阅读说明：本技术 聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒及其制备方法与应用 (Polylactic acid-calcium carbonate glycollate particle and preparation method and application thereof ) 是由 刘庄 冯良珠 杨志娟 郝钰 朱宇杰 于 2020-09-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒及其制备方法与应用,本发明的聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒以聚乳酸-羟基乙酸和聚乳酸-羟基乙酸-聚乙二醇为壳层,以碳酸钙为核层。本发明还公开了上述聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒在制备肿瘤免疫治疗的佐剂中的应用。本发明的聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒具有良好的调节肿瘤微酸环境的效果,能够增强肿瘤免疫治疗效果,可减少肿瘤中免疫抑制性细胞的含量,增加能够杀伤肿瘤的免疫细胞的含量,并促进肿瘤相关巨噬细胞由M2向M1型极化,有效扭转肿瘤免疫抑制微环境,激活抗肿瘤免疫,抑制肿瘤生长。(The invention relates to polylactic acid-calcium carbonate glycollate particles, a preparation method and application thereof. The invention also discloses application of the polylactic acid-calcium glycolate particle in preparing an adjuvant for tumor immunotherapy. The polylactic acid-calcium glycolate particle has good effect of regulating tumor microacid environment, can enhance tumor immunotherapy effect, can reduce the content of immunosuppressive cells in tumor, increase the content of immunocytes capable of killing tumor, promote the polarization of tumor-related macrophages from M2 to M1, effectively twist tumor immunosuppressive microenvironment, activate antitumor immunity and inhibit tumor growth.)

聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗制剂领域，尤其涉及一种聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒及其制备方法与应用。

背景技术

肿瘤免疫治疗是一种通过激活人体自身免疫系统来抑制肿瘤生长的治疗手段，其核心在于有效激活肿瘤患者体内的T淋巴细胞的抗肿瘤反应，实现对肿瘤生长的特异性抑制和杀灭。经过多年的发展，癌症免疫疗法主要可以分为免疫调节剂、免疫检查点阻断疗法、过继性免疫疗法和免疫疫苗四个方面。

免疫调节剂主要是指利用如白介素、干扰素、功能性多糖及多肽等活性成分产生非特异性的免疫调节用于提高机体的免疫功能，从而激活抗肿瘤免疫反应。免疫检查点阻断疗法是指通过阻断癌细胞和其对应的配型功能蛋白的结合来促进机体免疫细胞对肿瘤的识别，经典的免疫检查点通路有CTLA-4与CD80/CD86和PD-1与PD-L1/PD-L2。免疫检查点阻断疗法是激活治疗性抗肿瘤免疫最有前途的方法，在临床取得了较好的治疗效果。但是，目前仍面临着响应率较低的问题，限制了其临床应用。

目前，FDA已经批准了6种免疫检查点抑制剂用于治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌和霍奇金淋巴瘤等多种恶性肿瘤。近两年内，中国已经上市了5种PD-1药物，其中包含了三种国产抗体，分别为特瑞普利单抗、信迪利单抗及卡瑞利珠单抗。过继性细胞疗法主要是将供体的免疫细胞输送给患者，从而提高患者的免疫功能，有效杀死体内肿瘤。CAR-T是研究最为广泛的肿瘤免疫细胞疗法之一，通过在体外对患者的T细胞进行特异性地基因改造，赋予T细胞识别肿瘤细胞表面特定蛋白的能力，从而有效发现和杀伤癌细胞，经批量扩增后回输给病人。该细胞疗法能精准杀伤多种恶性肿瘤，治疗效果更佳持久。免疫疫苗是利用灭活的肿瘤细胞或抗原物质刺激机体产生特异性细胞免疫和体液免疫，有效地预防肿瘤的扩散和复发。

由于肿瘤细胞的快速增殖、代谢途径改变、肿瘤血管发育畸形等原因，实体肿瘤常有着乏氧、微酸、间隙压高、高活性氧、免疫耐受等一系列与正常组织不同的微环境特征。其中，肿瘤微酸不但可以通过降低T细胞分泌IFN-β和TNF-α等效应性细胞因子、并诱导T淋巴细胞凋亡等途径来抑制机体的抗肿瘤免疫功能，还会导致抗体降解与失活，进而对基于anti-PD-1/PD-L1等免疫检查点阻断疗法的疗效产生负面影响。

尽管激活机体免疫功能来消灭癌细胞有着广阔的前景，然而传统免疫疗法在治疗时也暴露出了许多与过度免疫相关的毒副作用，如免疫检查点抑制剂的响应度较低，仅对部分病人有效。使用免疫疗法容易产生细胞因子风暴，破坏机体的稳态，使得过度活化的免疫细胞攻击机体正常的细胞和器官，严重威胁病人的生命。如何在提高肿瘤免疫治疗效果的同时减小毒副作用是未来免疫疗法的发展重点之一。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒及其制备方法与应用，本发明的聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒具有良好的调节肿瘤微酸环境的效果，能够增强肿瘤免疫治疗效果，可减少肿瘤中免疫抑制性细胞的含量，增加能够杀伤肿瘤的免疫细胞的含量，并促进肿瘤相关巨噬细胞由M2向M1型极化，有效扭转肿瘤免疫抑制微环境，激活肿瘤免疫，抑制肿瘤生长。

本发明提供了一种聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒(CaCO₃@PLGA-PEG)，其以聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)和聚乳酸-羟基乙酸-聚乙二醇(PLGA-PEG)为壳层，以碳酸钙(CaCO₃)为核层。

进一步地，聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒粒径为100～120nm。

本发明还提供了一种上述聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒的制备方法，包括以下步骤：

A)将聚乳酸-羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸-聚乙二醇在溶剂中混合，得到PLGA和PLGA-PEG混合溶液；

B)将PLGA和PLGA-PEG混合溶液与NaHCO₃溶液混合，乳化，得到第一乳液；将PLGA和PLGA-PEG混合溶液与CaCl₂水溶液混合，乳化，得到第二乳液；

C)将第一乳液和第二乳液混合，乳化，得到第三乳液；

D)将第三乳液分散于聚乙烯醇水溶液中，搅拌、洗涤得到聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒。

进一步地，在步骤A)中，聚乳酸-羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸-聚乙二醇的质量比为1～2:1～2；PLGA与PLGA-PEG的混合溶液的浓度为25～35mg/ml；溶剂为二氯甲烷。

进一步地，在步骤B)中，NaHCO₃溶液的浓度为0.6～0.7M，CaCl₂水溶液浓度为1～1.5M。

进一步地，在步骤B)中，PLGA和PLGA-PEG混合溶液与NaHCO₃溶液的体积比为2～3:1；PLGA和PLGA-PEG混合溶液与CaCl₂水溶液的体积比为2～3:1。优选地，PLGA和PLGA-PEG混合溶液与NaHCO₃溶液的体积比为3:1；PLGA和PLGA-PEG混合溶液与CaCl₂水溶液的体积比为3:1。

进一步地，在步骤C)中，乳化为超声乳化，超声功率为80～120W；超声时间为250～350s。

进一步地，在步骤D)中，聚乙烯醇水溶液的质量分数为1％～2％；搅拌的时间为10～14h；洗涤为14000～15000rpm的条件下离心20～30min，用超纯水洗涤2～3次。

本发明的第三个目的是公开上述聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒在制备肿瘤免疫治疗的佐剂中的应用。

进一步地，肿瘤包括黑色素瘤、结肠癌皮下肿瘤、乳腺癌皮下肿瘤中的一种或几种。

进一步地，肿瘤免疫治疗的佐剂为注射剂。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明提供了CaCO₃@PLGA-PEG及其制备方法，CaCO₃@PLGA-PEG以PLGA和PLGA-PEG为壳层，以碳酸钙颗粒为核层，其粒径均一，在水中分散良好，在生理条件下具有良好的稳定性，具有良好的质子中和能力，可用于肿瘤微酸环境的调控，且具有较长的血液循环时间，会随着时间的延长逐渐在肿瘤部位富集。

本发明还公开了CaCO₃@PLGA-PEG在制备肿瘤免疫治疗的佐剂中的用途，其作为肿瘤免疫治疗的佐剂时，具有良好的增强肿瘤免疫治疗的效果，静脉注射CaCO₃@PLGA-PEG与免疫检查点阻断抗体，能够有效调控肿瘤部位免疫微环境，减少肿瘤中免疫抑制性细胞，如髓系来源抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)，调节性T细胞(regulatoryT,Treg)的含量，增加能够杀伤肿瘤的免疫细胞，如自然杀伤细胞(natural killer,NK)，CD8+T淋巴细胞的含量，并促进肿瘤相关巨噬细胞由M2向M1型极化，有效扭转肿瘤免疫抑制微环境，激活肿瘤免疫，抑制肿瘤生长。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

图1是聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒的透射电镜图、在不同生理溶液中的粒径分布以及其质子中和能力测试结果；

图2为小鼠静脉注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒之后的血液循环曲线、静脉注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒之后的肿瘤富集荧光成像及静脉注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒之后的生物分布情况；

图3为静脉注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙之后小鼠肿瘤部位pH值变化情况；

图4为静脉注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙之后的免疫微环境变化情况；

图5为静脉注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙之后的细胞因子变化情况；

图6为不同治疗组的活体治疗实验评价结果；

图7为不同分组的小鼠黑色素瘤在免疫治疗后肿瘤的生长曲线。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例一：聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒的制备

将PLGA与PLGA-PEG按照质量比1:1的比例称取后，溶于二氯甲烷中，配成30mg/ml的PLGA和PLGA-PEG混合溶液。称取NaHCO₃与CaCl₂分别溶于水中制备0.625M NaHCO₃水溶液与1.25M CaCl₂水溶液。将制备的NaHCO₃水溶液与CaCl₂水溶液分别与PLGA和PLGA-PEG混合溶液按照体积比1:3的比例混合，在超声功率为100W的条件下用超声细胞破碎仪超声乳化297s，得到乳液A(NaHCO₃@PLGA-PEG)和乳液B(CaCl₂@PLGA-PEG)。将乳液A与乳液B混合，在超声功率为100W的条件下用超声细胞破碎仪超声乳化297s，得到乳液C。将得到的乳液C分散在1％PVA水溶液中，连续搅拌12h除去二氯甲烷。在14800rpm的条件下离心20min，用超纯水洗三次，得到聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒(CaCO₃@PLGA-PEG)。

实施例二：聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒的性质检测

对实施例1制得的聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒进行定性检测，分别进行透射电镜检测、动态光散射以及质子中和能力检测。

其中，透射电镜检测的结果如图1a所示，结果显示，实施例1制得的聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒在水中呈单分散状态分布，表明本发明制得的聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒的粒径均一，在水中分散良好。

动态光散射检测的结果如图1b所示，结果显示，实施例1制得的聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒在不同生理溶液(H₂O、PBS、细胞培养基、FBS)中都具有良好的稳定性，粒径主要集中在120nm左右，可进行活体水平的实验。

向HCl水溶液中加入实施例1制得的聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒以进行质子中和实验，如图1c所示，实施例1制得的聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒能够有效中和酸性溶液中的H⁺，使酸性溶液的pH值升高，证明了其具有良好的质子中和能力，可用于肿瘤微酸环境的调控。

实施例三：聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒在小鼠体内的行为检测

对实施例1制得的聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒在小鼠体内的行为进行检测。首先进行血液循环检测，将荧光染料DIR标记的聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒静脉注射到小鼠体内，在不同时间点收集小鼠血液并检测血液中的荧光强度。血液循环的结果如图2a所示，结果显示，实施例1制得的聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒静脉注射后在小鼠体内有较长的血液循环时间。肿瘤富集的结果如图2b所示，图2b中，虚线圆圈内表示肿瘤部位的荧光。对荷瘤小鼠的荧光成像结果证明，在静脉注射该聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒之后，会随着时间的延长逐渐在肿瘤部位富集。生物分布的检测结果如图2c所示，图2c中，从左到右依次是肝，脾，肾，心，肺，肿瘤。结果显示，实施例1制得的聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒静脉注射24h后除在肝脾外，在肿瘤部位有较高的富集，在肾、心、肺几乎没有富集。

实施例四：聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒对肿瘤微环境的调控检测

对实施例1制得的聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒对肿瘤微环境的调控行为进行检测。对肿瘤小鼠静脉注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙，聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙分别在第0,48,96小时静脉注射，分别检测静脉注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒后肿瘤部位pH值变化，肿瘤中免疫细胞的变化，血液及肿瘤中细胞因子的变化。

用pH微电极检测了静脉注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒后小鼠肿瘤部位的pH值变化，肿瘤部位pH值变化如图3所示，从左到右依次为第0,24,48,72,96,120h的肿瘤部位pH值，每个时间点的三个圆点代表三只小鼠，图3中箭头所对应的时间点为聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒注射时间点。结果显示，静脉注射24h后，肿瘤部位pH值有较为明显的升高，具体可从6.7-6.8上升至6.9-7.1，随后又降低至6.8。因此，可在第0,48,96h分别静脉注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒，通过持续的注射实现对肿瘤微酸环境的持续调控。

接下来，探究调控肿瘤微酸环境对肿瘤免疫微环境的影响。在0，2，4天分别静脉注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒之后，流式检测肿瘤细胞中免疫细胞的变化。肿瘤部位免疫细胞的变化如图4所示，图4a代表髓系来源抑制细胞MDSC)，图4b代表调节性T细胞(regulatory T,Treg)，图4c代表自然杀伤细胞(NK)，图4d代表CD8+T淋巴细胞，图4e代表M1型巨噬细胞，图4f代表M1与M2型巨噬细胞的比例。每张图中圆点代表对照组(只注射生理盐水)，方形代表注射聚乳酸-羟基乙酸微粒组，三角形代表注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒组。每组的五个点代表五只小鼠。结果显示，在经过聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒的持续调控之后，肿瘤细胞中的免疫抑制性细胞，如髓系来源抑制细胞(MDSC)显著减少，调节性T细胞(regulatory T,Treg)的含量也有所降低。而能够杀伤肿瘤的免疫细胞，如自然杀伤细胞(NK)，CD8+T淋巴细胞的含量都有所增加。此外，肿瘤相关巨噬细胞也由M2向M1型极化。以上结果均表明聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙对肿瘤微酸环境的调控能够有效扭转肿瘤免疫抑制微环境，激活肿瘤免疫。

同时，还检测了静脉注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒之后小鼠血清及肿瘤上清中的细胞因子变化。血液及肿瘤中的细胞因子变化如图5所示，图5a为血清中的TNF-α变化，图5b为血清中的IFN-γ变化，图5c为肿瘤上清中的TNF-α变化，图5d为肿瘤上清中的IFN-γ变化，图5e为肿瘤上清中的IL-12变化，图5f为肿瘤上清中的IL-10变化。每张图中黑色柱状代表对照组(只注射生理盐水)，浅灰色柱状代表注射聚乳酸-羟基乙酸微粒组，深灰色柱状代表注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒组。结果表明，血清中的TNF-α和IFN-γ含量较低且未观察到明显变化，证明静脉注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒不会引起全身的免疫反应，具有可靠的安全性。而在肿瘤上清中，IFN-γ含量显著升高。此外肿瘤中的IL-12含量也有所升高，而IL-10的含量显著降低。以上结果都表明静脉注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒能够有效激活肿瘤部位的免疫反应。

实施例五：肿瘤的免疫治疗

在以上结果的基础上，本发明还探究了静脉注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒对肿瘤微酸及肿瘤免疫微环境的调控是否会对肿瘤免疫治疗起到一定的增强作用。

将带有结肠癌皮下肿瘤模型的小鼠分为四组，其中包括：第一组，对照组(仅注射生理盐水)；第二组，注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙组；第三组，注射aPD-1免疫治疗组；第四组，注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙和aPD-1免疫治疗组。对小鼠进行相应的治疗后，测量其肿瘤的生长，结果见于图6。图6a为不同治疗组小鼠的生长曲线，图6b为不同治疗组的存活曲线，图6c-f依次为对照组(仅注生理盐水，PBS)、注射aPD-1免疫治疗组(aPD-1)、注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙组(PLGA-CaCO₃)、注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙以及aPD-1免疫治疗组(aPD-1+PLGA-CaCO₃)的肿瘤体积变化情况。结果表明，相比较对照组，第四组的肿瘤生长则得到了有效的抑制。表明聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙制剂能够实现对肿瘤的增强的免疫治疗。

上述结论在小鼠黑色素瘤模型中也得到了验证。将带有黑色素瘤模型的小鼠分为六组，其中包括：第一组，对照组(仅注射生理盐水)；第二组，注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙组；第三组，注射aPD-1免疫治疗组；第四组，注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙和aPD-1免疫治疗组；第五组，注射aCTLA-4免疫治疗组；第六组，注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙和aCTLA-4免疫治疗组。对小鼠进行相应的治疗后，测量其肿瘤的生长，结果见于图7。图7a-g依次为、对照组、注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙组、注射aPD-1免疫治疗组、注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙和aPD-1免疫治疗组、注射aCTLA-4免疫治疗组、注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙和aCTLA-4免疫治疗组的肿瘤生长曲线。结果表明，对照组相比，注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙和aPD-1免疫治疗组，注射聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙和aCTLA-4免疫治疗组的肿瘤生长都有所减缓，进一步表明聚乳酸-羟基乙酸碳酸钙微粒能够实现对肿瘤的增强的免疫治疗。

以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。