阅读说明：本技术 一种γ-PGA高产菌株诱变选育方法 (Gamma-PGA high-yield strain mutation breeding method ) 是由 石元亮 张雷 王玲俐 于 2020-08-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种γ-PGA高效诱变和快速筛选的方法。首先通过硫酸二乙酯、亚硝基胍、紫外、5-溴尿嘧啶对出发菌株进行了复合诱变,通过透明圈法筛选初筛、24孔板复筛和传代稳定性试验后,获得了一株高产、稳定性强的菌株C2,该菌株聚谷氨酸产量达到21.3 g/L,比诱变前提高43.91%。将硫酸二乙酯、亚硝基胍、紫外、5-溴尿嘧啶等诱变剂结合使用,显著提高了菌株的突变幅度。结合多孔板技术,实现了聚谷氨酸突变株的快速筛选。(The invention discloses a method for efficient mutagenesis and rapid screening of gamma-PGA. Firstly, carrying out compound mutagenesis on an original strain through diethyl sulfate, nitrosoguanidine, ultraviolet and 5-bromouracil, and obtaining a high-yield and strong-stability strain C2 after primary screening, 24-pore plate secondary screening and passage stability test through a transparent circle method, wherein the yield of polyglutamic acid of the strain reaches 21.3 g/L and is improved by 43.91% compared with that before mutagenesis. The mutagens such as diethyl sulfate, nitrosoguanidine, ultraviolet, 5-bromouracil and the like are combined for use, so that the mutation amplitude of the strain is remarkably improved. And the rapid screening of the polyglutamic acid mutant strain is realized by combining a porous plate technology.)

一种γ-PGA高产菌株诱变选育方法

技术领域

本发明属于生物工程的微生物育种领域，涉及使用一种选育聚-γ-谷氨酸（γ-PGA）选育突变株的方法，依据此方法可以快速获得高产γ-PGA的发酵菌株。

背景技术

随着生物基高分子材料的兴起，γ-PGA起了人们的极大兴趣。γ-PAG多由芽孢杆菌产生，是一种阴离子异形肽。它具备良好的水溶性和良好的生物相容性，具有良好的开发和应用前景。根据分子量差异，γ-PGA可分别用于化妆品、食品、卫生、医疗、农业等众多领域。

γ-PGA的获取主要有三个途径：化学合成、酶催化合成、微生物发酵法。其中，化学合成法和酶催化法因产出的γ-PGA分子的重均分子量较小、同时易造成环境污染等原因，难以大规模应用，逐渐被生物发酵法所替代。微生物发酵法生产γ-PGA是工业中最常用的方法。但γ-PGA发酵菌株的产量低，一直困扰着整个γ-PGA产业。

实现菌株高产的最佳途径是进行高产菌株的选育。γ-PGA是一个多代谢模块的合成过程，参与代谢的基因在基因组中分布(图1)。目前，对γ-PGA的诱变通常使用单一诱变剂，多轮诱变之后菌株对诱变剂的敏感性会降低，突变幅度减小，负突变率增高；诱变后的菌株需要筛选获取，目前筛选通量低，影响了γ-PGA高产菌株的获取。

不同诱变剂有着不同的突变热点，紫外线（UV）是目前最常用的物理诱变剂，能引起DNA链中嘧啶之间的共价连接，形成嘧啶二聚体，影响DNA分子结构。硫酸二乙酯（DSE）、亚硝基胍（NTG）、是常见的烷化剂，前者主要通过烷基等亲电基团，移动到电子密度较高的部位（通常对应细胞的转录区），进行亲电加成反应，改变碱基的分子结构，后者主要是造成核酸的异常断裂，引起细胞的SOS修复或同源重组修复，以此来达到基因突变的目的。5-溴尿嘧啶（5-BrU）是常见的化学诱变剂，进入细胞后更容易与鸟嘌呤进行配对，使得初始碱基由原来的A=T转变为G≡C。研究表明：相对于单一诱变，多种诱变剂组合效果较好。通过不同诱变剂之间的组合可以提高诱变效率和突变幅度，提高诱变菌株的产量。

本发明的目的是提供一种简单实用、高突变幅度、高通量的选育方法，以解决目前γ-PGA生产菌株诱变选育方法对菌株产量提升有限的问题。

为了实现上述目标，本发提供了一种高产γ-PGA菌株的诱变方法，技术方案为：对原始菌株使用DSE、NTG、UV、5-BrU四种诱变剂进行复合诱变，结合透明圈法筛选出高产γ-PGA的突变株。具体步骤如下。

(1)菌株的活化：取γ-PGA生产菌株的甘油管菌种，于LB培养基平板中，30-37 ℃下活化18-24h。

(2)菌液的制备：挑取(1)中单菌落，接入LB液体培养基，150-180 r/min，35-37℃下培养18-24h。取培养后的菌液1mL，稀释10⁴-10⁶倍后备用。

(3)菌株诱变。

1) 取一只无菌试管加入(2)中菌液、DSE(0.5%-1.0%)和NTG(0.02-0.06%)，体积比为1:2:2，30-37℃，150-180r/min震荡30min，加入Na₂S₂O₃溶液终止反，3000 r/min 离心15min，弃去上清液，加入等量生理盐水重悬，得诱变菌液A。

2)将取菌液A置于30W紫外灯30 cm处照射20-60s，添加等体积的液体发酵培养基，黑暗处避光孵育6-12h获得菌液B。

3)红光灯下，取菌液B，添加等体积1.5-3.5%的5-溴尿嘧啶，混匀后涂布于脱脂牛奶平板。30-37℃培养12-18h，完成一轮诱变。根据经验，推荐进行5轮以上诱变。

数据统计。

诱变做三次重复，并统计菌落数。以未诱变的菌株作参考，计算致死率。选取致死率在85%-95%的平板进行筛选。

致死率测定。

致死率=(1-M/U)×100%。

M：诱变后平板中菌落数，U对照组平板中菌落数。

(4)菌株筛选：测定菌落直径和透明圈直径后，选取K值较大(前5%-20%)的菌株进行多孔板发酵，并测定γ-PGA含量。

步骤(4)中：K=d/D；d：菌落直径；D：透明圈直径。

(5)菌株稳定性测试：将上述产量高的部分菌株进行传代培养至6代以后，检测γ-PGA含量，选取遗传比较稳定的菌株。

(6)培养基。

LB培养基(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，氯化钠10，pH7.2-7.4，115℃高压灭菌20min。

种子培养基（g/L）：葡萄糖25-35 ，谷氨酸钠8-14, 酵母浸粉8-12，K₂HPO₄•3H₂O 2-4，(NH₄)₂SO₄ 2-4，MgSO₄•7H₂O 0.1-0.2，MnSO₄•H₂O 0.02-0.06，pH 7.0，115℃高压灭菌20min。

发酵培养基（g/L）：葡萄糖 30-45，谷氨酸钠30-45, 酵母浸粉8-12，K₂HPO₄•3H₂O2-4，(NH₄)₂SO₄ 2-4，MgSO₄•7H₂O 0.1-0.2，MnSO₄•H₂O 0.02-0.06，pH 7.0，115℃高压灭菌20min。

脱脂牛奶培养基(g/L)：脱脂奶粉10-15，琼脂15，115℃，高压灭菌20min。

(7)培养方法。

种子培养：挑取1-2环取活化后的菌种，接入种子培养基培养18-24h。

发酵培养：以5%接种量将种子液接入6/24孔板（深孔板，装液量分别为3-5mL；1-1.4mL），30-37 ℃，220 r/min，恒温振荡48-54 h。

相比于现有技术，本发明有以下优势。

相对于其它诱变技术，本发明不需要昂贵的设备，诱变操作简单，一般技术人员即可进行操作。

本发明联合使用了四种诱变剂，诱变效率高，突变幅度大，筛选出的菌株稳定性高，可以解决菌株对单一诱变剂不敏感的现象，避免单一诱变剂的饱和效应。

使用透明圈法结合6/24孔板进行诱变后菌株的筛选，可以快速筛选出目的菌株，对比250mL摇瓶发酵筛选，速度至少提高10倍以上，且节约筛选成本。

附图说明。

图1为γ-PGA高产菌株的选育流程图。

图2为γ-PGA透明圈示意图。

图3为不同发酵菌株的γ-PGA产量。

图4为传代后，第一代（无色）和第六代（灰色）的产量比较。

图5为第六代不同菌株之间T检验结果。

下面结合具体实施案例对本发明做进一步说明。

实施例1。

γ-PGA的高产菌株的诱变方法，包括以下步骤。

诱变剂配制。

NTG母液：称取NTG 0.4 g，加入少量丙酮助溶，移入10mL容量瓶并定容，避光冷藏保存。

DES母液：取DSE液体0.5mL，加入乙醇助溶，使用磷酸盐缓冲液定容至10mL，避光冷藏保存。

5-BrU母液：称取25mg的5-BrU加入10mL无菌水，避光冷藏保存。

取用以上溶液时，用0.22μm无菌滤头过滤除菌，稀释后使用。

磷酸盐缓冲液（PBS）：A液（0.2 mol/L Na₂HPO₄）：称取 Na₂HPO₄.12H₂O 71.6 g，加水搅拌进行溶解，加水定容到1 L，121 ℃高压灭菌 20 min。配制母液 B（0.2 mol/LNaH₂PO₄）：称取NaH₂PO₄·2H₂O 31.2 g，加水搅拌进行溶解，加水定容到1 L，121 ℃高压灭菌20 min，常温储存。PBS工作液：A液12.3mL与B液 87.7mL混合。

0.9%生理盐水：称取9 g NaCl溶于500mL无菌水后定容到1 L；121 ℃高压灭菌 20min，4 ℃保存备用。

25% Na₂S₂O₃溶液：62.05g Na₂S₂O₃·5H₂O溶于水后定容到1 L，使用时用0.22μm无菌滤头过滤除菌，避光保存。

(1) 菌株的活化：取γ-PGA生产菌株的甘油管菌种，于LB培养基平板中，30-37 ℃下活化18-24h。

(2) 菌液的制备：挑取(1)中单菌落，接入LB液体培养基，150-180 r/min，35-37℃下培养18-24h。取培养后的菌液1mL，稀释10⁴倍后备用。

菌株诱变。

(1)取一只无菌试管加入(2)中菌液、DSE和NTG（浓度见表1），体积比为1:2:2，30-37℃，150-180 r/min震荡30 min，加入Na₂S₂O₃溶液终止反，3000 r/min 离心15min，弃去上清液，加入等量生理盐水重悬，得诱变菌液。

(2)将取步骤1中菌液置于30W紫外灯30 cm处照射(照射时间见表1)，添加等体积的液体发酵培养基，黑暗处避光孵育6-12h，获得新的诱变菌液。

(3)红光灯下，取步骤2中菌液，添加等体积5-溴尿嘧啶（浓度见表1），混匀后涂布于脱脂牛奶平板（不同处理分别编号1-9）。30-37℃培养12-18h。

表1 不同平板中诱变剂浓度和致死率

处理	UV(t/s)	5-BrU(g/L)	NTG(g/L)	DES(%)	致死率%
						1	30	15	0.2	0.5	89.3
2	30	25	0.4	1	91.3
						3	30	35	0.6	1.5	98.4
4	40	15	0.4	1.5	97.4
						5	40	25	0.6	0.5	93.9
6	40	35	03	1	93.8
						7	50	15	0.6	1	945
8	50	25	0.2	1.5	99.7
						9	50	35	0.4	0.5	99.3

实施例2。

高产γ-PGA菌株的筛选，包括以下步骤。

(1)菌株的初筛：选取致死率在80-95%的平板，测量透明圈大小（见图2），选取K值较大的菌株。

K=d/D；d：菌落直径；D：透明圈直径。

根据结果选取1、2、5、6、7号处理对应的平板进行K值测量。得到160株菌株的K值。

(2)选取K值大小的前32株菌株，接入24孔板进行发酵，使用酶标仪测定γ-PGA含量测定，结果见图3。

(3)其中C2、C4、C6、C10、C31菌株发酵后γ-PGA产量较高，选取这五个菌株进行6次连续传代培养。统计个菌株之间第一代和第六代间γ-PGA的发酵产量(图4)，和第六代各菌株之间的产量差异(图5)，结果C2菌株，产量明显高于其它菌株，且第一代和第六代之间产量差异不显著。因此选择C2作为最终的目的菌株。