阅读说明：本技术 一种用于特异性检测肼的近红外荧光化合物及制备方法 (Near-infrared fluorescent compound for specifically detecting hydrazine and preparation method thereof ) 是由 王毅 朱美庆 赵宗元 凡福港 吴祥为 花日茂 于 2020-07-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种新型特异性识别肼的近红外荧光化合物,(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸,其可以特异性检测生物体内的肼；该近红外荧光化合物制备过程简单,原料易得,成本低廉,结构稳定,并且具有较好的细胞膜通透性以及较低的细胞毒性,可进入活细胞和动物组织中并与外源肼发生反应,产生可肉眼分辨的强烈红色荧光；通过紫外吸收和荧光分光光度法分析得出该近红外荧光化合物可以在各种干扰物下对肼有着优越的选择性,对常见生物分子有着很强的抗干扰能力；不仅可对外源性肼选择性识别,而且能在各种活细胞的生长环境下高灵敏度的定量检测肼,并成功应用于活细胞及斑马鱼成像中。(The invention discloses a novel near-infrared fluorescent compound for specifically recognizing hydrazine, (E) -2- (2- (3- (dicyanomethylene) -5, 5-dimethylcyclohex-1-en-1-yl) vinyl) -5- (diethylamino) phenyl 4-bromobutyric acid, which can specifically detect hydrazine in an organism; the near-infrared fluorescent compound has the advantages of simple preparation process, easily obtained raw materials, low cost, stable structure, better cell membrane permeability and lower cytotoxicity, can enter living cells and animal tissues and react with exogenous hydrazine to generate strong red fluorescence which can be distinguished by naked eyes; the near-infrared fluorescent compound is analyzed and obtained through ultraviolet absorption and a fluorescence spectrophotometry, has excellent selectivity on hydrazine under various interferents, and has strong anti-interference capability on common biomolecules; not only can selectively identify exogenous hydrazine, but also can quantitatively detect hydrazine with high sensitivity in various living cell growth environments, and can be successfully applied to living cells and zebra fish imaging.)

一种用于特异性检测肼的近红外荧光化合物及制备方法

技术领域

本发明属于有机小分子荧光探针技术领域，具体涉及以(E)-2-(3-(4-(二乙氨基)-2-羟基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯-1-基)丙二腈为荧光母体的特异性检测环境污染物肼的荧光化学化合物及其应用。

背景技术

环境中的无机污染物来源广泛，类型复杂，其中大多数会进入人体。当这些污染物的在环境中的浓度超过安全阈值时，可能会对环境和人类健康构成威胁。肼(N₂H₄)是一种具有一定还原性的重要无机化合物，已广泛应用于农药生产，航空航天，化工等领域。不仅如此，肼也是一种易挥发且可能致癌的环境污染物。由于其广泛的应用和较好的水溶性，肼在环境中会产生一定程度的污染，能够对人体产生毒害作用。因此，迫切需要建立一种可靠、准确和高效的分析方法来检测环境中的肼。

目前已有很多检测肼的方法，例如高效液相色谱(HPLC)，气相色谱(GC)，电化学分析(EA)和毛细管电泳(CE)等。但是，这些方法存在耗时且操作复杂的缺点。相比之下，荧光探针由于其高特异性，灵敏性和易操作性而吸引了许多研究人员的兴趣。荧光分子探针可与待测分析物反应；因此，微观反应事件可以通过荧光信号可视化。因此，这些特性赋予了荧光探针优异的性能，可用于环境监测、生命科学和疾病诊断。

迄今为止，已经报道了许多用于检测肼的化学传感器。由于肼的亲核性，在检测肼的过程中使用了多种机制，例如Gabriel反应，与醛的加成反应和酯水解反应。其中，肼解反应的应用可以提高检测肼的响应率。典型能够发生肼解反应是以4-溴丁酰基作为识别基团的化学传感器，其主要是以修饰荧光基团上的羟基而形成的，因此，将羟基引入荧光探针母体结构中是较好的思路。

综上，选择(E)-2-(3-(4-(二乙氨基)-2-羟基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯-1-基)丙二腈作为荧光母体结构，并利用4-溴丁酰基母体结构中的羟基进行修饰，猝灭自身的荧光，提高其灵敏度，有望开发出能够特异性识别肼并可应用于细胞和活体组织成像的新型近红外荧光化合物。

发明内容

本发明第一个目的是开发出一种可选择性检测环境污染物肼的近红外荧光化合物，该近红外荧光化合物可在其他分析物干扰下区分肼的存在。

本发明第二个目的是提供一种可特异性检测环境污染物肼的近红外荧光化合物的制备方法。

本发明第三个目的是提供一种可应用于溶液、生物组织及细胞中外源性肼检测的方法。

一种特异性检测肼的近红外荧光化合物为(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸，其分子式为C₂₇H₃₂BrN₃O₂，化学结构式如式(I)所示：

式(I)。

一种特异性检测肼的近红外荧光化合物的制备操作步骤如下：

(1)在氮气保护下，将1.0g(E)-2-(3-(4-(二乙氨基)-2-羟基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯-1-基)丙二腈(DHDM)、1.0mL三乙胺和50mL无水二氯甲烷混合，冰浴降温至0℃；

(2)缓慢滴入0.62mg 4-溴丁酰氯，室温下搅拌反应10-12小时，得到混合物；

(3)将混合物倒入冰水中搅拌，并用二氯甲烷萃取3次，每次萃取用10mL二氯甲烷；

(4)用无水硫酸钠干燥，将有机相浓缩，得到粗产物；用正已烷和乙酸乙酯按体积比3:1配制成洗脱液通过柱色谱法洗脱纯化粗产物，得到1.03g紫黑色产物(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸DCDB，产率为72％。

所述近红外荧光化合物的用于肼特异性的检测。

所述近红外荧光化合物用于溶液体系中肼的检测操作步骤如下：

(1)将所述近红外荧光化合物用缓冲液配制成浓度10μM的工作液，所述缓冲液由体积比为1:1的磷酸缓冲盐溶液(PBS)和二甲基亚砜(DMSO)配制成，缓冲液的pH值为7.4；

(2)取81份3mL浓度10μM的近红外荧光化合物溶液，向其中分别加入120μL浓度为5×10^-5mol/L的待测分析物，待测分析物共27种，每种待测分析物由3个平行单元组成一组，反应得到81份反应物，反应物中分析物最终浓度为200μM，反应完全后分别对81份反应物进行荧光强度测定；

(3)结果表明肼(N₂H₄)能够提高近红外荧光化合物工作液荧光强度；该近红外荧光化合物仅仅可以与肼(N₂H₄)发生荧光增强反应，即所述近红外荧光化合物实现特异性识别肼。

所述近红外荧光化合物用于试纸上肼的检测操作步骤如下：

(1)制作权利要求1所述近红外荧光化合物检测试纸，用二氯甲烷将所述近红外荧光化合物配制成浓度10μM的工作液，再将若干大小形状一致的滤纸浸入所述工作液30分钟，取出滤纸并晾干，得到试纸；

(2)将200μM 27种不同分析物的水溶液，分别滴加到对应的27张试纸上；再放入365nm激发波长的紫外灯下观察；

(3)结果表明仅滴加肼溶液的试纸荧光颜色从无色变为红色，其他分析物并未使试纸发生任何改变，即该检测试纸能够简单快速的检测出环境污染物肼。

所述近红外荧光化合物用于HeLa细胞中肼的检测操作步骤如下：

(1)权利要求1所述近红外荧光化合物工作液的制备

用缓冲液将权利要求1所述近红外荧光化合物配制成浓度20μM的工作液；所述缓冲液中磷酸缓冲盐溶液(PBS)和二甲基亚砜(DMSO)的体积比为1：1，缓冲液的pH值为7.4；

(2)取A、B、C、D四组实验组；

A组为空白对照组：未经任何处理的HeLa细胞，为A组被检测物；

B组为肼处理对照组：用200μL浓度50μM的肼在含5×10⁴个HeLa细胞的孔板中与HeLa细胞孵育30分钟，得到用于检测的B组被检测物；

C组为近红外荧光化合物处理对照组：用200μL浓度20μM的近红外荧光化合物在含5×10⁴个HeLa细胞的孔板中与HeLa细胞孵育30分钟，得到用于检测的C组被检测物；D组为近红外荧光化合物与肼处理组：用200μL浓度20μM近红外荧光化合物预处理含5×10⁴个HeLa细胞的孔板30分钟，然后与200μL浓度50μΜ肼(N₂H₄)一起孵育30分钟，得到用于检测的D组被检测物；

(3)将上述A组被检测物、B组被检测物、C组被检测物和D组被检测物分别放置在激发波长为520nm的荧光显微镜下观察；

(4)荧光成像结果显示A组被检测物、B组被检测物和C组被检测物均未发现有荧光；而D组被检测物显示出明显的红色荧光；荧光成像结果表明权利要求1所述近红外荧光化合物能够进入HeLa细胞并与外源性肼发生反应，产生强烈的红色荧光，实现HeLa细胞中外源性肼的特异性检测。

所述近红外荧光化合物用于斑马鱼中外源肼的检测操作步骤如下：

(1)权利要求1所述近红外荧光化合物工作液的制备

用缓冲液将权利要求1所述近红外荧光化合物配制成浓度为20μM的工作液，所述缓冲液由磷酸缓冲盐溶液(PBS)和二甲基亚砜(DMSO)按体积比1：1配制成，缓冲液的pH值为7.4；

(2)取A、B、C、D四组实验组

A组为空白对照组：未经处理过的3日龄斑马鱼，得到用于检测的A组被检测物；B组为肼处理对照组：用10mL浓度50μM的肼与发育正常的3日龄斑马鱼孵育30分钟，得到用于检测的B组被检测物；

C组为近红外荧光化合物处理对照组：3日龄斑马鱼用10mL浓度20μM的权利要求1所述近红外荧光化合物处理30分钟，得到用于检测的C组被检测物；

D组为近红外荧光化合物与肼处理组：3日龄斑马鱼用10mL浓度50μM的肼孵育30分钟，然后在使用20μM的权利要求1所述近红外荧光化合物处理30分钟，得到用于检测的D组被检测物；

(3)将A组被检测物、B组被检测物、C组被检测物和D组被检测物分别放置在激发波长为520nm的荧光显微镜下观察；

(4)结果显示A组被检测物、B组被检测物和C组被检测物未发现有荧光；而D组被检测物显示出明显的红色荧光；荧光成像结果表明权利要求1所述近红外荧光化合物能够进入斑马鱼体内并与外源性肼发生反应，产生强烈的红色荧光，实现特异性检测外源性肼。

所述近红外荧光化合物用于环境水样中肼的检测操作步骤如下：

(1)权利要求1所述近红外荧光化合物工作液的制备

用缓冲液将权利要求1所述近红外荧光化合物配制成浓度10μM的工作溶液；所述缓冲液由磷酸缓冲盐溶液(PBS)和二甲基亚砜(DMSO)按体积比1:1配制成，缓冲液的pH值为7.4；

(2)待测环境水样的制备

用于环境水样中外源性肼检测时，采集不同区域的环境水样，并将其通过200μm水相滤膜过滤，得到处理后的环境水样；向处理后的环境水样中添加0.1μM、0.5μM和1.0μM的肼

(3)向近红外荧光化合物工作液中添加不同待测环境水样，利用荧光光谱仪对反应液进行检测；

(4)肼的回收率达到87-109％，结果表明近红外荧光化合物工作液能够在环境水样中定量的检测肼的存在。

所述近红外荧光化合物用于污水中肼的检测操作步骤如下：

(1)用缓冲液将权利要求1所述近红外荧光化合物配制成浓度10μM的工作溶液；所述缓冲液由磷酸缓冲盐溶液(PBS)和二甲基亚砜(DMSO)按体积比1:1配制成，缓冲液的pH值为7.4；

(2)用于污水样品中外源性肼检测时，采集不同区域化工厂的污水样品，并将其通过200μm水相滤膜过滤，得到待测污水样品；

(3)利用荧光光谱仪检测近红外荧光化合物工作液和污水样品的反应液；

(4)结果表明权利要求1所述的近红外荧光化合物能够高灵敏的定量检测污水中的肼。本发明的有益技术效果体现在以下方面：

1.本发明所述近红外荧光化合物制作步骤简单，原料易得，易于合成，仅通过一步酰化反应完成该近红外荧光化合物的合成，反应条件温和。

2.本发明所述近红外荧光化合物检测物肼的N原子能够与近红外荧光化合物的4-溴丁酰基上溴原子附近碳原子发生亲核取代反应。然后肼的另一个N原子攻击近红外荧光化合物上羰基碳原子，加成环化裂解生成稳定的六元环环化产物四氢哒嗪(ESI MS[M+H]+，m/z：101.0710)和化合物DHDM(ESI MS[M+H]+，m/z：362.2228)，产生了可识别荧光(图1-2)，因此可排除溶液及生物体中常见分析物的干扰，并且检测限低至39.6nM，相比于多数同类型近红外荧光化合物具有很大的优势；图3的结果显示该近红外荧光化合物对肼有较好的选择性。图4所示，近红外荧光化合物的荧光强度随着肼含量的增加而增加，并且具有良好的线性关系(R²＝0.9967)，即该近红外荧光化合物能够定量检测水环境中的痕量肼。

3.该近红外荧光化合物具有潜在的应用性价值。该近红外荧光化合物能够通过试纸条的制备快速高效分辨水溶液中的肼，且该近红外荧光化合物较好的细胞膜通透性以及较低的细胞毒性使其成功应用于活细胞及斑马鱼体内肼的成像，具有良好的生物应用潜力；(1)该近红外荧光化合物具有潜在的应用价值。见图5，含近红外荧光化合物的试纸条能够快速高效的对水环境中的肼进行特异性识别和初步的定量检测。

(2)该近红外荧光化合物logP＝3.98，属于亲脂性化合物，比较容易进入细胞，具有较好的细胞膜通透性；

(3)该近红外荧光化合物具有较低的细胞毒性。如图6a所示，在浓度为40μM的近红外荧光化合物存在下，HeLa细胞的存活率仍有85％以上，表明该近红外荧光化合物具有较低的细胞毒性；

(4)该近红外荧光化合物具有良好的生物应用潜力。如图6b结果所示，未处理的HeLa细胞在用近红外荧光化合物和肼分别孵育30分钟后显示出显著的红色荧光，而其他处理组的HeLa细胞中未观察到荧光变化；如图7所示，当斑马鱼与近红外荧光化合物(20μM)和肼(50μM)分别孵育30分钟后，在荧光显微镜下观察到红色荧光。然而，当其他处理组的斑马鱼未观察到明显的荧光变化。

附图说明

图1为(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸与肼反应产物的高分辨质谱图；

图2为(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸与肼反应产物的核磁共振图；

图3为在(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸的工作液中加入不同分析物等化合物反应的荧光发射和紫外光谱图；

图4为(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸与肼的荧光发射光谱图；

图5为(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸试纸与不同分析物的紫外发光图；

图6为(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸在HeLa细胞中的荧光显微成像图；

图7为(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸在3日龄斑马鱼中孵育的荧光显微成像图。

具体实施方式

本发明公开了一种可特异性检测肼的近红外荧光化合物及其制备方法。该近红外荧光化合物的特征在于它由两部分组成，其中4-溴丁酰基作为识别基团，(E)-2-(3-(4-(二乙氨基)-2-羟基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯-1-基)丙二腈为信息报告基团。所报告近红外荧光化合物上4-溴丁酰基能与体系中肼发生特异性反应，使近红外荧光化合物的荧光发生变化，从而实现对肼的特异性检测。

下面结合实施例对本发明进一步描述

实施例1

用于肼检测的近红外荧光化合物的制备

本发明所述近红外荧光化合物为(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸(DCDB)，具体制备过程如下：

(1)在氮气保护下，将DHDM(1.0g，2.8mmol)，三乙胺(1.0mL)和无水二氯甲烷(50mL)混合并添加到100mL三颈烧瓶中，采用冰浴降温至0℃。

(2)在冰浴条件下，然后将4-溴丁酰氯(0.62mg，3.3mmol)缓慢逐滴加入含有(1)步骤混合物的三颈烧瓶中，室温下搅拌10-12小时。反应期间使用薄层色谱法(TLC)监测反应进度。

(3)反应完成后，将混合物倒入50mL0℃冰水中搅拌混匀，并加入二氯甲烷萃取3次，每次10mL。用5.0g无水硫酸钠干燥后将有机相浓缩至油状物。

(4)用正已烷和乙酸乙酯按体积比3:1配制成洗脱液通过柱色谱法洗脱纯化粗产物，得到1.03g紫黑色固体(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸DCDB，产率为72％。

(5)(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸表征结果如下：

核磁共振氢谱测定：¹H NMR(d₆-DMSO,600Hz)δ7.73(d,J＝9.0Hz,1H),7.11(d,J＝16.0Hz,1H),6.99(d,J＝16.0Hz,1H),6.75(s,1H),6.61(dd,J＝9.2,2.6Hz,1H),6.41(d,J＝2.6Hz,1H),3.63(t,J＝6.5Hz,2H),3.37(m,4H),2.84(t,J＝7.1Hz,2H),2.55(s,2H),2.44(s,2H),2.20(m,2H),1.09(m,6H),0.98(s,6H).¹³C NMR(d₆-DMSO,151MHz)δ:171.28,170.29,157.02,151.40,150.19,131.51,128.77,125.65,121.39,115.19,114.79,113.96,110.31,105.28,105.24,74.25,44.37,42.78,40.55,39.65,38.60,34.42,32.50,32.04,27.96,27.92,12.94；高分辨质谱：HRMS(ESI,m/z)Calcd for[C₁₂H₁₄N₂+H]⁺:510.1751,found:510.1750；熔点：228.9℃。傅里叶红外：FT-IR(KBr,cm^-1):3334.67,2961.19,2925.62,2866.72,2221.56,1617.10,1537.98,1497.52,1413.79,1337.27,1286.64,1190.23,1151.19,1075.33,1016.59,963.47,892.53,822.89,784.23.

所述近红外荧光化合物为(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸，其化学结构式如式(I)所示：

式(I)。

本发明所述近红外荧光化合物(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸的检测机理如下：

(1)本发明所述近红外荧光化合物，(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸与肼发生反应，首先肼的一个N原子与近红外荧光化合物的Br原子附近的C原子发生亲核取代反应，Br原子被替换；

(2)然后，肼中的另一个N原子攻击近红外荧光化合物上羰基的C原子，加成环化生成稳定的六元环环化产物四氢哒嗪(ESI-MS[M+H]⁺，m/z：101.0710)和化合物DHDM(ESI-MS[M+H]⁺，m/z：362.2228)，产生了可识别荧光，图1-2显示了该近红外荧光化合物与肼反应产物的高分辨质谱和核磁共振图谱；

(3)结果排除了溶液及生物体中常见分析物的干扰，且检测限低至39.6nM，相比于多数同类型荧光化合物具有很大的优势。

实施例2

用于溶液体系中肼的选择性检测

(1)将实施例1中所制备的近红外荧光化合物用缓冲液配制成浓度为10μM的近红外荧光化合物溶液，所述缓冲液由体积比为1:1的磷酸缓冲盐溶液(PBS)和二甲基亚砜(DMSO)配制成，缓冲液的pH值为7.4；

(2)用10μM的近红外荧光化合物溶液选择性的对溶液中的肼进行检测；

取81份3mL浓度10μM的近红外荧光化合物溶液，向其中分别加入120μL浓度为5×10^-5mol/L的种待测分析物，待测分析物共27种，每种待测分析物由3个平行单元组成一组，共得到81份反应物；27种待测分析物为200μM肼(N₂H₄)，200μM六水合硝酸镁(Mg(NO₃)₂·6H₂O)，200μM甲基肼(Methylhydrazine)，200μM1,2-二甲基肼(1,2-dimethylhydrazinedihydro chloride)，200μM半胱氨酸(Cys)，200μM谷胱甘肽(GSH)，200μM脯氨酸(proline)，200μM天冬氨酸(asparticacid)，200μM色氨酸(tryptophan)，200μM精氨酸(arginine)，200μM酪氨酸(tyrosine)，200μM组氨酸(histidine)，200μM谷氨酸(glutamicacid)，200μM赖氨酸(lysine)，200μM苏氨酸(threonine)，200μM甘氨酸(glycine)，200μM硝酸钾(KNO₃)，200μM四水合硝酸钙(Ca(NO₃)₂·4H₂O)，200μM硝酸钠(NaNO₃)，200μM三水合硝酸铜(Cu(NO₃)₂·3H₂O)，200μM六水合硝酸锌(Zn(NO₃)₂·6H₂O)，200μM九水合硝酸铁(Fe(NO₃)₃·9H₂O)，200μM硫氢化钠(NaHS)，200μM氯化镍(NiCl₂),200μM硝酸银(AgNO₃),200μM氯化汞(HgCl₂)和200μM氯化钴(CoCl₂)。

(3)反应完全，得到81份反应物，分别对81份反应物进行荧光强度测定；

(4)图3a和3b分别表示荧光强度和紫外吸收强度的结果，结果显示仅肼的荧光强度和紫外吸收强度有了明显的增强，即(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸对肼有较好的选择性；不仅如此，图3c显示了该近红外荧光化合物对肼的抗干扰能力结果，结果表明其他干扰分析物并不会影响近红外荧光化合物对肼的响应；综上，所述近红外荧光化合物可以特异性识别肼，并具有较强的抗干扰能力。

实施例3

用于溶液体系中近红外荧光化合物对肼的检测灵敏度

(1)将实施例1中所制备的近红外荧光化合物用缓冲液配制成浓度为10μM的近红外荧光化合物溶液，所述缓冲液由体积比为1:1的磷酸缓冲盐溶液(PBS)和二甲基亚砜(DMSO)配制成，缓冲液的pH值为7.4；

(2)用10μM的近红外荧光化合物溶液对不同浓度(0μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，100μM，110μM，120μM，130μM，140μM，150μM)的肼进行荧光检测；

(3)向配制好的48份3mL浓度10μM的近红外荧光化合物溶液，分别对应加入不同浓度(0μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，100μM，110μM，120μM，130μM，140μM，150μM)的肼，每个浓度设三组平行单元；

(4)反应完全，得到48份反应物，分别对48份反应物进行荧光强度测定。

(5)由图4a可见，肼(N₂H₄)能够提高近红外荧光化合物溶液荧光强度，随着肼浓度的不断的增大，近红外荧光化合物溶液的荧光强度随之增强；图4b显示近红外荧光化合物溶液的荧光强度与肼的浓度呈较好的线性关系(R²＝0.9967)，计算得到近红外荧光化合物对肼的检测限低至39.6nM，即该近红外荧光化合物能够定量检测溶液中痕量肼的存在。

实施例4

近红外荧光化合物试纸显色

用于滤纸上肼检测时，用二氯甲烷和近红外荧光化合物配制成浓度20μM的工作液；具体操作过程如下：

(1)制作所述近红外荧光化合物的检测试纸，用二氯甲烷将所述近红外荧光化合物配制成浓度10μM的工作液，再将若干大小形状一致的滤纸浸入近红外荧光化合物工作液30分钟，取出滤纸并晾干；

(2)将200μM肼(N₂H₄)，200μM六水合硝酸镁(Mg(NO₃)₂·6H₂O)，200μM甲基肼(Methylhydrazine)，200μM1,2-二甲基肼(1,2-dimethylhydrazinedihydrochloride)，200μM半胱氨酸(Cys)，200μM谷胱甘肽(GSH)，200μM脯氨酸(proline)，200μM天冬氨酸(asparticacid)，200μM色氨酸(tryptophan)，200μM精氨酸(arginine)，200μM酪氨酸(tyrosine)，200μM组氨酸(histidine)，200μM谷氨酸(glutamicacid)，200μM赖氨酸(lysine)，200μM苏氨酸(threonine)，200μM甘氨酸(glycine)，200μM硝酸钾(KNO₃)，200μM四水合硝酸钙(Ca(NO₃)₂·4H₂O)，200μM硝酸钠(NaNO₃)，200μM三水合硝酸铜(Cu(NO₃)₂·3H₂O)，200μM六水合硝酸锌(Zn(NO₃)₂·6H₂O)，200μM九水合硝酸铁(Fe(NO₃)₃·9H₂O)，200μM硫氢化钠(NaHS)，200μM氯化镍(NiCl₂),200μM硝酸银(AgNO₃),200μM氯化汞(HgCl₂)和200μM氯化钴(CoCl₂)的水溶液，分别滴加到制备好的近红外荧光化合物滤纸上；

(3)放入365nm激发波长的紫外灯下观察；

(4)将不同浓度的肼(0μM，1μM，5μM，10μM，50μM，100μM，200μM)溶液分别滴加到制备好的近红外荧光化合物滤纸上；

(5)裸眼和在365nm激发波长紫外灯下观察试纸条变化；

(6)由图5a可见，肼存在下试纸条的荧光颜色变化为红色荧光，即检测出环境污染物肼；不同浓度的肼存在下，试纸条在裸眼和紫外灯下都表现出不同程度的颜色变化，见图5b；结果表明所述的近红外荧光化合物试纸条能够快速检测出溶液中的肼，且可初步对溶液中的肼进行定量；综上，该近红外荧光化合物试纸条在快速检测领域具有很大的应用前景。

实施例5

应用于环境水样中肼的定量检测

(1)用于环境水样中肼检测时，用缓冲液将权利要求1所述近红外荧光化合物配制成浓度10μM的工作溶液；所述缓冲液由磷酸缓冲盐溶液(PBS)和二甲基亚砜(DMSO)按体积比1:1配制成，缓冲液的pH值为7.4；

(2)用于环境水样中外源性肼检测时，采集不同区域的环境水样，并将其通过200μm水相滤膜过滤，得到处理后的环境水样；

(3)向处理后的环境水样中分别添加0.1，0.5和1.0μM的肼，利用近红外荧光化合物工作液检测环境水样中的肼。

表1为(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸对实际水样中肼的添加回收；

^*上述水样是在多个点采集的，采样点不小于5。数据为平均值±标准差(n＝3)。LOQ＝0.10μM由表1可见，肼的回收率达到87-109％，近红外荧光化合物工作液能够在环境水样中定量的检测肼的存在。

实施例6

应用于污水中肼的检测

(1)用于污水样品中肼检测时，用缓冲液将权利要求1所述近红外荧光化合物配制成浓度10μM的工作溶液；所述缓冲液由磷酸缓冲盐溶液(PBS)和二甲基亚砜(DMSO)按体积比1:1配制成，缓冲液的pH值为7.4；

(2)用于污水样品中肼检测时，采集不同区域化工厂的污水，并将其通过200μm水相滤膜过滤，得到待测污水样品；

(3)利用近红外荧光化合物工作液检测污水样品中的肼。

表2为(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸对污水水样中肼的检测；

^*上述水样是在多个点采集的，采样点不小于5。数据为平均值±标准差(n＝3)。LOQ＝0.10μM由表2可见，所述的近红外荧光化合物能够高灵敏的定量检测污水中的痕量肼。

实施例7

HeLa细胞内荧光成像

(1)用于HeLa细胞中肼检测时，用缓冲液将权利要求1所述近红外荧光化合物配制成浓度20μM的工作液；所述缓冲液中磷酸缓冲盐溶液(PBS)和二甲基亚砜(DMSO)的体积比为1：1，缓冲液的pH值为7.4；

(2)取A、B、C、D四组实验组，

A组为空白对照组：未经任何处理的HeLa细胞。

B组为肼处理对照组：用200μL浓度50μM的肼在含5×10⁴个HeLa细胞的孔板中与HeLa细胞孵育30分钟，得到用于检测的B组被检测物；

C组为近红外荧光化合物处理对照组：用200μL浓度20μM的(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸在含5×10⁴个HeLa细胞的孔板中与HeLa细胞孵育30分钟，得到用于检测的C组被检测物；

D组为近红外荧光化合物与肼处理组：用200μL浓度20μM(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸预处理含5×10⁴个HeLa细胞的孔板30分钟，然后与200μL浓度50μΜ肼一起孵育30分钟，得到用于检测的D组被检测物；

(3)将A组被检测物、B组被检测物、C组被检测物和D组被检测物分别放置在激发波长为520nm的荧光显微镜下观察；

(4)A组被检测物、B组被检测物、C组被检测物和D组被检测物荧光成像结果见图6，结果显示A组被检测物、B组被检测物、C组被检测物未被(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸和肼同时处理过的HeLa细胞并未发现有荧光；而D组被检测物使用(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸和肼处理过的斑马鱼显示出明显的红色荧光；荧光成像结果表明(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸能够进入HeLa细胞并与外源性肼发生反应，产生强烈的红色荧光，实现HeLa细胞中外源性肼的特异性检测。

实施例8

斑马鱼的荧光成像

(1)用于斑马鱼中外源肼检测时，用缓冲液将所述近红外荧光化合物配制成浓度为20μM的工作液，所述缓冲液由磷酸缓冲盐溶液(PBS)和二甲基亚砜(DMSO)按体积比1：1配制成，缓冲液的pH值为7.4。

(2)取A、B、C、D四组实验组，

A组为空白对照组：未经处理过的3日龄斑马鱼，得到A组被检测物；

B组为肼处理对照组：用5mL浓度为50μM的肼与发育正常的3日龄斑马鱼孵育30分钟，得到用于检测的B组被检测物；

C组为近红外荧光化合物处理对照组：3日龄斑马鱼用10mL浓度为20μM的(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸处理30分钟，得到用于检测的C组被检测物；

D组为近红外荧光化合物与肼处理组：3日龄斑马鱼用10mL浓度为50μM的肼与发育正常的3日龄斑马鱼孵育30分钟，然后在使用20μM的(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸处理30分钟，得到用于检测的B组被检测物；

(3)将A组被检测物、B组被检测物、C组被检测物和D组被检测物分别放置在激发波长为520nm的荧光显微镜下观察；

(4)斑马鱼荧光成像结果见图7，从图7a-c中可以看出A组被检测物、B组被检测物、C组被检测物未被(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸和肼同时处理过的HeLa细胞并未发现有荧光；而图7d可见，D组被检测物使用(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸和肼处理过的斑马鱼显示出明显的红色荧光；荧光成像结果表明(E)-2-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-5-(二乙氨基)苯基4-溴丁酸能够进入HeLa细胞并与外源性肼发生反应，产生强烈的红色荧光，实现HeLa细胞中外源性肼的特异性检测。