磷灰石来自四川大学生物材料工程研究中心。此纳米羟基磷灰石采用化学沉淀法，以可溶性钙盐Ca(NO3)2·4H2O和可溶性磷酸盐(NH4)2HPO4作为主要原料进行制备、分析和表征，简要信息如下所述。
本发明所用的纳米羟基磷灰石粒径分布均近似正态分布，材料平均粒径为45.13nm，呈针状，粒径范围20～80nm。
实施例中所采用的人皮肤成纤维细胞(human fibroblasts，HSF)及人永生化角质形成细胞(HaCat)均购买自国家实验细胞资源共享服务平台，人基底细胞癌细胞(TE354.T)购买自上海信裕生物科技有限公司，由四川大学华西医院公共实验技术中心的实验室冻存。
实施例中所用的健康BALB/c雌性裸鼠，体重14～16g，4～5周龄，购于成都达硕动物有限公司，为实验专用裸鼠。实验动物全部饲养在四川大学华西医院华西科技园动物中心无特殊病原体(SPF)级动物房空气层流架内。Balb/c裸鼠分装于带空气过滤装置的饲养笼中饲养。笼具、垫料和饮用水均经消毒处理，饲料经高压灭菌。室内温度控制在26～28℃，相对湿度保持在40～60％。按需更换笼具及垫料，按需添加饲料及食用水。实验人员进行无菌操作。动物实验获得四川大学华西医院实验动物伦理委员会批准(伦理备案号：2017088A)。
实施例中所用的其他仪器和试剂均为普通市售产品。
实施例1采用不同方法制备纳米羟基磷灰石
具体操作步骤如下：
a、配制0.5ml/l Ca(NO3)2·4H2O 160ml和0.5mol/l的(NH4)2HPO4 96ml，磁力搅拌以1000r/min的速率不断搅拌Ca(NO3)2·4H2O溶液，在室温下将(NH4)2HPO4溶液以4ml/min的速率缓慢匀速滴加入Ca(NO3)2·4H2O溶液中，反应过程中随时用氨水NH3·H2O调节反应体系pH值为10；
b、待(NH4)2HPO4溶液滴加完毕后，常温下静置陈化24h，超纯水反复离心洗涤沉淀6次，直至浆料pH值被洗至中性后，60℃恒温干燥箱干燥10h，标记为材料A，部分研磨备用。电镜下观察nHAP呈颗粒状。
c、待(NH4)2HPO4溶液滴加完毕后，常温下搅拌陈化2h，然后将所得的乳白色浆料转移到水热反应壶中，150℃水热反应12h，自然冷却后弃上清液，用超纯水反复离心洗涤沉淀6次，直至浆料pH值被洗涤至中性后，60℃恒温干燥箱干燥10h，标记为材料B，部分研磨备用。电镜下观察nHAP呈针状。
d、待(NH4)2HPO4溶液滴加完毕后，常温下搅拌陈化24h，超纯水反复离心洗涤沉淀6次，直至浆料pH值被洗涤至中性后，150℃水热反应12h，然后60℃恒温干燥箱干燥10h，标记为材料C，部分研磨备用。电镜下观察nHAP呈柱状如图1所示)。
实施例2细胞增殖实验
具体的操作步骤如下：
(1)细胞复苏及培养
将保存于-150℃冰箱中装有TE 354.T细胞的冻存管取出，及时置于37℃的水浴锅中并迅速摇动，使其快速完全解冻。预热20mL的DMEM完全培养基(含10％胎牛血清)(购自美国Gibco公司)。
75％酒精擦拭冻存管表面，放入紫外线已灭菌的超净工作台。
将TE 354.T细胞悬液移入含4mL DMEM完全培养基的15mL离心管。离心机800rpm离心3分钟。于超净工作台弃去离心管中的上清液，加入4mL DMEM完全培养基，与离心管底部细胞沉淀物混匀，制成细胞悬液。
在超净台中取规格为25cm2的培养瓶(T25培养瓶)，移入上述细胞悬液并晃动瓶身使细胞悬液均匀分布于培养瓶。置于37℃、5％CO2浓度及95％饱和湿度条件下的恒温孵育箱中传代培养。根据细胞的状态和数量，每隔24h～48h更换1次DMEM完全培养基(5mL)。
HaCat及HSF细胞培养方法与TE 354.T相同，倒置相差显微镜下观察TE 354.T、HaCat及HSF细胞形态，TE 354.T、HSF细胞均呈单层贴壁生长，TE 354.T细胞正常情况下呈多角形、成团生长，HaCat细胞正常情况下呈上皮样生长，HSF细胞正常情况下呈梭形生长，均可见向外伸出的2～4个长短不一突起(如图2所示)。
(2)细胞增殖检测
CCK-8检测，利用水溶性四唑盐-
A、准备细胞：37℃、5％CO2浓度及95％饱和湿度条件下的恒温孵育箱中培养TE354.T细胞和正常对照细胞(HSF、HaCat)，使其处于对数生长期。
B、细胞铺板
于超净工作台吸去培养液，用无菌PBS洗涤细胞2次，加入1mL 0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞，DMEM完全培养基终止消化。离心机800rpm离心3分钟。加入3mL DMEM完全培养基制成细胞悬液，取10μL细胞悬液计数，根据计数结果使用DMEM完全培养基稀释至104/100μL的细胞浓度。
96孔板加入细胞100μL/孔(约1×104)，置于37℃、5％CO2浓度及95％饱和湿度条件下的恒温孵育箱中培养。
C、实验分组
实验组：以不同浓度梯度的nHAP进行处理(孵育)。nHAP终浓度分别为30、60、120、240和480μg/mL。
阴性对照组：不含nHAP的完全培养基。
空白对照组：不含细胞、不含nHAP的完全培养基。
nHAP处理时间：48h。
复孔：每个分组均设置5个复孔。
D、实验处理
待96孔板内细胞过夜贴壁，次日以完全培养基制备不同终浓度的nHAP溶液，浓度分别为30、60、120、240和480μg/mL。吸去各孔内旧的培养基，按上述分组(实验组、阴性对照组、空白对照组)加入不同培养基。无菌操作于超净工作台进行。
将添加处理后的96孔板置于37℃、5％CO2浓度及95％饱和湿度条件下的恒温孵育箱中培养48h后进行实验检测。
E、实验检测
对各孔内加入10μL CCK-8试剂(购自日本Dojindo公司)。在孵育箱(37℃)中孵育3h。将各孔液体均转移80μL至新的96孔板，消除原有孔中nHAP粉末对后续检测的影响。使用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度(OD值)。细胞增殖抑制率＝[(阴性对照组平均吸光度值－各实验组平均吸光度值)/(阴性对照组平均吸光度值－空白对照组平均吸光度值)]×100％。
实验结果如图3～5所示：
如图3所示，与对照组相比，实验组中较高浓度(60、120、240和480μg/mL)nHAP材料作用TE 354.T细胞48h后均对其具有抑制增殖作用，差异均有统计学意义(P<0.05)。且当nHAP浓度为120ug/ml时此抑制作用最强。以上结果说明较高浓度nHAP有抑制TE 354.T细胞增殖的作用。较低浓度(30μg/mL)与对照组相比无显著性差异(P>0.05)，对细胞增殖无明显影响。
如图4所示，与对照组相比，各浓度nHAP材料的实验组作用HaCat细胞48h后均不明显抑制或者促进细胞增殖，差异均无统计学意义(P>0.05)。
如图5所示，与对照组相比，大部分实验组中(30、60、240和480μg/mL)nHAP材料作用HSF细胞48h后均对其具有促进增殖作用，差异均有统计学意义(P<0.05)。
图4、图5针对的是不同的细胞株，对HaCat细胞无明显影响，说明安全性好，对HSF细胞有促增殖的作用，说明该材料具有潜在的促进组织修复的作用。
实施例3细胞凋亡检测
用Annexin V～FITC/PI(美国sigma公司)双染细胞凋亡检测方法观察nHAP对TE354.T细胞的影响。AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)是一种核酸染料，能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
具体的操作步骤包括：
(1)准备细胞：37℃、5％CO2浓度及95％饱和湿度条件下的恒温孵育箱中培养TE354.T细胞和正常对照细胞(HSF、HaCat)，使其处于对数生长期。
(2)细胞铺板
于超净工作台吸去培养液，用无菌PBS洗涤细胞2次，加入1mL 0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞，DMEM完全培养基终止消化。离心机800rpm离心3分钟。加入3mL DMEM完全培养基制成细胞悬液，取10μL细胞悬液计数，根据计数结果使用DMEM完全培养基稀释至104/100μL的细胞悬液。
6孔板加入细胞300μL/孔(约3×105)上述细胞悬液，每孔以完全培养基补齐1.5mL总体积。置于37℃、5％CO2浓度及95％饱和湿度条件下的恒温孵育箱中培养。
(3)实验分组
实验组：以不同浓度梯度的nHAP进行处理(孵育)。nHAP终浓度分别为60、120、240
和480μg/mL。
阴性对照组：不含nHAP的完全培养基。
nHAP处理时间：48h。
复孔：每个分组均设置3个复孔。
(4)实验处理
待96孔板内细胞过夜贴壁，次日以完全培养基制备不同终浓度的nHAP溶液，浓度分别为60、120、240和480μg/mL。吸去各孔内旧的培养基，按上述分组(实验组和阴性对照组)加入不同培养基。无菌操作于超净工作台进行。
将添加处理后的6孔板置于37置、5％CO2浓度及95％饱和湿度条件下的恒温孵育箱中培养48h后进行实验检测。
(5)实验检测
15mL离心管收集悬浮细胞及胰蛋白酶消化后的贴壁细胞，离心机中以2000rpm离心5分钟，弃去上清后以预冷的PBS重悬细胞沉淀后重复离心2次并再次弃去上清。
标记前准备：10×Binding Buffer用灭菌去离子水稀释至1×Binding Buffer，按400μL/个的1×Binding Buffer的量配制。预冷后重悬细胞。每份标本中加入5μL AnnexinV～FITC染色，并于室温避光孵育15分钟。
流式细胞仪检测前每份标本加入5μL PI染色。
根据流式细胞仪检测结果，统计实验组各标本的早期凋亡率(右下象限)和晚期凋亡率(右上象限)及总凋亡率(早期凋亡率+晚期凋亡率)。
实验结果如图6所示，与对照组相比，实验组中各浓度nHAP材料(60ug/ml，120ug/ml，240ug/ml，480ug/ml)作用TE 354.T细胞48h后，处于总凋亡(早期+晚期凋亡)的细胞比例均显著升高，差异均有统计学意义(P<0.01)。且当nHAP浓度为120ug/ml时此促细胞凋亡作用最强。
上述实验结果说明当纳米羟基磷灰石浓度≥60ug/ml时，可促进基底细胞癌肿瘤细胞凋亡。
实施例4细胞周期检测
具体操作步骤如下：
“准备细胞”、“细胞铺板”、“实验分组”及“实验处理”同实施例2。
实验检测过程如下：
15mL离心管收集胰蛋白酶消化后的贴壁细胞，离心机中以2000rpm离心5分钟，弃去上清后以预冷的PBS重悬细胞沉淀后重复离心2次后再次弃去上清，并以70％预冷的乙醇溶液1mL固定，4℃过夜。
次日，离心收集细胞沉淀，用移液器吸去乙醇溶液，然后用1mL PBS重悬细胞并离心清洗2～3遍。
RNA酶消化和PI染色：在避光条件下，每个样品加入RNase和PI(共500μL)，混匀后室温避光条孵育30min。
检测与分析：用流式细胞仪检测每个样品的细胞周期，采用Modfit软件进行统计分析。
结果如图7所示，与对照组相比，较高浓度nHAP(60ug/ml，120ug/ml，240ug/ml，480ug/ml)实验组中nHAP材料作用TE 354.T细胞48h后，处于细胞周期G2期的细胞比例显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。且当nHAP浓度为120ug/ml时对基底细胞癌肿瘤细胞周期的影响作用最明显。
上述实验结果说明纳米羟基磷灰石可能是通过影响细胞周期来抑制基底细胞癌肿瘤细胞的增殖。
实施例5动物体内实验验证nHAP对基底细胞癌的作用
(1)建立基底细胞癌动物模型并予nHAP治疗
将Balb/c雌性裸鼠随机分为2组，分别是对照组和实验组。对照组裸鼠于左侧腋下皮下注射TE 354.T细胞106+基质胶50ul(购买至美国BD公司)+PBS 50ul的混悬液，总体积200ul。实验组裸鼠于左侧腋下皮下注射TE 354.T细胞106+基质胶50ul+含nHAP粉体(25mg/kg)的PBS 50ul的混悬液，总体积200ul。
记录接种操作及接种后反应，观察是否有悬液漏出。接种后每2～3天观察裸鼠一般情况及肿瘤生长情况，包括肿瘤出现时间、生长速度、肿瘤大小/形状/颜色。用游标卡尺测量肿瘤的最长径a(mm)和最短径b(mm)。持续观察约28天处死裸鼠并取材，进行后续实验。裸鼠肿瘤接种约28天后结束实验，1％戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉小鼠，仰卧位固定于解剖板上，常规消毒，完整取出肿瘤组织。
观察相关指标：
肿瘤体积按照公式(V＝a×b2×0.5)计算肿瘤体积(mm3)。
肿瘤抑制率公式：肿瘤抑制率(％)＝[(V正常对照组－V实验组)/V正常对照组]×100％。
(2)HE染色
裸鼠肿瘤接种约28天后结束实验，1％戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉小鼠，仰卧位固定于解剖板上，常规消毒，完整取出肿瘤、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏组织于10％中性***固定48h，随后行HE染色(在四川大学华西医院公共实验技术中心病理与图像技术平台开展)。
(3)统计学结果分析
实验结果均采用SPSS17.0软件(美国SPSS公司)进行统计学分析，结合GraphpadPrism7制作图表。两组数据之间比较采用GraphPad Prism 7软件进行t检验，所有数据均以平均值±标准差(mean±SD)表示，P值<0.05代表有统计学差异，P值≥0.05则代表无统计学差异。
实验结果：
如图8、9所示，分别为对照组与实验组的肿瘤生长记录，其中对照组共7只，实验组共8只(实验终止时存活6只)。
如图10所示，分别为对照组与实验组裸鼠处死后肿瘤组织的大体对比，其中对照组共7只，实验组共6只。
安全性评价
内脏组织病理学表现
显微镜下观察荷瘤小鼠各组的内脏形态学改变，各组心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏HE染色切片均未见明显异常，也未见nHAP材料，可见nHAP具有生物安全性和肿瘤组织靶向性。
综上可知，本发明通过体内外实验表明nHAP能影响TE 354.T细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡等生物学过程，从而达到抗基底细胞癌的作用；同时可促进正常细胞HSF生长，对HaCat无显著影响，表明nHAP在抗基底细胞癌的同时具有良好的生物安全性，且具有一定的组织修复潜力。据此，本发明提供了一种纳米羟基磷灰石在制备预防或治疗基底细胞癌的药物中的用途。
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