一种纳米氧化锌负载钯纳米粒子的纳米酶及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种纳米氧化锌负载钯纳米粒子的纳米酶及其制备方法和应用 (Nano enzyme of nano zinc oxide supported palladium nanoparticles and preparation method and application thereof ) 是由 杨黎妮 曲晓月 张迪 孟凡池 李涛 刘霄 夏立新 于 2021-07-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及纳米酶催化抗菌技术领域,具体涉及一种纳米氧化锌负载钯纳米复合材料作为纳米酶催化抗菌的应用。所述的纳米氧化锌负载钯纳米复合材料是以颗粒状纳米氧化锌为载体,以钯纳米粒子为活性中心形成的纳米氧化锌负载钯纳米粒子的纳米酶。钯纳米粒子的负载量为0.2％或0.5％。本发明所制备的纳米氧化锌负载钯纳米粒子的纳米酶表现出优异的催化抗菌性能,在生物医学领域具有潜在的应用。(The invention relates to the technical field of nano enzyme catalysis and antibiosis, in particular to application of a nano zinc oxide supported palladium nano composite material as nano enzyme catalysis and antibiosis. The nano-zinc oxide supported palladium nano-composite material is nano-enzyme of nano-zinc oxide supported palladium nano-particles formed by taking granular nano-zinc oxide as a carrier and palladium nano-particles as an active center. The loading of palladium nanoparticles was 0.2% or 0.5%. The nano enzyme of the nano zinc oxide supported palladium nano particle prepared by the invention has excellent catalytic antibacterial performance and has potential application in the field of biomedicine.)
技术领域
本发明涉及纳米酶催化抗菌
技术领域
，具体涉及一种纳米氧化锌负载钯纳米复合材料作为纳米酶催化抗菌的应用。背景技术
随着纳米材料的不断发展，人们发现了具有模拟天然酶的催化活性和稳定性的纳米材料，并将其命名为纳米酶。纳米酶具有成本低、可重复使用、稳定性和催化活性强等特点，被认为是天然酶有力的替代品，引起了人们的研究兴趣。已经报道的纳米酶大概分为金属纳米酶、金属氧化物或硫化物纳米酶和碳基纳米酶三类。主要的催化类型包括氧化酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶等。通过调节纳米酶的尺寸、活性中心的组成和结构等，能够显著提升催化活性，使其在生物传感、组织工程、癌症诊疗和细菌感染等领域具有广泛的应用。
近年来，抗生素的滥用现象越来越普遍，从而导致细菌耐药性问题日趋严重，对人类的生产生活造成了严重的威胁，因此寻找新型抗菌剂来解决这一问题已经变得十分急迫。研究表明，纳米酶作为一种新型抗菌材料，具有优异的抗菌性能。尤其是当贵金属作为纳米酶时能够催化过氧化氢分解产生活性氧物质，作用于细胞时会产生氧化应激，进而导致细胞死亡。但是高浓度的过氧化氢会对人体产生危害，而低浓度的过氧化氢虽然对人体无害，却不能达到良好的抗菌目的。所以，可以利用纳米酶与低浓度的过氧化氢协同作用来达到优异的抗菌效果。
发明内容
本发明的目的是，致力于开发具有高效催化抗菌性能的纳米氧化锌负载钯纳米粒子的纳米酶，利用颗粒状纳米氧化锌作为载体，负载钯纳米粒子。该纳米酶应用于催化抗菌领域，可以催化低浓度的过氧化氢产生羟基自由基，达到完全灭活细菌。具有绿色高效，简单易行等特点。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种纳米氧化锌负载钯纳米粒子的纳米酶，是以颗粒状纳米氧化锌为载体，以钯纳米粒子为活性中心形成的纳米氧化锌负载钯纳米粒子的纳米酶。
上述的一种纳米氧化锌负载钯纳米粒子的纳米酶，按重量百分比，钯纳米粒子的负载量为0.2％或0.5％。
上述的一种纳米氧化锌负载钯纳米粒子的纳米酶的制备方法，包括如下步骤：采用沉积沉淀法直接将钯纳米粒子负载到颗粒状纳米氧化锌上，进行还原反应，得到纳米氧化锌负载钯纳米粒子的纳米酶。
上述的一种纳米氧化锌负载钯纳米粒子的纳米酶的制备方法，所述的还原反应为在200℃、H2条件下还原2小时。
上述的一种纳米氧化锌负载钯纳米粒子的纳米酶的制备方法，所述采用沉积沉淀法直接将钯纳米粒子负载到颗粒状纳米氧化锌上，方法如下：将颗粒状纳米氧化锌分散于水中得悬浮液，将硝酸钯水溶液逐滴加入到纳米氧化锌悬浮液中进行反应，过滤，洗涤，干燥。
上述的一种纳米氧化锌负载钯纳米粒子的纳米酶的制备方法，所述的反应在pH＝8-9，温度为90℃的条件下进行。
上述的任一种纳米氧化锌负载钯纳米粒子的纳米酶在抗菌中的应用。
上述的应用，方法如下：于菌悬液中，加入上述的任一种纳米氧化锌负载钯纳米粒子的纳米酶和低浓度的过氧化氢混合物。
上述的应用，所述的菌悬液为大肠杆菌悬浮液。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明，采用纳米氧化锌负载钯纳米粒子作为纳米酶，其具有优异的模拟过氧化物酶催化活性。将其应用于抗菌领域，该纳米酶表现出强力的灭菌作用，其抗菌率可以达到100％。
2.本发明，采用纳米氧化锌作为载体负载钯纳米粒子作为纳米酶，分散均匀且粒径较小的钯作为活性中心，增强了材料的催化活性。
3.本发明，采用纳米氧化锌作为载体负载钯纳米粒子作为纳米酶，该纳米酶通过沉积沉淀法合成，制备方法简单，反应过程可控，可规模化生产。
4.本发明，采用纳米氧化锌作为载体负载钯纳米粒子作为纳米酶，通过催化低浓度的过氧化氢分解产生羟基自由基达到抗菌目的，高效环保。
5.本发明，采用纳米氧化锌作为载体负载钯纳米粒子作为纳米酶，在化学工程、催化以及生物医药等领域有着非常广阔的应用前景。
总之，本发明所述的纳米酶中，钯纳米粒子均匀的分散在纳米氧化锌载体上，显著的提高了钯的酶催化活性，使其可以催化低浓度的过氧化氢分解达到完全灭菌。本发明合成过程简便，反应过程易控，且所制备的纳米氧化锌负载钯纳米粒子的纳米酶表现出优异的催化抗菌性能，在生物医学领域有潜在的应用。
附图说明
图1是纳米复合材料0.2wt％Pd-NPs/ZnO的相关TEM图；
其中，A：5nm；B：2nm。
图2是纳米复合材料0.5wt％Pd-NPs/ZnO的相关TEM图；
其中，A：10nm；B：2nm。
图3是n-ZnO、0.2wt％Pd-NPs/ZnO和0.5wt％Pd-NPs/ZnO的相关X射线衍射图(XRD图)。
图4是n-ZnO、0.2wt％Pd-NPs/ZnO和0.5wt％Pd-NPs/ZnO的TMB实验图。
其中，A、B分别为TMB浓度和H2O2浓度保持不变n-ZnO、0.2wt％Pd-NPs/ZnO和0.5wt％Pd-NPs/ZnO的典型Michaelis-Menten曲线。
图5是0.5wt％Pd-NPs/ZnO和H2O2的相关ESR测试图。
图6是n-ZnO、0.2wt％Pd-NPs/ZnO和0.5wt％Pd-NPs/ZnO的相关抗菌效果图。
其中，A：空白；B：低浓度过氧化氢的抗菌效果图；C：n-ZnO和过氧化氢的协同抗菌效果图；D：0.2wt％Pd-NPs/ZnO和过氧化氢的协同抗菌效果图；E：0.5wt％Pd-NPs/ZnO和过氧化氢的协同抗菌效果图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的技术方案，特以具体的实施例作进一步详细说明，但方案不限于此。
实施例1
纳米氧化锌负载钯纳米粒子的纳米酶(Pd-NPs/ZnO)
(一)制备方法包括如下步骤：
1、将200mg氧化锌(n-ZnO)纳米材料置于含有20mL去离子水的圆底烧瓶中，超声30min左右使其分散均匀后待用。按照钯(Pd)的担载量为0.2wt％和0.5wt％分别向溶液中逐滴滴加0.109mL、0.272mL浓度为8mg/mL的硝酸钯溶液，之后用0.3mLNa2CO3溶液调节pH＝8-9。然后将混合物在90℃下加热2h，冷却至室温后经多次洗涤，过滤后放入60℃烘箱中干燥，最后在200℃下H2还原2h即可得到0.2wt％、0.5wt％Pd-NPs/ZnO纳米酶。
(二)检测
图1为纳米复合材料0.2wt％Pd-NPs/ZnO的相关TEM图。由图1可见，可以看出钯纳米粒子成功负载在纳米氧化锌的表面，且纳米氧化锌的结构没有被破坏。
图2为纳米复合材料0.5wt％Pd-NPs/ZnO的相关TEM图。由图2可见，可以看出钯纳米粒子粒径较小、分散良好，没有出现团聚现象。
图3为n-ZnO、0.2wt％Pd-NPs/ZnO和0.5wt％Pd-NPs/ZnO的相关X射线衍射图。由图3可见，钯的负载并没有破坏纳米氧化锌的结构，且在XRD图中没有出现钯的特征峰，表明钯的粒径极小。
实施例2
纳米氧化锌负载钯纳米粒子的纳米酶Pd-NPs/ZnO的模拟过氧化物酶活性(一)n-ZnO、0.2wt％Pd-NPs/ZnO和0.5wt％Pd-NPs/ZnO的TMB实验
通过TMB实验测定n-ZnO、0.2wt％Pd-NPs/ZnO和0.5wt％Pd-NPs/ZnO模拟过氧化物酶活性。
方法：选择3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)作为过氧化物酶的显色底物，取一定量的纳米酶和一定浓度的H2O2溶液混合后能够有效的催化氧化TMB成蓝色的氧化态TMB(oxTMB)，且在紫外可见吸收光谱的652nm处有一个特征明显的吸收峰，通过比较吸光度的变化，可以判断n-ZnO、0.2wt％Pd-NPs/ZnO和0.5wt％Pd-NPs/ZnO纳米酶是否具有模拟过氧化物酶活性。
图4为n-ZnO、0.2wt％Pd-NPs/ZnO和0.5wt％Pd-NPs/ZnO的TMB实验图。图4中A和B分别为TMB浓度和H2O2浓度保持不变，n-ZnO、0.2wt％Pd-NPs/ZnO和0.5wt％Pd-NPs/ZnO的典型Michaelis-Menten曲线，由图4中A、B可以看出，与n-ZnO和0.2wt％Pd-NPs/ZnO相比，0.5wt％Pd-NPs/ZnO作为纳米酶展现出优异的模拟过氧化物酶活性。
(二)0.5wt％Pd-NPs/ZnO的催化机理研究
图5为0.5wt％Pd-NPs/ZnO，H2O2和H2O2+0.5wt％Pd-NPs/ZnO的ESR测试图。验证了0.5wt％Pd-NPs/ZnO纳米酶具有优异的模拟过氧化物酶活性，可以催化低浓度的H2O2分解产生羟基自由基达到抗菌目的，从而使其具有抗菌领域应用。
实施例3
纳米氧化锌负载钯纳米粒子的纳米酶Pd-NPs/ZnO在抗菌中的应用
抗菌实验，包括如下步骤：
1)LB培养基的配制：称取8.25g营养琼脂于锥形瓶中，加入250mL去离子水并超声使其溶解，用氢氧化钠调节pH＝7.2-7.4，即可得到固体培养基，在0.1MPa、120℃的条件下灭菌后倒入平板中，放置在冰箱上层待用。称取酵母浸粉0.5g，氯化钠1g和胰蛋白胨1g于锥形瓶中，加入100mL去离子水并超声使其溶解，同样用氢氧化钠调节pH＝7.2-7.4，即可得到液体培养基，在相同条件下灭菌后放置在冰箱上层待用。实验所用的玻璃仪器均需在高压灭菌锅中灭菌待用。
2)将接种环灭菌后挑取大肠杆菌菌种(E.coli 25922)，在固体培养基上画三线，然后在37℃恒温生化培养箱中培养12-18h，用烧过的接种环挑取三线中的单菌落，加入10mL的液体培养中，放置于37℃恒温振荡器中振荡10h，得到OD值为2.459的菌悬液。
3)取5mL菌悬液于离心管中，放置在离心机中4000r离心20min，倒掉上清液，用pH＝4.5的醋酸钠(NaAc-HAc)缓冲溶液洗涤菌悬液两次，此时的菌液浓度为109cfu·mL-1，用NaAc-HAc缓冲溶液对菌液进行逐级稀释，使最终的菌液浓度为104cfu·mL-1。
4)取30％的H2O2(浓度约为10mol/L)于离心管中，加入NaAc-HAc缓冲溶液对H2O2溶液进行逐级稀释，使H2O2溶液的最终浓度为100μmol/L。
5)称取0.1mg的n-ZnO、0.2wt％Pd-NPs/ZnO、0.5wt％Pd-NPs/ZnO纳米酶于离心管中，加入4.5mL浓度为100μmol/L的H2O2溶液振荡均匀，然后加入0.5mL菌液浓度为104cfu·mL-1的菌悬液，充分振荡使其混合均匀，取100μL混合液于固体培养基上进行均匀涂布，将固体培养基放置于37℃恒温生化培养箱中培养12h，并观察菌落的生长状况，计数后计算抗菌率，并比较加入H2O2溶液时的抗菌效果。
图6是采用本发明方法制备的n-ZnO、0.2wt％Pd-NPs/ZnO和0.5wt％Pd-NPs/ZnO的相关抗菌效果图。图中A为空白；B为H2O2抗菌效果图；C为n-ZnO+H2O2抗菌效果图；D为0.2wt％Pd-NPs/ZnO+H2O2抗菌效果图；E为0.5wt％Pd-NPs/ZnO+H2O2抗菌效果图。通过抗菌实验发现0.5wt％Pd-NPs/ZnO纳米酶与H2O2协同作用具有更优异的抗菌性能，其抗菌率可以达到100％。这充分的说明本发明合成的0.5wt％Pd-NPs/ZnO纳米酶与H2O2协同作用具有优异的抗菌性能，在催化抗菌领域有潜在的应用。