具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1配方GA-PEG-PLA 1mg、PEG-PLA9mg、西瑞香素1mg。

实施例2配方GA-PEG-PLA 0.5mg、PEG-PLA8mg、西瑞香素0.5mg。

实施例3配方GA-PEG-PLA 3mg、PEG-PLA10mg、西瑞香素3mg。

实施例4制备方法

1)精密称取1mgGA-PEG-PLA和9mgPEG-PLA放入西林瓶，加入体积比为1﹕1的乙腈﹕二氯甲烷混合溶剂5mL，于磁力搅拌器上搅拌溶解，再加入1mg西瑞香素，继续搅拌溶解完全，将混合溶液转移至圆底烧瓶，45℃减压旋蒸除去有机试剂，得透明蓝色薄膜；

2)在透明蓝色薄膜加入预热去离子水10mL，65℃常压旋转水化30min后转移至烧杯中，室温搅拌4h，以功率为90w的避光探头超声6min，再以3000rpm/min离心5min，取上清液过0.45μm微孔滤膜，得GA-PEG-PLA/PEG-PLA-DAP载药胶束溶液，即为西瑞香素胶束溶液；

3)用冻干保护剂普朗尼克Pluronic F-68与西瑞香素胶束溶液充分混合后于-80℃冰箱中预冻12h，置真空冷冻干燥机中干燥36h，得到冻干后的西瑞香素胶束。

实施例5制备方法

1)精密称取0.5mg GA-PEG-PLA和8mgPEG-PLA放入西林瓶，加入体积比为2﹕1的乙腈﹕二氯甲烷混合溶剂2.5mL，于磁力搅拌器上搅拌溶解，再加入0.5mg西瑞香素，继续搅拌溶解完全，将混合溶液转移至圆底烧瓶，40℃减压旋蒸除去有机试剂，得透明蓝色薄膜；

2)在透明蓝色薄膜加入预热去离子水5mL，45℃常压旋转水化5min后转移至烧杯中，室温搅拌0.5h，以功率为60w的避光探头超声6min，再以3000rpm/min离心5min，取上清液过0.45μm微孔滤膜，得GA-PEG-PLA/PEG-PLA-DAP载药胶束溶液，即为西瑞香素胶束溶液；

3)用冻干保护剂普朗尼克Pluronic F-68与西瑞香素胶束溶液充分混合后于-70℃冰箱中预冻10h，置真空冷冻干燥机中干燥30h，得到冻干后的西瑞香素胶束。

实施例6制备方法

1)精密称取3mg GA-PEG-PLA和10mgPEG-PLA放入西林瓶，加入体积比为1.5﹕1的乙腈﹕二氯甲烷混合溶剂15mL，于磁力搅拌器上搅拌溶解，再加入3mg西瑞香素，继续搅拌溶解完全，将混合溶液转移至圆底烧瓶，50℃减压旋蒸除去有机试剂，得透明蓝色薄膜；

2)在透明蓝色薄膜加入预热去离子水30mL，85℃常压旋转水化120min后转移至烧杯中，室温搅拌6h，以功率为210w的避光探头超声6min，再以3000rpm/min离心5min，取上清液过0.45μm微孔滤膜，得GA-PEG-PLA/PEG-PLA-DAP载药胶束溶液，即为西瑞香素胶束溶液；

3)用冻干保护剂普朗尼克Pluronic F-68与西瑞香素胶束溶液充分混合后于-90℃冰箱中预冻15h，置真空冷冻干燥机中干燥40h，得到冻干后的西瑞香素胶束。

实施例7制备方法

1)精密称取2mg GA-PEG-PLA和9mgPEG-PLA放入西林瓶，加入体积比为1﹕1的乙腈﹕二氯甲烷混合溶剂10mL，于磁力搅拌器上搅拌溶解，再加入2mg西瑞香素，继续搅拌溶解完全，将混合溶液转移至圆底烧瓶，48℃减压旋蒸除去有机试剂，得透明蓝色薄膜；

2)在透明蓝色薄膜加入预热去离子水20mL，55℃常压旋转水化80min后转移至烧杯中，室温搅拌2h，以功率为150w的避光探头超声6min，再以3000rpm/min离心5min，取上清液过0.45μm微孔滤膜，得GA-PEG-PLA/PEG-PLA-DAP载药胶束溶液，即为西瑞香素胶束溶液；

3)用冻干保护剂普朗尼克Pluronic F-68与西瑞香素胶束溶液充分混合后于-85℃冰箱中预冻14h，置真空冷冻干燥机中干燥38h，得到冻干后的西瑞香素胶束。

实施例8

上述实施例4-7制备的胶束，分别按常规固体粉末制剂的制备方法，加入相关制剂辅料和赋型剂，分别制成靶向制剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、液体混悬剂等。

实施例4-7均分别按实施例9、10中载西瑞香素纳米胶束溶液含量检测方法检测。

实施例9检测方法

1)对照品溶液：精密称取西瑞香素对照品适量，置于量瓶中，加入适量甲醇超声溶解，定容至刻度，配制成浓度为100μg/mL西瑞香素储备液，备用；

2)供试品溶液：精密吸取载西瑞香素胶束溶液1.5mL于容量瓶中，加入1mL甲醇超声破乳10min，甲醇补足定容至刻度，溶液过0.45μm微孔滤膜，备用；

3)色谱条件：Diamonsil C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相甲醇-0.2％磷酸水(58∶42)；流速1.0mL·min^-1；检测波长346nm；柱温35℃；

4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定两种载药胶束中西瑞香素的含量。

实施例10检测方法

1)对照品溶液：精密称取西瑞香素对照品适量，置于量瓶中，加入适量甲醇超声溶解，定容至刻度，配制成浓度为100μg/mL西瑞香素储备液，备用；

2)供试品溶液：精密吸取载西瑞香素胶束溶液1.5mL于容量瓶中，加入2mL甲醇超声破乳10min，甲醇补足定容至刻度，溶液过0.45μm微孔滤膜，备用；

3)色谱条件：Diamonsil C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相甲醇-0.2％磷酸水(58∶42)；流速1.0mL·min^-1；检测波长346nm；柱温35℃；

4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定两种载药胶束中西瑞香素的含量。

实验例：为证明本发明的科学性与合理性，进行了以下方法学实验研究：

1载DAP的PEG-PLA聚合物胶束的制备及工艺优化

聚合物胶束是由两亲性嵌段共聚物在水中通过自组装而形成的具有独特核-壳结构的材料，具有延长药物在体内的滞留时间，改善药物的溶解度，降低毒性，提高生物利用度等特点。聚乳酸(PLA)和聚乙二醇(PEG)是构建聚合物胶束常用的高分子材料，且PEG和PLA的安全性已得到认证。西瑞香素具有抗病毒、抗炎、抗肿瘤等药理作用，西瑞香素本身溶解性不好，在一定程度上由于给药困难限制了其应用，本章以PEG-PLA为载体材料，以西瑞香素为实验药物对象，通过单因素试验，不同分子量载体材料的优选试验，以载药量和包封率为评价指标，初步确定PEG-PLA载西瑞香素胶束(PEG-PLA-DAP)的制备工艺，最后用Box-Behnken响应面法对西瑞香素胶束制备工艺进行优化。

实验方法

1.1试剂及仪器

1.1.1试剂

1.1.2仪器

1.2薄膜水化法制备西瑞香素胶束的单因素考察

1.2.1初步优选工艺的确定

采用薄膜水化法制备西瑞香素纳米胶束，精密称取PEG-PLA放入西林瓶，加入有机溶剂，于磁力搅拌器上搅拌溶解，再加入已精密称取的西瑞香素，继续搅拌溶解完全，将混合溶液转移至圆底烧瓶，45℃减压旋蒸除去有机试剂，得透明蓝色药物聚合物混合膜，混合膜加入预热去离子水，常压旋转水化后转移至烧杯中，室温搅拌数小时，超声波仪避光探头超声6min(间隔4s，超声2s)，3000rpm/min离心5min，取上清液过0.45μm微孔滤膜，即得西瑞香素胶束溶液。实验过程中依次对载药比、有机溶剂的种类和用量，水化温度、水化时间和水化水用量、搅拌时间以及超声功率这八个因素进行考察，以包封率和载药量为指标，初步优选出最佳工艺。

1.2.2单因素考察的筛选

(1)载药比的筛选

查阅文献，选用乙醇和二氯甲烷(2：1)混合溶剂作为有机试剂，固定了有机试剂的用量是5mL，选择去离子水作为水化介质，固定水化温度为55℃，水化时间为30min，用量为10mL，搅拌时间为2h，超声功率设置为90w。西瑞香素投药量均为1mg，PEG-PLA载体材料用量分别为2、4、6、8、10、20mg，按照“1.2.1”项下方法制备西瑞香素胶束。采用高效液相色谱法测定包封率和载药量。结果见表1，从表1中可以看出，随着载体投量从2mg增加为10mg时，包封率和载药量逐渐升高，但当载体从10mg增加为20mg时，包封率变化不大，载药量下降，综合考虑，选择载药比为10：1作为合适比例进行后续考察。

表1载药比的筛选

(2)有机溶剂种类的筛选

选择载药比为10：1，其它因素条件和“1.2.1”项下一样，改变有机溶剂种类，所用有机溶剂分别为甲醇-二氯甲烷、乙醇-二氯甲烷、丙酮-二氯甲烷、乙腈-二氯甲烷(均为2：1)，按照“1.2.1”项下方法制备西瑞香素胶束。不同有机溶剂下包封率和载药量结果见表2。从表2中得出，以乙腈-二氯甲烷(2：1)为溶剂时，载药胶束的包封率和载药量都较高，因此可以作为较佳溶剂。

表2有机溶剂种类的筛选

(3)有机溶剂用量的筛选

按照“1.2.1”项下方法制备西瑞香素胶束。选择载药比为10：1，有机溶剂为乙腈-二氯甲烷(2：1)，混合溶剂的用量分别为2.5、5、7.5、10、12.5、15mL，其它条件保持不变。结果表明：溶剂为2.5mL时，包封率和载药量均较低，可能和药物没有完全溶解有关，其它剂量下，溶剂用量对包封率和载药量影响较小。考虑到当剂型工艺放大时会增加溶剂用量，因此选择5mL作为合适剂量，其包封率和载药量详细结果见表3。

表3有机溶剂用量的筛选

(4)水化温度的筛选

按照“1.2.1”项下方法制备西瑞香素胶束。选择载药比为10：1，有机溶剂为乙腈-二氯甲烷(2：1)，用量为5mL，水化温度分别为常温、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃，其它条件保持不变，结果见表4。从表4中可以看出，温度对载药胶束的包封率和载药量影响不大，最终选择65℃作为最优水化温度。

表4水化温度的筛选

(5)水化时间的筛选

选择载药比为10：1，有机溶剂为乙腈-二氯甲烷(2：1)，用量为5mL，水化温度为65℃，其它条件保持不变。设置水化时间分别为5min、10min、20min、30min、1h、2h，按照“1.2.1”项下方法制备西瑞香素胶束。结果表明，随着水化时间延长，载药量和包封率均升高，但从30min后，载药量和包封率升高不明显，且2h比1h还有降低趋势，可能和长时间旋蒸，水分流失带走部分药物有关。虽然水化1h时其载药量和包封率比水化30min高，但是时间相应增加一倍，当剂型工艺放大时，水化水量增加可能也会造成药物损失，综合考虑，选择30min作为最佳水化时间。结果见表5。

表5水化时间的筛选

(6)水化体积的筛选

按照“1.2.1”项下方法制备西瑞香素胶束。选择载药比为10：1，有机溶剂为乙腈-二氯甲烷(2：1)，溶剂用量为5mL，水化温度为65℃，水化时间为30min，水化水用量分别为5、10、15、20、25、30mL，其它条件保持不变。结果见表6。当水化体积为10mL时，其包封率和载药量最高。

表6水化水用量的筛选

(7)搅拌时间的筛选

固定载药比为10：1，有机溶剂为乙腈-二氯甲烷(2：1)，溶剂用量为5mL，水化温度为65℃，水化时间为30min，水化水用量为10mL，搅拌时间分别为0.5、1、2、3、4、6h，其它条件保持不变，按照“1.2.1”项下方法制备西瑞香素胶束。结果表明，随着搅拌时间增加，包封率和载药量升高，其中从0.5h到4h增加明显，4h和6h变化不大，因此选择4h为最优搅拌时间，结果见表7。

表7搅拌时间的筛选

(8)探头超声功率的筛选

选择载药比为10：1，有机溶剂为乙腈-二氯甲烷(2：1)，溶剂用量为5mL，水化温度为65℃，水化时间为30min，水化水用量为10mL，搅拌时间为4h，超声功率分别为60、90、120、150、180、200w，按照“1.1.1”项下方法制备西瑞香素胶束。结果见表8，从表8中可知，超声功率对胶束的影响较大，功率太小起不到超声混匀作用，功率太大会破坏胶束的形成，导致游离药物增多。结果表明探头超声功率为90w(开2s，停4s，总计6min)时，能获的较高的包封率和载药量。

表8超声功率的筛选

1.3不同分子量PEG-PLA载体材料的考察

根据单因素优选出来的制备工艺，分别用PEG3400-PLA2000、PEG2000-PLA2000、PEG2000-PLA5000三种嵌段共聚物材料进行载药，各自平行三次试验，以载药量、包封率、胶束的粒径、电位和多分散系数进行综合评价考察，筛选出最佳载药材料。

载药胶束的制备：精密称取10mg PEG2000-PLA2000放入西林瓶，加入5mL乙腈：二氯甲烷(2：1)混合溶剂，于磁力搅拌器上搅拌溶解，再加入1mg西瑞香素，继续搅拌溶解完全，将混合溶液转移至圆底烧瓶，45℃减压旋蒸除去有机试剂，得透明蓝色薄膜，加入预热去离子水10mL，65℃常压旋转水化30min后转移至烧杯中，室温搅拌4h，避光探头超声6min(间隔4s，超声2s，功率90w)，3000rpm/min离心5min，取上清液过0.45μm微孔滤膜，即得西瑞香素胶束溶液。按照如上制备工艺，分别用分子量PEG3400-PLA2000和PEG2000-PLA5000制备载西瑞香素胶束，实验均平行三次。各载药胶束的包封率和载药量，粒径、电位以及多分散系数结果见表9、图1。从表9中可知，材料PEG3400-PLA2000作为载体时，载药胶束的包封率和载药量较高，粒径较小，PDI＝0.205小于0.3，符合要求，因此选PEG3400-PLA2000作为胶束载体材料。

表9不同分子量载体材料的筛选(n＝3)

1.4 Box-Behnken响应面法优化西瑞香素胶束制备工艺

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken响应面法优化西瑞香素胶束制备工艺并验证。选取载药比(A)、有机溶剂的用量(B)、水化水用量(C)为影响因素，以包封率(50％)、载药量(25％)、粒径(25％)的综合评分为评价指标，进行三因素三水平试验设计，因素水平设计表见表10。应用Design-Expert 8.0.6软件分析处理试验结果。

表10因素水平表

结果：由于本试验设计包含包封率、载药量和粒径三个指标，而多指标的数据处理一般采用总评归一值(overall desirability，OD)法；对取值越小越好的指标(粒径)和取值越大越好的指标(包封率和载药量)，分别采用Hassan方法，求归一值，故以OD为响应变量(Y)。所得结果见表11。

表11 BBD试验设计结果

模型拟合及方差分析结果：以OD值为响应值，应用Design Expert 8.0.6软件分别对A、B、C三个因素进行多元线性回归和二项式拟合，得到回归方程:Y＝0.73+0.16A+0.04B+0.046C+0.042AB-0.015AC+0.0025BC-0.22A2+0.038B2-0.1C2(R2＝0.9618)响应面模型对OD值的方差分析结果见表12。由表可知，R2＝0.9618，调整R²＝0.9127，表明该模型可解释91.27％包封率的变化。失拟项P＝0.619＞0.05，表明其他未知因素对实验干扰小，能较好地模拟实际情况，可以用此模型对制备工艺进行分析。

基于二项式拟合方程，应用Design Expert 8.0.6软件，通过固定其中一个因素，绘制另外两个因素对总评归一值影响的三维响应面。经软件分析筛选，得到载药胶束的最优制备工艺参数为：载药比15：1，有机溶剂的用量为6mL，水化体积为10.33mL。

表12方差分析

验证试验：

综合考虑实际情况，便于量取液体，最终确定载药比为15：1，有机溶剂的用量为6ml，水化体积为10mL。在此条件下进行3次平行验证试验，测定粒径、包封率和载药量。结果见表13。计算得实际OD值为0.82，与原理论OD值0.80相比偏差不大，表明该制备工艺稳定，重复性好。

表13验证实验结果(n＝3)

结论：通过薄膜水化法成功制备了PEG-PLA-DAP胶束。PP-DAP胶束的粒径在120nm左右，包封率大于70％，载药量10％左右，Zeta电位在-12mV左右，PDI指数小于0.3。

在单因素试验部分，我们选择PEG和PLA的分子量均为2000，通过单因素筛选，初步确定工艺条件。为了考察亲水性(PEG)和亲油性材料(PLA)的分子量分别发生变化时，会对胶束性质产生怎样影响，因此我们固定其中一个嵌段共聚物的分子量不变，改变另一个嵌段共聚物的分子量，采用单因素试验确定的工艺条件分别进行试验，即PEG3400-PLA2000和PEG2000-PLA5000分别进行试验。实验结果表明，以材料PEG3400-PLA2000作为载体时，载药胶束的包封率和载药量较高，粒径较小，因此选PEG3400-PLA2000作为胶束载体材料。最后为了得到PP-DAP胶束的最佳制备工艺，在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken响应面法对制备工艺进行了优化。

前期预实验时，采用溶剂挥发法和透析法制备聚合物胶束，实验过程中发现水相和油相比例不好控制，体系不稳定容易破乳，最终选用薄膜水化法制备胶束。薄膜水化法操作简单，耗时短，所测得的粒径较小。所制备的胶束中西瑞香素与疏水链的作用力以及疏水链之间的相互作用力使药物包裹于共聚物的疏水部，亲水的PEG链分散在纳米粒表面形成亲水性的外壳，可以避免载药胶束被网状内皮系统所吞噬，延长药物在血液中的滞留时间，为提高抗肿瘤药物的疗效提供了依据。有文献报导[22-23]，粒径小于200nm的载体可通过EPR效应穿过血管小孔渗透到肿瘤组织，从而有助于药物蓄积在肿瘤组织。血红细胞表面呈负电性，如果静脉注射带正电荷的粒子会引起血红细胞聚集，导致血小板凝集和溶血等严重的不良反应。通过薄膜水化法制备的聚合物胶束的粒径在130nm左右，可以利用EPR效应增加药物在肿瘤组织的蓄积且呈负电性，可降低血红细胞凝聚的风险。

2载DAP的GA-PEG-PLA/PEG-PLA聚合物胶束的制备及两种胶束的理化性质评价

甘草次酸(GA)是从甘草的根及根茎中提取出来的活性成分，由甘草酸(GL)水解而来。近年来研究发现，甘草次酸可以对肝癌、肺癌、宫颈癌、胃癌、结肠癌等起到有效的抑制作用，并且对于正常体细胞的毒性较小，可忽略，研究证明，甘草次酸可以通过修饰目标化合物使其与细胞膜上的甘草次酸受体(Glycyrrhizic Acid Receptor，GA-R)GA-R)特异性结合，利用细胞内吞作用原理进入细胞内发挥药理作用。甘草次酸受体存在于肝细胞和肝肿瘤表面，在病理条件下活力稳定，且在肝肿瘤表面的量是正常组织的1.5～5倍，这对定向杀死肝癌细胞，减少对正常肝功能的损害，具有积极的作用。因此，GA修饰的药物传递系统有效地靶向到肝癌细胞中。

基于筛选出来的工艺条件，采用同样方法，将带有GA的嵌段共聚物GA-PEG-PLA与PEG-PLA以一定比例投料，西瑞香素为目标药物，制备具有肝靶向性的载西瑞香素胶束GA-PEG-PLA/PEG-PLA-DAP(简写为GPP/PP-DAP)，并对GPP/PP-DAP以及PP-DAP载药胶束进行理化性质评价，主要包括胶束粒子的粒径、电位测定以及外观形态的观察，稳定性考察，体外释放和溶血性考察等。

2.1试剂与仪器

2.1.1试剂

2.1.2仪器

2.2载DAP的GA-PEG-PLA/PEG-PLA聚合物胶束的制备

载DAP的GA-PEG-PLA/PEG-PLA(GPP/PP-DAP)聚合物胶束的制备方法同PP-DAP相似。通过查阅文献和预实验研究，确定GPP/PP-DAP聚合物胶束的制备方法如下。

精密称取1mg GA-PEG3400-PLA2000和9mg PEG3400-PLA2000放入西林瓶，加入5mL乙腈：二氯甲烷(1：1)混合溶剂，于磁力搅拌器上搅拌溶解，再加入1mg西瑞香素，继续搅拌溶解完全，将混合溶液转移至圆底烧瓶，45℃减压旋蒸除去有机试剂，得透明蓝色薄膜(旋蒸过程中当气压指针在0.6时关闭真空泵，使用二通阀保持真空状态，避免一直抽真空损失药物)，加入预热去离子水10mL，65℃常压旋转水化30min后转移至烧杯中，室温搅拌4h，避光探头超声6min(间隔4s，超声2s，功率90w)，3000rpm/min离心5min，取上清液过0.45μm微孔滤膜，即得GPP/PP-DAP胶束溶液。

2.3载DAP的GA-PEG-PLA/PEG-PLA聚合物胶束的含量测定

2.3.1西瑞香素含量分析方法的建立

(1)溶液的配制

对照品溶液：精密称取西瑞香素对照品2.50mg，置25mL量瓶中，加入适量甲醇超声溶解，定容至刻度，配制成浓度为100μg/mL西瑞香素储备液，备用。

供试品溶液：精密吸取胶束溶液1mL至2mL容量瓶，加入1mL甲醇超声破乳10min，甲醇补足定容至刻度，溶液过0.45μm微孔滤膜，备用。

(2)色谱条件

Diamonsil C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相甲醇-0.2％磷酸水(58∶42)；流速1.0mL·min^-1；检测波长346nm；柱温35℃；进样量10μL。

(3)专属性考察

为了探究载药胶束中的辅料对西瑞香素的检测是否有干扰。分别取PEG-PLA空白胶束和载西瑞香素纳米胶束(PP-DAP)溶液，按“2.3.1项下”供试品溶液的配制进行处理。再配制一定浓度的西瑞香素对照品甲醇溶液，不含西瑞香素甲醇溶液，将上述溶液按“2.3.1项下”的色谱条件进样分析。

结果：西瑞香素载药胶束，空白胶束，西瑞香素甲醇溶液，纯甲醇溶液的高效液相色谱见图2。由图2可知，PEG-PLA空白胶束在该色谱条件下没有色谱峰出现，甲醇溶液溶剂峰出峰较早，不影响西瑞香素的含量测定。此外，西瑞香素甲醇溶液色谱峰与载西瑞香素胶束色谱峰出峰时间一致，说明该色谱条件可用于载药胶束中西瑞香素的含量测定。

(4)线性关系考察

分别精密量取西瑞香素对照品贮备液10μL，100μL，200μL，400μL，800μL，1.6mL，置于2mL容量瓶中，加入甲醇定容，使西瑞香素浓度分别为0.5，2.5，5，10，20，40，80μg/mL，溶液过0.45μm微孔滤膜，按“2.3.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。以西瑞香素溶液的浓度C(μg/mL)为横坐标，峰面积A(m V·s)为纵坐标绘制标准曲线，拟合线性回归方程。

测得各浓度西瑞香素的峰面积(A)如表14所示。西瑞香素的标准曲线方程y＝35.67x+25.499(R²＝0.9998)，结果表明西瑞香素在线性范围0.5～80μg/mL内线性关系良好，见图3。

表14西瑞香素的峰面积

(5)精密度考察

分别取低(2.5μg/mL)、中(10μg/mL)、高(40μg/mL)浓度的西瑞香素溶液，按“2.3.1项下”色谱条件方法，连续测定6次，计算RSD。

结果：精密度考察结果如表15所示，西瑞香素低、中、高浓度溶液的精密度RSD值均小于1.0％，表明仪器精密度良好。

表15精密度考察结果(n＝6)

(6)重复性考察

分别平行制备6份PP-DAP胶束溶液，按“2.3.1”项下色谱条件方法进样分析，计算RSD值。

结果：PP-DAP胶束重复性考察结果如表16所示，其RSD值小于2.0％，表明供试品溶液的制备方法重复性良好，可用于载药胶束的含量测定。

表16重复性考察结果(n＝6)

(7)稳定性考察

取PP-DAP胶束溶液，于0、2、4、6、12、24h时间点按“2.3.1项下”色谱条件方法进样分析，计算RSD，考察聚合物胶束溶液的稳定性。

稳定性考察结果如表17所示，RSD值小于2.0％，结果表明西瑞香素纳米胶束破乳后在24h内较稳定。

表17稳定性考察结果(n＝6)

(8)加样回收考察

精密量取100μL，200μL，400μL西瑞香素储备液于2mL容量瓶中，按处方比例加入空白载体混合均匀(载体：药物＝10：1)，加入适量甲醇超声10min，甲醇定容至2mL，得到西瑞香素的浓度分别为5,10,20μg/mL，按“2.3.1项下”色谱条件方法测定，计算回收率和RSD。

回收率考察结果如表18所示，结果表明：西瑞香素低、中、高浓度溶液的回收率均大于97.0％，加样回收率符合测定要求。

表18 GPP/PP-DAP加样回收率考察结果(n＝3)

2.3.2载药胶束的包封率及载药量的测定

采用高效液相色谱法测定两种载药胶束中西瑞香素的含量。精密吸取胶束溶液1mL至2mL容量瓶中，加入1mL甲醇超声破乳10min，冷却后加入甲醇补足定容至刻度，溶液过0.45μm微孔滤膜，按“2.3.1项下”色谱条件方法进样分析。包封率和载药量的计算公式如下：

包封率＝W1/W0×100％

载药量＝W1/Wm×100％

其中，W0为西瑞香素的投药量，W1为载药胶束中所包载的西瑞香素的总药量，Wm为冻干后载药胶束的总质量(药物+载体)。

按照“2.2”项下制备方法分别平行制备三份样品，通过高效液相色谱法测定，由相应公式计算的到GPP/PP-DAP的包封率为70％左右，载药量为10％左右。GPP/PP-DAP胶束载药量和包封率均较PP-DAP小。结果见表19。

表19 GPP/PP-DAP胶束载药量和包封率(n＝3)

2.4载药聚合物胶束的理化性质评价

2.4.1粒径、电位的测定、粒子形态的观察

采用激光粒度分析仪测定聚合物胶束的电位和粒径。将PP-DAP和GPP/PP-DAP胶束加入5倍量的去离子水稀释，稀释后的胶束溶液注入两用样品池(粒径测量池与电位测量池)，分别测定胶束的粒径大小、粒度分布与Zeta电位。采用透射电镜(TEM)观察胶束的形态。将样本滴于碳支持膜正面，等待2min，取出碳支持膜吸干水分，再用磷酸钨室温下染色3min，待其干燥后，置于TEM下观察。

胶束粒子形态的观察结果：

通过两种载药胶束的透射电子显微镜观察可知，背景是磷钨酸溶液，因为干燥后不透过电子束而呈现黑色，胶束不被磷钨酸染色而呈现亮白色。结果表明：两种胶束形态均呈类球状，表面圆润规整，大小较均匀，粒径与激光粒度分析仪所测相比变小。两种载药胶束冻干前较冻干后分散性好，冻干后视野下粒子数减少，这可能和冷冻过程中所受压力有关。

胶束粒径和Zeta电位的测定结果：

PP-D纳米胶束和GPP/PP-D纳米胶束的粒径分布图见图4。两种纳米胶束均呈正态分布，证明纳米粒形态均一，分散均匀，由图可知冻干前两种胶束的粒径分布集中在120～170nm之间，冻干后均稍有降低。冻干前后电位变化不大，PP-DAP纳米胶束的电位在-12mV左右，GPP/PP-DAP纳米胶束的电位在-14mV左右。

2.4.2体外稳定性表征

利用粒径、电位和多分散系数在不同温度下随着时间的变化评价其稳定性。将胶束溶液分为两份，分别在4℃冰箱和室温(约25℃)放置一个月，于第0、7、14、21、28天进行拍照监测胶束的外观变化，并进行粒径、电位和多分散系数的测量。另外将冻干胶束粉末放置4℃冰箱一个月后观察外观，测量粒径、电位和多分散系数是否有明显变化。

体外稳定性试验考察结果：

两种载药胶束分别在常温(约25℃)和4℃下放置一个月后，其粒径、电位和多分散系如表20、表21所示，两种载药胶束在室温和4℃下均较稳定，随着放置时间增加，粒径和电位绝对值有缓慢增大趋势，粒径增加了10～20nm左右，多分散系数没有明显变化，总体来说，一个月内，两种胶束分别在两种环境中没有明显差别。PP-DAP和GPP/PP-DAP胶束的冻干粉在4℃条件下一个月后从外观看没有明显变化，其粒径和电位也没有明显改变。

表20 PP-DAP载药胶束体外稳定性研究(n＝3)

表21 GPP/PP-DAP载药胶束体外稳定性研究(n＝3)

2.4.3体外药物缓释实验

精密吸取两种载药胶束放入透析袋(8000-14000)，体积均为5mL，将透析袋分别放入20mL pH5.5(模拟肿瘤区域弱酸环境)和pH7.4(人体正常内部环境)含0.5％吐温80的PBS溶液中，于37℃条件下恒温振摇，摇速设置为100rpm，分别于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48、72、96、120h取样3mL，再补加等体积等温度的空白释放介质。用高效液相色谱法测定释放介质中的西瑞香素含量，按照以下公式计算累积释放度，绘制释放曲线。

公式中，E_r为西瑞香素含量的累积释放度，Ve为取样体积，C_n为第n次取样时释放介质中西瑞香素含量的浓度，C_i为第i次取样时释放介质中西瑞香素含量的浓度(i＝n-1)。V₀为释放介质的总体积，M_d为载药胶束中西瑞香素的质量。

体外药物缓释试验考察结果

两种载药胶束在不同释放环境中累积释放曲线如图5所示，120h内，PP-DAP胶束在PH5.5和PH7.4中的累积释放率均比GPP/PP-DAP高，能释放80％左右，而GPP/PP-DAP胶束在两种环境中120h内的累积释放率只有70％左右。这可能是大分子化合物GA的引入改变了胶束外壳或内核的结构有关。对比两种释放介质，两种载药胶束在正常环境(PH＝7.4)中的释放速度和累积释放量均比在模拟肿瘤环境(PH＝5.5)中高，在24h内，两种载药胶束在正常环境中已达到释放平衡，而在同样时间内，在模拟肿瘤环境中释放曲线还呈缓慢上升趋势。表明该剂型能使药物在弱酸性环境中实现缓慢释放的优点，延长药物作用时间，适合肿瘤模型给药。

2.4.4溶血试验

2％红细胞混悬液的配制：SD大鼠4只，用10％水合氯醛按0.3毫升每100g麻醉剂量进行麻醉，含有肝素钠的取血管腹主动脉取血液若干毫升，加入约0.5倍血液量的生理盐水，轻轻混匀后，4℃，3600rpm离心5min，弃去上清液，将沉淀的红细胞再用生理盐水按上述方法洗涤2～3次，直至上清液没有红色为止。轻柔吸取末次离心后离心管底部红细胞1毫升，加入生理盐水稀释定容至50毫升，即得2％红细胞混悬液。

分别精密称取两种载药胶束冻干粉一定量，复溶于一定体积的生理盐水中使其浓度均为5mg/mL。取八支已编号的10毫升EP管，分别加入2.5mL 2％红细胞混悬液，将西瑞香素载药胶束生理盐水分散液(5mg/mL)0.25mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL加入1-6号EP管，并用生理盐水将EP管中液体的体积补齐至5mL。7号管中加入2.5mL不溶血的生理盐水作为阴性对照，8号管中加入2.5mL全溶血的Triton X-100溶液作为阳性对照。分别小心地将8只EP管中的液体混勾，随后将EP管放入37℃烘箱中孵育2h后观察是否有溶血现象，将孵育后的液体离心(转速＝3600r/min，时间＝5min)，取各EP管中的上清液200μL于96孔板中，分别平行3个复孔，采用全波长酶标仪检测540nm处的OD值，将其带入下面的公式计算溶血率。

溶血试验考察结果：

两种载药胶束的溶血试验结果见图6。从图6可知，剂型组和生理盐水组在2h内未发生明显的溶血现象，而阳性组(Triton X-100)明显出现溶血。由表可知，PP-DAP和GPP/PP-DAP聚合物胶束的溶血毒性同载药聚合物胶束浓度呈正相关。在低浓度(0.25、0.5mg/mL)条件下，PP-DAP的溶血率高于GPP/PP-DAP，此后从1mg/mL直到2.5mg/mL，GPP/PP-DAP的溶血率均高于/PP-DAP，这可能和GA的引入有关，当取代度较高时，一部分甘草次酸能够暴露在聚合物表面从而与红细胞的细胞膜成分发生相互融合从而导致了红细胞的破裂。在所有的实验设计浓度下，PP-DAP和GPP/PP-DAP聚合物胶束的溶血率均未高于5％，说明两种载药胶束均满足静脉注射给药条件。

结论：研究证明，10％甘草次酸配体能够产生良好的肿瘤靶向作用[56]。因此，用10％GA-PEG-PLA嵌段共聚物和90％PEG-PLA嵌段共聚物制备载西瑞香素聚合物胶束。预实验时曾试图增大GA-PEG-PLA嵌段共聚物的比例，结果发现胶束粒径过大，已超过200nm，最后还是参照文献原始比例投料。

本章对两种载药胶束进行理化性质表征，考察结果表明，两种胶束形态均呈类球状，表面圆润规整，大小较均匀。PP-DAP纳米胶束粒径分布集中在130nm左右，电位-12mV左右；GPP/PP-DAP纳米胶束的粒径分布集中在150nm左右，电位-14mV左右，冻干后粒径均稍有降低，冻干前后电位变化不大。两种载药胶束在常温(约25℃)和4℃下一个月内均较稳定，随着放置时间增加，粒径和电位绝对值有缓慢增大趋势，但是变化范围较小。

在体外释放实验中，两种载药胶束在正常环境(PH＝7.4)中的释放速度和累积释放量均比在模拟肿瘤环境(PH＝5.5)中高，表明该剂型能使药物在弱酸性环境中实现缓慢释放的优点，延长药物作用时间，适合肿瘤模型给药，且PP-DAP和GPP/PP-DAP聚合物胶束的溶血率均未高于5％，说明两种载药胶束均满足静脉注射给药条件。

3载药胶束的细胞摄取和体外抗肿瘤活性研究

主要对载药胶束进行体外细胞评价研究，采用MTT法从细胞水平上考察了GA-PEG-PLA/PEG-PLA和PEG-PLA空白胶束对LO2和HepG 2细胞的毒性，以此考察胶束材料的安全性。采用CCK 8法对比考察了游离西瑞香素以及西瑞香素载药胶束对HepG 2肝癌细胞的增殖影响。

香豆素6(Cou6)是一种荧光转化率较高、性能较稳定的脂溶性荧光染料。近年来，Cou6常被用作进行给药系统的体内追踪、细胞摄取和组织分布的荧光探针。为了进一步考察两种纳米载药胶束制剂能够被癌细胞摄取，本实验采用倒置荧光显微镜来观察载香豆素胶束与人的肝癌细胞作用一定时间点后载药胶束在细胞内的一个状况。

3.1试剂和仪器

3.1.1试剂

3.1.2仪器

3.2实验方法

3.2.1细胞培养

(1)细胞复苏：快速从-80℃冰箱取出细胞(LO2、HepG 2)，置于37℃恒温水浴锅来回晃动(约1～2min)，待将要完全融化时加入适量完全培养基DMEM(含10％FBS+1％双抗)，4℃，1000r/min离心5min，小心吸弃上清，加入5mL完全培养基轻轻吹打混悬，转入T25培养瓶于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

(2)细胞传代：待细胞生长至80％～90％时即可进行传代。弃旧培养基，加入预热PBS清洗细胞2～3次，0.25％胰酶消化，其中HepG 2消化5～6min(预热2min，消化3min)，LO2消化3～4min(预热2min，消化1～2min)，显微镜下观察到细胞变圆时，加入完全培养基终止消化，轻柔吹打细胞，使细胞脱落成单细胞悬液状态，细胞悬液于4℃，1000r/min离心5min，弃上清去除胰酶，加入新鲜完全培养基，根据细胞数量进行1：2或1：3传代培养。

3.2.2载药胶束的冻干

直接将载药胶束冻干发现其复溶效果较差，且冻干后的胶束室温放置稍久会有粘性，不方便给药溶液的配制。冻干保护剂能够降低纳米胶束的冰点，从而减少胶束冻结和脱水过程中胶束形态及其它性质发生变化。参考文献，筛选了蔗糖、PEG 600、α-乳糖、D-甘露醇以及普朗尼克Pluronic F-68几种冻干保护剂，通过观察冻干后胶束状态以及测定粒径，载药量和包封率，本课题最终选用普朗尼克Pluronic F-68作为冻干保护剂。冻干保护剂与载药胶束充分混合后于-80℃冰箱中预冻12h，置真空冷冻干燥机中干燥36h，得到冻干后的载药胶束呈白色疏松粉末状物质。

3.2.3自主配液

(1)药物母液的配制：

西瑞香素溶液：精密称取西瑞香素1mg，加入20μL DMSO溶解后，加入培养基定容至10mL，得浓度为100μg/mL的西瑞香素母液，用前用培养基稀释成相应浓度即可。

香豆素6溶液：精密称取香豆素6 1mg，加入20μlDMSO溶解后，加入PBS定容至100mL，得浓度为10μg/mL的香豆素6母液，用前用PBS稀释成相应浓度即可。所有过程尽量避光操作。

空白胶束和载药胶束：取冻干后的胶束粉末，直接加入培养基溶解，两种空白胶束均按1mg/mL配制母液，两种载药胶束按100μg/mL配制母液。

(2)DMEM完全培养液：90％DMEM高糖培养基+10％FBS+1％双抗(青霉素/链霉素)。保存于4℃冰箱。

(3)细胞冻存液：70％DMEM培养液+20％FBS+10％DMSO。

3.3载药胶束体外抗肿瘤活性研究

3.3.1载药胶束的制备

PP-DAP和GPP/PP-DAP聚合物胶束的制备方法同第三章和第四章中PP-DAP和GPP/PP-DAP的制备工艺。

3.3.2细胞给药

收集对数生长期的HepG 2细胞，消化制成单细胞悬液，以每孔4～5×10⁴个/mL接种于96孔板，每孔100μL(边缘孔加200μL的PBS，以防止水份蒸发过快影响实验结果)，种板24h左右，显微镜观察细胞贴壁且状态良好，弃上清，加入含不同浓度药物培养液溶液100μL，游离西瑞香素溶液、载西瑞香素胶束(PP-DAP和GPP/PP-DAP)给药浓度均设置为0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80μg/mL 8个浓度梯度，同时设空白对照组(两种载药胶束组加入等体积培养液，游离西瑞香素组加入含与给药组等量DMSO的培养液)每组设5个复孔。37℃、5％C0₂培养箱中培养24h、48h、72h，给药时间截止，避光加入相当于孔内培养液量10％的CCK8试剂(10μL)，继续置于培养箱中培养2h左右，于震荡仪上轻微震荡10min后，酶标仪测量OD值，波长设置为650nm，计算细胞抑制率和半数抑制浓度IC₅₀值。

细胞抑制率＝(1-OD值_实验组/OD值_对照组)×100％

两种载药胶束对HepG 2细胞增殖的影响：

根据预实验结果，本实验设置了三个时间点观察载药胶束以及游离西瑞香素对HepG 2细胞增殖的影响，游离西瑞香素以及两种载药胶束对HepG 2细胞增殖的影响结果见表22。由表22可知，无论是西瑞香素还是西瑞香素胶束，对HepG 2细胞都有一定的增殖抑制作用，表明西瑞香素本身具有肝癌细胞毒性作用。给药24h后，两种载药胶束组与游离药物组的细胞存活率相差不大，这可能和药物没有完全释放有关。当延长给药时间为48h和72h后，能看出载药胶束组的细胞存活率低于游离药物组，其中GPP/PP-DAP组效果最好，72h后三个组(游离DAP、PP-DAP、GPP/PP-DAP)的细胞存活率分别为为16.67％、13.33％和9.19％左右。此外，从表中可以得到，HepG2细胞对游离DAP溶液有着明显的耐药现象，而剂型组PP-DAP和GPP/PP-DAP可以显著提高对HepG2的细胞增殖抑制作用，这表明PEG-PLA和GA-PEG-PLA/PEG0PLA载体材料可保护DAP免于被外排泵排出胞外，具有良好的生物相容性，增强了HepG 2细胞对西瑞香素的摄取，增强了药物对细胞的毒性作用。

表22载药胶束及游离西瑞香素对HepG 2细胞增殖的影响

通过对细胞毒性数据进行SPSS数据分析，得到给药不同时间后游离药物组和不同制剂组下的细胞毒性IC50，结果见表23。各组的IC50值均成时间依赖性。

表23 HepG 2细胞24、48、72h IC₅₀值

3.3.3两种载药胶束对HepG 2细胞形态的影响

不同浓度的游离西瑞香素以及两种载药胶束(PP-DAP、GPP/PP-DAP)作用于HepG 2细胞72h后，正常组细胞形态及状态好，细胞呈圆形或多边形，细胞间相互连接，贴壁较紧，死细胞很少。各给药组低浓度(2.5μg/mL)下，除了有少量死细胞漂浮，细胞形态没有明显变化。浓度为中剂量(10μg/mL)时，细胞间连接较弱，甚至呈单个散在生长，细胞体积萎缩，漂浮死细胞增多，细胞数量减少等。浓度为高剂量(40μg/mL)时，各给药组细胞形态发生明显变化，细胞核破裂，细胞核与细胞质分离，细胞几乎全部死亡，显微镜下细胞呈“污染”状。在同一浓度下，游离药物组，两种剂型组之间的细胞状态没有明显差别。

3.4载药胶束对HepG 2细胞摄取试验研究

3.4.1载香豆素6胶束的制备

以PEG-PLA和GA-PEG-PLA/PEG-PLA为载体，分别制备载香豆素6聚合物胶束。两种载香豆素6胶束的制备工艺与载药胶束PP-DAP和GPP/PP-DAP的制备工艺相似，其中将西瑞香素替换成香豆素6即可，避光环境进行，其它操作完全一样。

3.4.2细胞给药

将HepG 2细胞以3～4×10⁴个/mL种于24孔板上，每孔500μL，种板24h左右，每孔按香豆素6浓度为1μg/mL分别加入游离香豆素6溶液，两种载香豆素6胶束溶液，于培养箱分别孵育1、3、6、12、24h后，用37℃预温的PBS清洗细胞3次，每次10min，细胞摄取情况由IFM观察。

载药胶束对HepG 2细胞摄取试验研究结果：

香豆素6本身在倒置荧光显微镜下显绿色的光，因此可通过倒置荧光显微镜观察不同类型的药物溶液的细胞摄取情况。将HepG 2细胞和游离香豆素6以及两种载香豆素6胶束分别共培养1h、3h、6h、12h和24h后，所有组别的香豆素6摄取量即荧光强度都随时间延长而增强，说明游离及制剂组的香豆素6摄取均具有时间依赖性，在1h时，所有组的荧光强度都很弱，6h时，所有组的荧光强度达到最强，此后开始减弱。在所有的时间点，制剂组的荧光都强于游离药物组，说明制剂组更容易被细胞摄取。在两种载药胶束组中，1h、3h、6h时两组荧光强度差不多，但是时间延长至12h时，以GPP/PP为载体载香豆素6比单纯的PP载体载香豆素6能更好的被摄取，表明甘草次酸能使药物较长时间作用于肿瘤细胞，这可能和细胞上有相应甘草次酸抗体有关，由上述结果可以得出甘草次酸具有肝肿瘤靶向性作用。

3.5细胞形态观察

细胞给药24h、48h、72h后，于倒置荧光显微镜下对不同浓度组细胞进行观察并拍照。

3.6统计学处理

采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析，计量资料采用均值±S表示，组间两两比较采用最小显著差异法，多组数据比较用单因素方差分析，P<0.05表示有统计学意义，P<0.01表示所检验的差别有非常显著性意义。采用Graphpad prism 8进行图形绘制。

结论通过将具有荧光的香豆素6按照载药胶束的制备方法分别包裹在载体材料PEG-PLA和GA-PEG-PLA/PEG-PLA，使其和人的肝癌细胞HepG 2作用，证明了载药胶束能够被癌细胞所摄取，少数还可以进入到细胞核内，游离香豆素6虽然也能被摄取，但是同等剂量和同时间观察，其荧光作用非常弱。其次用MTT检测法考察了两种空白胶束对LO2和Hep G-2细胞的增殖抑制情况。结果显示在浓度范围为15.625μg/mL～500μg/mL内空白胶束对两种癌细胞的抑制作用非常小。说明该载体材料较安全。

在对比两种纳米载药胶束制剂和裸药对Hep G-2毒性考察时发现，在含有相同的药物浓度时游离西瑞香素比载药胶束组对癌细胞的抑制率低，剂型组中GPP/PP-DAP比PP-DAP抑制效果稍好，且游离药物组和载药胶束组对癌细胞的抑制率均呈现浓度和时间依赖性。

4载DAP胶束的体内分布及初步药效学研究

人类肝癌疾病的基础研究多借助动物模型。目前，在小鼠肝脏建立起来的原位肿瘤模型是最接近人类肝癌的实验模型，是肝癌基础和临床研究的理想动物模型[26]。本章以KM小鼠作为动物模型，采用H22细胞进行小鼠肝原位注射建立肿瘤模型。将DIR近红外染料按照载药胶束的制备工艺包裹在PEG-PLA和GA-PEG-PLA/PEG-PLA内，载有DIR的胶束通过尾静脉和腹腔注射方式给药，采用小动物成像系统追踪荧光，观察其体内分布情况。采用同样方法建立小鼠肝原位肿瘤模型，采用腹腔注射方式给游离药物和两种载药胶束，通过观察小鼠状态，测定相关因子水平和肝HE染色评价载药胶束的疗效。

4.1材料和仪器

4.1.1实验动物

SPF级昆明种小鼠购自湖南省长沙市天勤生物技术有限公司，动物合格证号：SCXK(湘)

2019-0014，体重18～22g，雌雄各半。饲养于室内保持12h光照，12h避光循环饲养，给予标准饲料和饮用水，控制室内温度为25.0±1.0℃、相对湿度在(50.0±10.0)％左右。

4.1.2实验仪器

4.2实验方法：

4.2.1建立H22小鼠肝癌原位移植模型

(1)细胞株腹腔接种

取处于对数生长期的Hep G 2细胞，用胰酶消化后收集细胞，吸取细胞悬液至无菌生理盐水中混匀，1000r/min，离心5min，弃去上清，用无菌生理盐水重悬细胞，调节细胞浓度至1×10⁷/mL。碘伏消毒小鼠腹部皮肤，采用1mL BD注射器抽取0.2mL细胞悬液腹腔注射小鼠，10d左右腹水明显。无菌抽取腹水进行传代，采用第三代传代细胞进行肝脏注射。

(2)建立小鼠肝癌原位肝肿瘤模型的方法

无菌抽取腹腔接种H22肝癌细胞株的小鼠腹水，加入PBS液混匀，1000rpm/min，离心5min，弃去上清，反复PBS洗涤、离心2～3次。无菌生理盐水重悬细胞，显微镜下细胞计数，经台盼蓝染色法检测细胞存活率＞95％，调节细胞浓度至2.5～3×10⁷/mL，置于冰上待用。采用5％水合氯醛(0.05mL/10g)小鼠腹腔注射进行麻醉，仰卧去毛，固定于实验板上，碘伏消毒皮肤，剑突下沿腹中线纵行切口，逐层剪开皮肤和腹膜，充分暴露肝左叶。用胰岛素微量注射器抽取20μL H22细胞悬液，倾斜刺入肝脏实质约0.5cm缓慢注入细胞悬液，停留片刻，注射完毕拔出针头，立即用生理盐水浸泡过的无菌棉签轻压针孔至肝脏表面不再渗血，用手术缝合线逐层关腹。术后继续饲养，自由进食、进水。

(3)造模天数的确定

根据实验要求和造模方法的选择，小鼠肝癌原位模型造模天数各有不同，参考文献，有人采用肝癌细胞原位注射造模一周即可实验，因此小鼠接种癌细胞后，于第3、5、7、10天随机解剖小鼠，取肝脏观察癌细胞生长情况，确定建模成功。

小鼠肝原位接种癌细胞后第3、5、7、10天肝脏解剖结果。造模第三天肝脏颜色红润，除了注射部位有少量实体瘤长出，其它没有明显变化，第五天实体瘤体积稍增大，第七天可见肝脏颜色变浅，细看表面有白色点状结节，实体瘤继续增大，第十天肝脏已发生明显病变，表面白色结节状明显，实体瘤体积增大明显。因为癌症病变后期药物已无法有效改善其病情恶化，为了有效发挥药效，因此本实验确定造模天数为7天，这与文献描述一致。

4.2.2载DIR胶束在模型鼠内的体内分布

4.2.2.1溶液的制备与配制

(1)载DIR胶束的制备：两种载DIR胶束(PEG-PLA-DIR；PP-DIR，GA-PEG-PLA/PEG-PLA-DIR；GPP/PP-DIR)的制备工艺与载药胶束的制备工艺相似，其中将西瑞香素替换成DIR即可。注意所有过程避光操作。

(2)游离DIR溶液的配制(F-DIR)：称取少量DIR固体粉末，按比例加入溶剂溶解(DMSO：丙三醇：生理盐水＝0.02：1：1)，所有过程避光操作。

4.2.2.2载DIR胶束在原位肝癌模型鼠的分布

预实验观察到原位注射肝癌细胞造肝癌模型会有少量癌细胞扩散到腹腔，形成带有腹水癌细胞的肝癌小鼠，因此本实验设计了两种给药方式，尾静脉和腹腔注射给药，观察这两种给药方式药物在体内的分布情况。同时，为了更好的观察药物随时间在动物体内的分布情况变化，本实验进行了小鼠活体和小鼠离体器官的考察。实验操作具体步骤如下：

取36只荷瘤小鼠，随机分为三组，PP-DIR组、GPP/PP-DIR组和游离DIR溶液，每组12只，其中各组有6只造模小鼠为尾静脉注射给药，剩下6只为腹腔注射给药，给药剂量均为0.5μg/g。给药后于1、3、6、12、24、48h，分别脱颈处死尾静脉注射和腹腔注射各1只，取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑组织，生理盐水洗涤(操作过程尽量避光)，用黑色卡纸摆放好各脏器，置于活体成像仪的暗箱平台，拍摄小鼠离体荧光成像。小动物IVIS成像系统参数设置激发波长为750nm，发射波长为782nm，曝光时间为1s，其余参数均为默认参数。

另取6只荷瘤小鼠，随机分为三组，PP-DIR组、GPP/PP-DIR组和游离DIR溶液，每组2只，其中各组有1只造模小鼠为尾静脉注射给药，剩下1只为腹腔注射给药，给药剂量均为0.5μg/g。给药后于1、3、6、12、24、48h用异氟烷(密度2％～3％)麻醉小鼠，立即置于活体成像仪的暗箱平台，拍摄小鼠离体荧光成像。设置激发波长为750nm，发射波长为782nm，曝光时间为0.5s，其余参数均为默认参数。

腹腔注射途径给药后DIR体内分布结果：游离DIR和两种载DIR胶束经腹腔注射后荧光分布结果，注射后1h，所有给药组的小鼠腹腔荧光强度较强且没有分散开来，各组之间没有明显差别。随着时间推移，可以明显看到各组荧光强度发生了变化，游离DIR组荧光逐渐减弱，从1h至6h，荧光主要集中在注射附近，肝脏分布不明显，12h时肝脏有少量分布，随后荧光减弱，48h后几乎看不到荧光。两种胶束组(PP-DIR和GPP/PP-DIR)1h至6h荧光集中分布在整个腹腔，由于荧光较强，未见明显脏器分布情况。6h后PP-DIR荧光开始分散，12h时明显看见荧光主要分布在肝脏区域和腹腔下部，48h后荧光减弱，但肝脏依然有分布。GPP/PP-DIR 12h后荧光才开始分散，24h时能看到明显的肝脏分布，且主要集中在肝脏区域，其它位置几乎没有分布，48h后同样肝脏有少量分布。

小鼠离体组织各脏器荧光分布情况，给药后3h内，游离DIR组和载DIR胶束组各脏器的荧光分布差不多，主要集中在肝。3h后各组荧光开始增强，均在12h时达到最大，其中胶束组荧光明显强于游离组。随后各组荧光减弱，游离DIR组24h和48h几乎检测不到荧光。GPP/PP-DIR组在24h时除了肝脏有分布，肺上也有较强荧光分布。

如上现象推测可能因为游离DIR配制时(DMSO：丙三醇：生理盐水＝0.02：1：1)虽较溶解完全，但腹腔注射后被腹腔液稀释，出现部分DIR溶解不完全，未溶解部分不能被很好的吸收利用而停留在注射部位。而两种剂型组的DIR是均一胶束溶液，粒径较小，能被吸收代谢，正常分布在小鼠体内。因为肿瘤内部富含新生血管，基于EPR效应，使载DIR胶束被动靶向到肿瘤处蓄积。此外，GPP/PP-DAP因为含有甘草次酸，而肝肿瘤处GA受体增多，从而使GPP/PP-DAP通过被动和主动双重作用靶向到肝肿瘤区域。

尾静脉注射途径给药后DIR体内分布结果游离DIR和两种载DIR胶束经尾静脉注射后能马上分布到肝脏。6h时游离DIR荧光在肝脏分布最强，此后开始减弱，48h时间截止几乎没有荧光分布。而两种胶束组均在12h时在肝脏达到最强荧光，两组荧光强度没有显著差异，48h时两胶束组小鼠肝脏处仍有荧光分布，GPP/PP-DIR组的荧光强于PP-DIR组。

在离体脏器荧光分布中，注射后3h内，可以看到游离DIR能在肝脏和肺上都有分布，而两剂型组在肺上没有分布，这可能和粒径以及胶束性质有关。6h时游离DIR在肝脏处荧光达到最强，此后减弱。两种载DIR胶束组荧光在肝脏的分布从1h至48h几乎没有变化，可能与PEG能延长药物的体内循环时间有关。

4.2.3载药胶束体内药效学研究

4.2.3.1实验期间一般情况的观察

(1)腹水小鼠情况观察

小鼠腹腔注射H22癌细胞后，第三天小鼠饮水量正常，饮食量出现稍减退现象，腹部微鼓，活动量正常，第六天小鼠腹腔逐渐变大，8天后开始毛发枯燥，腹腔明显变大，出现活动受限，饮食量和饮水量明显减少，个别鼠开始便黄色浓稠液体。

(2)原位肝癌模型小鼠情况观察

取小鼠腹腔细胞传代三次的腹水，离心取细胞进行肝原位注射，于造模第八天开始给药。给药时发现所有造模小鼠腹部皮肤变硬，腹腔注射药物针头不好穿刺皮肤，给药第三天开始，模型组，所有给药组的低剂量组小鼠开始出现饮食量饮水量减退现象，毛发枯燥，偶有鼠腹部开始微鼓起，可能是注射时细胞逃串到腹腔所致。继续给药第五天，除模型组外，其余组小鼠腹部皮肤开始变软，除正常对照组，其它组小鼠的食欲依然减退，阳性组和各药物高剂量组小鼠稍较其它给药组活泼，游离药物低、中剂量组和PP-DAP低剂量组小鼠出现死亡，给药第七天，除个别腹水型小鼠，两种剂型组的中、高剂量和阳性药组小鼠精神开始恢复，毛发较之前光泽，饮食量和饮水量开始回升。实验期间动物死亡情况和逃串到腹腔致腹水型小鼠情况见表24。

表24实验期间小鼠死亡和腹水逃逸情况

4.3.2.2实验期间一般情况的观察

(1)给药期间小鼠的体重变化

给药期间每天观察小鼠状态并称量每只小鼠体重，各浓度组小鼠体重变化如图7所示。

从图7可知，给药期间除游离药物高剂量组和阳性组(CTX)先缓慢增长后下降之外，其余所有小鼠的体重均成增长趋势，各组之间增长趋势没有明显差异。CTX具有明显的抑制多种肿瘤增长的活性，但是它毒副作用较为明显。很多文献表明，在抗肿瘤实验中，环磷酰胺均作为阳性药，它能使小鼠体重减轻，本实验的环磷酰胺阳性药组体重稍减轻，与文献一致。游离药物因为难溶，给药时是混悬状态，高剂量注射时吸收代谢较慢，毒性大于剂型组，因此可能是长时间给药小鼠体重减轻的原因。

(2)小鼠脏器指数

给药结束后，小鼠脱颈处死并解剖，观察各脏器的形状、大小和颜色并称重，对应上述方法下公式计算脏器指数。结果如表25所示。

与空白组比较。各实验组的心指数和肺指数没有显著性差异。模型组肝指数增大，具有极显著性意义(P＜0.01)，表明造模成功。PP-DAP和GPP/PP-DAP的高剂量组没有显著性差异(P＞0.05)，可能与高剂量疗效好有关，也可能与造模差异有关。此外，所有组的胸腺指数与空白组比较，均减小，且都具有极显著性意义，其中模型组小于给药组。原因可能与造模和药物毒性损伤免疫器官有关。模型组，游离药物和两种剂型的低中剂量组的脾指数大于空白组(P＜0.01或P＜0.05，这与解剖时观察到造模后小鼠脾肿大一致。各组的肾指数与空白组相比有变化，但是没有呈规律变化。与模型组比较，各实验组的心指数和肺指数没有变化。阳性组，PP-DAP和GPP/PP-DAP中高剂量组肝指数减小，其中阳性组和两剂型组的高剂量组具有极显著性差异(P＜0.01)。此外，所有组的脾指数均较模型组有降低趋势，阳性组和游离药物中高剂量组、PP-DAP中高剂量组、GPP/PP-DAP高剂量组胸腺指数也较模型组低。各组的肾指数与模型组相比变化不规律。

表25各给药组小鼠脏器指数情况(n＝6)

注：各组与空白组比较，P^*＜0.05，P^**＜0.01；各与模型组比较，P^#＜0.05，P^##＜0.01

4.3.3西瑞香素对原位肝癌小鼠血清中ALT、AST、TNF-α、IL-2含量的影响

采用ELISA法检测游离西瑞香素及载药胶束干预后H22原位肝癌小鼠血清中ALT、AST、TNF-α、IL-2含量变化，实验结果见表26、27。

由表26可知。各组与空白组比较，模型组中肝功能因子ALT和AST均升高，且具有极显著性意义(P＜0.01)，表明造模非常成功。游离西瑞香素低中高剂量组和两种载药胶束的低中剂量组中ALT和AST的含量也均高于空白组，下降不明显，GPP/PP-DAP高剂量组和阳性组ALT和AST含量显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。表明阳性组和GPP/PP-DAP高剂量组能调整肝功能受损程度，趋于正常。与模型组比较，两载药胶束组的各剂量组和阳性组均能不同程度降低ALT和AST的含量。游离西瑞香素中剂量组ALT和AST含量降低，低剂量组和高剂量组药效均不明显，猜测原因可能是低剂量药量少，起效慢，而高剂量虽然药量大，但是由于游离西瑞香素是混悬状态，大量药物进入腹腔不能及时被吸收，反而加重了腹腔的负担，加重病情恶化。而剂型组中高剂量组药量虽大，但药物被包裹在材料内，呈纳米小粒子状态，能被机体吸收，从而发挥药效。

表26各组小鼠血清中肝功能因子ALT、AST的含量(n＝6)

注：与空白组比较，P*＜0.05，P**＜0.01；与模型组比较，P#＜0.05，P##＜0.01

表27可知，各组小鼠血清中免疫因子TNF-α、IL-2的含量。由表可知，与空白组比较，模型组的TNF-α的含量显著升高，IL-2含量显著减低(P＜0.01)，表明造模成功。此外，各组TNF-α的含量均显著高于空白组，阳性组，游离药物中高剂量组和两载药胶束低中高剂量组的IL-2的含量都不同程度高于空白组。与模型组比较，除游离药物低剂量组，其它给药组的TNF-α含量均显著降低(P＜0.01)，IL-2含量均显著升高(P＜0.01)，表明西瑞香素能调整肝癌小鼠血清中免疫因子TNF-α和IL-2的含量，改善模型鼠的症状。尤其是对IL-2含量的影响较大，不管是游离西瑞香素还是两西瑞香素载药胶束，IL-2的含量随给药浓度增大而升高，其中中高剂量组比阳性组含量还高。

表27各组小鼠血清中免疫因子TNF-α、IL-2的含量(n＝6)

注：与空白组比较，P^*＜0.05，P^**＜0.01；与模型组比较，P^#＜0.05，P^##＜0.01。

4.3.3小鼠肝脏组织病理学检查结果

(1)小鼠肝脏眼观检查结果

小鼠解剖，除对照组外，西瑞香素各剂量组、模型组和环磷酰胺组小鼠的肝脏均有大小不同肿瘤，说明原位移植瘤模型的建立是成功的。肉眼观察，游离西瑞香素和两种载西瑞香素胶束低剂量组的肝肿瘤情况与模型组比较没有显著改变，环磷酰胺组以及PP-DAP和GPP/PP-DAP高剂量组肝脏上肿瘤面积明显小于模型组。

(2)小鼠肝脏HE染色结果

各组小鼠肝脏HE染色结果，光镜下观察，空白组肝细胞大小较均匀，排列整齐，核仁呈圆形，清晰分布，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，胞质均匀，未见炎细胞浸润，整个视野未见明显空隙。与空白相比，模型组的细胞核与胞质分裂，且有部分核仁深染，形状多样，见炎细胞浸润，有结节较大。与模型组相比，游离西瑞香素高剂量组、PP-DAP高剂量组以GPP/PP-DAP中高剂量组和阳性组，肝细胞排列较规则，细胞核和细胞质分裂程度减轻，视野下剂型高剂量组较游离高剂量组细胞状态好，与空白组肝组织较接近。游离药物中剂量组，PP-DAP中剂量组，GPP/PP-DAP低剂量肝组织较模型组有不同程度的改善，但是仍有炎性细胞浸润，核质核仁分裂明显。游离药物和PP-DAP低剂量组与模型组比较，改善效果不理想。

结论：以KM小鼠作为动物模型，采用H22细胞进行小鼠肝原位注射建立肿瘤模型。体内分布试验表明以PEG-PLA和GA-PEG-PLA/PEG-PLA为材料包裹药物能有效靶向到肝脏，其中以GA-PEG-PLA/PEG-PLA为材料效果更佳。

ALT(谷丙转氨酶)、AST(谷草转氨酶)是临床常用判断肝细胞损伤程度的指标，肝病肝损伤时ALT和AST均可见升高。所以，本研究选取ALT和AST两个指标，共同评价肝癌肝损伤程度，采用环磷酰胺作为阳性药物，评价游离西瑞香素及载西瑞香素胶束抗肝肿瘤的药效。结果表明，西瑞香素游离药物中剂量及PP-DAP和GPP-DAP低中高剂量干预后肝癌大鼠血清中ALT、AST的含量均不同程度的降低，说明西瑞香素具有很好的抗肝肿瘤作用，尤其载药胶束效果更佳。

TNF-a是一种具有直接抗肿瘤作用的多功能细胞因子，正常情况下，TNF-a浓度较低，但是炎症、感染和外来刺激均引起TNF-a的表达和释放。本研究中模型组中TNF-a的含量较正常组显著增高，而所有给药组的TNF-a的含量都有不同程度的降低，说明西瑞香素能调整肝癌小鼠血清中免疫因子TNF-a的含量，改善模型鼠的症状。研究表明肝癌患者血清中IL-2的水平低于健康人，说明IL-2参与肝癌的发生和发展。本研究中不管是游离西瑞香素还是两西瑞香素载药胶束，IL-2的含量随给药浓度增大而升高，其中中高剂量组比阳性组含量还高。

值得关心的是，通过对给药组及对照组中血清细胞因子及小鼠胸腺和脾脏器指数表明，分析阳性药(CTX)组对免疫器官有毒性作用，而载西瑞香素胶束组能提高荷瘤小鼠的免疫力，从而可以推知，西瑞香素对H22腹水瘤形成的肝原位荷瘤小鼠的抗肿瘤作用与其能促进免疫因子及抗肿瘤因子增加有关。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。