阅读说明：本技术 一种核酸保护试剂及其使用方法 (Nucleic acid protection reagent and use method thereof ) 是由 不公告发明人 于 2019-09-18 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种核酸保护试剂,其包括含戊二醛、乙醇的DEPC水溶液、含EDTA、甘氨酸、海藻糖、Tris碱的DEPC水溶液。本发明还提供了使用该试剂保存生物样本中包括cfDNA和exRNA在内的DNA和RNA的方法。(The invention provides a nucleic acid protection reagent which comprises a DEPC aqueous solution containing glutaraldehyde and ethanol, and a DEPC aqueous solution containing EDTA, glycine, trehalose and Tris alkali. The present invention also provides a method for preserving DNA and RNA including cfDNA and exRNA in a biological sample using the reagent.)

一种核酸保护试剂及其使用方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地，本发明提供了一种核酸保护试剂盒，其包括含戊二醛、乙醇的DEPC水溶液、含EDTA、甘氨酸、海藻糖、Tris碱的DEPC水溶液。本发明还提供了使用该试剂盒保存生物样本中包括cfDNA和exRNA在内的DNA和RNA的方法。

背景技术

随着分子生物学的发展，核酸已经成为各种科研、诊断检测中越来越重要的靶分子。而核酸，特别是cfDNA、exRNA等小核酸分子在处理和保存中容易受到外界条件或核酸酶的影响而失活失真，因此生物样本中的核酸保存是分子生物学研究和检测的重要保障。

目前市面上已经有多种用于保存核酸的试剂/试剂盒，如RNA later、RNA stable等，但这些试剂有的需要冷冻保存、有的需要提取步骤(在样本量大，操作条件差的地区难以实现)、有的专用于某种生物样本，而且多售价昂贵。因此，寻找一种不使用特殊试剂和沉重仪器，能在常温下长时间稳定保存生物样本，维持其中核酸状况的核酸保护试剂对于推广大规模疾病筛查/进行相关科学研究意义重大。

申请人发现无论是处理细胞样本还是血液样本时，加入少量交联剂/蛋白变性剂如戊二醛、乙醇使得样本表面的蛋白进行部分交联/初步固定后再加入含螯合剂、保护剂等的保存液，可以在常温下长期保存生物样本而保证其中包括cfDNA和exRNA在内的DNA和RNA基本不变。

一方面，本申请提供了一种核酸保护试剂盒，包括以下成分：

A.使用DEPC水配制的含戊二醛、乙醇的溶液；

B.使用DEPC水配制的，包含EDTA、甘氨酸、海藻糖、Tris碱的溶液。

进一步地，其中：

A.使用DEPC水配制的含戊二醛5-15％v/v、乙醇30-50％v/v的溶液；

B.使用DEPC水配制的，包含EDTA 5-15％w/v、甘氨酸3-9％w/v、海藻糖4-12％w/v、Tris 碱0.5-5％w/v的溶液。

进一步地，其中：

A.使用DEPC水配制的含戊二醛10％v/v、乙醇40％v/v的溶液；

B.使用DEPC水配制的，包含EDTA 10％w/v、甘氨酸5％w/v、海藻糖7％w/v、Tris碱1％w/v 的溶液。

另一方面，本申请提供了使用上述核酸保护试剂盒保存生物样本的方法，包括使用A液处理样本、加入B液长期保存。

进一步地，所述生物样本为组织、细胞、血液、体液、土壤或粪便。

进一步地，当生物样本为固体时，加入足以浸没生物样本的A液，固定20分钟后加入A 液量3倍的B液保存。。

进一步地，当生物样本为液体时，根据样本的不同加入生物样本量0.5-2倍体积的A液，固定10分钟后加入A液量3倍的B液保存。

进一步地，其中保存的对象包括DNA、RNA。

进一步地，其中保存的对象还包括cfDNA、exRNA。

这样操作简单——不需要任何仪器，价格低廉——未使用特殊的抑制剂和酶，保存要求低——4摄氏度甚至常温下即可长期保存的核酸保护试剂组，对于大规模疾病筛查/检测，特别是操作条件不佳时的疾病筛查和检测具有重要意义。

附图说明

图为HCT 116保存0、7、14、21日后提取的RNA电泳图。

实施方式

实施例1试剂的配制

A液

使用DPEC水(赛默飞世尔)配制含戊二醛10％v/v(国药集团)、乙醇40％v/v(国药集团)的溶液。

B液

使用DPEC水(赛默飞世尔)配制包含EDTA 10％w/v(SIMGA/MERCK)、甘氨酸5％w/v(国药集团)、海藻糖7％w/v(SIMGA/MERCK)、Tris碱1％w/v(SIMGA/MERCK)的溶液，以1M盐酸调pH至8.5。

实施例2细胞样本的保存

准备4份从培养基悬液中离心收集人结肠癌细胞HCT 116(约2×10⁶细胞)，向每个离心管中加入0.5mLA液，轻轻吹打混合后静置20分钟，加入1.5mL B液体。垂直室温(20-25摄氏度)保存于离心管架上0、7、14、21日，使用ZYMO RESEARCH公司的Quick-RNA kit 试剂盒进行RNA提取。浓度和纯度检测结果如下表1和图1所示：

表1：RNA浓度和OD260/280、OD260/230

室温放置时间	0天	7天	14天	21天
					浓度(ng/ul)	399.9232	384.9276	421.8452	426.5915
OD260/280	2.0151	2.0897	2.0229	2.0189
					OD260/230	1.934	1.835	2.0853	2.1101

结果表明使用本申请的试剂盒常温保存细胞样本3周后无论是RNA浓度、纯度还是小RNA 情况都没有显著改变。但是用RNAlater试剂常温保存三天后发现明显降解。

实施例3血液样品的保存

采集1名血常规指标正常、无炎症指症的男性志愿者的血浆样本40mL，分为4等份，向每份中加入10mL的A液，轻轻吹打混合后静置10分钟，加入A液量30mL的B液保存。垂直室温(20-25摄氏度)保存于离心管架上0、7、14、21日，使用ZYMO RESEARCH公司Quick-cfDNASerum&Plasma Kit试剂盒提取样品中的cfDNA，以QUBIT 3.0检测cfDNA浓度。结果如下表2所示。

表2：cfDNA浓度

结果表明使用本申请的试剂常温保存血浆样本3周后，cfDNA浓度变化幅度没有超过15％，仍然可以用于cfDNA检测，如果全程或部分时间使用低温保存，保存时间有望更长。

实施例4实际检测效果验证

合作单位使用厦门艾德生物的人类EGFR基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)检测人血液样本中的T790M突变。

取20例经过检测的血浆样本(检测剩余)，使用本申请试剂盒按照实施例3的方法进行检测，常温保存2个月后检再次检测。

两次结果相同(5例突变，15例正常)，证明了本申请的试剂盒保存的样本仍然可以有效的进行PCR检测。