阅读说明：本技术 一种dna提取试剂盒及提取方法 (DNA extraction kit and extraction method ) 是由 余小玲 陆青 朱峰 彭杰 黄翔 卢彦羽 肖红涛 赵平锋 于 2020-07-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种DNA提取试剂盒及提取方法,试剂盒由以下成分组成：红细胞裂解液、白细胞裂解液、蛋白酶K溶液、醋酸铵溶液、无水乙醇、75％乙醇和TE溶液。提取方法是全血样本先用红细胞裂解液去除无核成分,再加入白细胞裂解液和蛋白酶K裂解细胞并释放核酸,最后采用醋酸铵溶液、无水乙醇、75％乙醇和TE溶液去除杂质,获得DNA提取产物。该试剂盒成分简单,无有毒有害成分,所需样品少,提取效果好；提取方法操作简单、快速,不需要特殊器材辅助,仅使用离心管和离心机即可完成,整个提取过程只需要40分钟即可完成；所提取的DNA产物浓度和纯度均符合要求。(The invention discloses a DNA extraction kit and an extraction method, wherein the kit comprises the following components: erythrocyte lysate, leukocyte lysate, proteinase K solution, ammonium acetate solution, absolute ethyl alcohol, 75% ethyl alcohol and TE solution. The extraction method comprises the steps of removing anucleate components from a whole blood sample by using a red blood cell lysate, adding a white blood cell lysate and proteinase K to lyse cells and release nucleic acid, and finally removing impurities by using an ammonium acetate solution, absolute ethyl alcohol, 75% ethyl alcohol and a TE solution to obtain a DNA extraction product. The kit has simple components, no toxic or harmful components, less required samples and good extraction effect; the extraction method is simple and rapid to operate, special equipment is not needed for assistance, the extraction can be completed only by using a centrifugal tube and a centrifugal machine, and the whole extraction process can be completed only in 40 minutes; the concentration and purity of the extracted DNA product meet the requirements.)

一种DNA提取试剂盒及提取方法

技术领域

本发明核酸提取技术领域，具体涉及一种DNA提取试剂盒及提取方法。

背景技术

核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸(简称RNA)和脱氧核糖核酸(简称DNA)，广泛存在于所有动植物、微生物及生物体内。随着分子生物学的发展，核酸检测的广泛应用，核酸的提取纯化是各种分子生物学研究和临床检测的基础。人类血液样本由于其在临床上取样简单易得，是分子生物学研究和临床检测中最常用的人体样本之一。快速而有效的人类血液DNA提取纯化有助于临床体外检测。

现有的核酸提取方法主要包括苯酚氯仿抽提法、离心柱法、磁珠法。其中，苯酚氯仿抽提法是最经典的方法，但是操作复杂耗时，且含有有害有机溶剂，对人体有害，易污染环境；离心柱法和磁珠法是目前比较常用的方法，但是涉及特殊的吸附柱或磁力吸附仪器而导致操作复杂且成本较高。

随着核酸检测的广泛应用，核酸提取纯化技术也在发展，国内外已有各种人类血液核酸提取试剂盒推出。目前这些核酸提取纯化试剂盒存在操作复杂、需要特殊仪器或者器材，成本高，甚至有害等不利于生物学研究和临床检测应用。因此，需要一种简单、快速、无有害试剂、无需任何特殊器材和仪器的人类血液DNA提取试剂盒，使其产物可适用于临床体外检测。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述多种问题，本发明提供了一种DNA提取试剂盒，能够简单、快速、有效地提取人类血液DNA，提取时间短，且不含有害成分，也无需特殊器材或仪器辅助。本发明还提供了一种DNA提取方法。

本发明提供的DNA提取试剂盒，由以下成分组成：红细胞裂解液、白细胞裂解液、蛋白酶K溶液、醋酸铵溶液、无水乙醇、75％乙醇和TE溶液；

所述红细胞裂解液每升含有：氯化铵2-20g，碳酸氢钾0.1-5g，乙二胺四乙酸二钠0.1-1g，溶剂为去离子水；

所述白细胞裂解液为质量百分含量为0.5-5％的十二烷基硫酸钠水溶液；

所述蛋白酶K溶液中蛋白酶K的浓度为0.05-2.00mg/L；

所述醋酸铵溶液中醋酸铵浓度为2.5-10mol/L；

所述75％乙醇为乙醇的体积百分含量为75％的乙醇水溶液。

本方法采用十二烷基硫酸钠和蛋白酶K相结合使细胞裂解，降解蛋白和核酶。加入醋酸铵有两个作用，一方面能够促使部分蛋白沉淀，另一方面提供适当的盐离子促使乙醇中的DNA沉淀。本方法在提供醋酸铵和乙醇的环境下，通过离心就能使DNA沉淀，因此无需使用吸附柱。采用十二烷基硫酸钠和蛋白酶K降解蛋白，醋酸铵乙醇除去蛋白等杂质，足以提供高纯度DNA，避免了采用苯酚氯仿等有害试剂。

优选的，上述DNA提取试剂盒中，所述红细胞裂解液pH值7.0-8.0。

优选的，上述DNA提取试剂盒中，所述TE溶液为含有Tris-HCl和EDTA的水溶液，pH值8.0，Tris-HCl浓度为1mol/L，EDTA浓度为0.5mol/L。

本发明提供的DNA提取方法，使用以上任一所述的DNA提取试剂盒完成。

优选的，上述DNA提取方法，是全血样本先用红细胞裂解液去除无核成分，再加入白细胞裂解液和蛋白酶K裂解细胞并释放核酸，最后采用醋酸铵溶液、无水乙醇、75％乙醇和TE溶液去除杂质，获得DNA提取产物。

优选的，上述DNA提取方法，具体包括如下操作步骤：

(1)取全血样本放置于离心管内，加入红细胞裂解液，混匀，放置，再离心弃上清，得沉淀；

(2)沉淀中加入蛋白酶K溶液和白细胞裂解液，重悬沉淀，65℃水浴10min；

(3)加入醋酸铵溶液，混匀，离心，取上清，再加入预冷的无水乙醇，混匀、室温放置，然后离心，弃上清，得沉淀；

(4)步骤(3)的沉淀中加入75％乙醇，混匀，离心，弃上清，得沉淀；

(5)步骤(4)的沉淀室温晾至乙醇挥发完毕，再加入TE溶液，重悬后65℃水浴5min，离心使溶液集中至管底，即为DNA提取产物。

优选的，上述DNA提取方法中，所述全血样本使用量为200μL。

优选的，上述DNA提取方法中，所述全血样本为新鲜的人类外周血经EDTA K2/K3抗凝处理后的样本。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的DNA提取试剂盒，试剂成分简单，不含苯酚、氯仿等有害有机成分，所有试剂成分都安全无害。

利用醋酸铵与乙醇相结合的方法，在去除杂质的同时沉淀DNA，保证了提取产物DNA的纯度。

整个试剂盒在提取过程中不需要使用特殊的吸附柱吸附DNA，所用耗材简单，只需要1.5ml容量规格的无核酸酶污染的离心管；也不需要磁力架等特殊仪器，只需要普通的离心机即可完成提取过程。

提取所需的血液样本非常少，只要200μL即可满足提取需求，所提取的DNA浓度范围31.7-94.5ng/μL，260/280在1.8～2.0之间，浓度及纯度都较高。且DNA的生物学性能不会被破坏。

提取方法简单快速，易***作人员掌握，全程只需要40分钟即可完成人类血液DNA的提取，批量操作更具有优势。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

以下实施例中所使用的技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂等，除非是本说明书特别说明，均为本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。

实施例1DNA提取试剂盒的组成及使用方法

(1)本试剂盒所需的主要试剂和耗材包括：

①红细胞裂解液，其配方为：氯化铵2～20g，碳酸氢钾0.1～5g，乙二胺四乙酸二钠0.1～1g，加去离子水溶解，调pH至7.0～8.0，定容至1L。

②白细胞裂解液，其配方为十二烷基硫酸钠0.5％～5％。

③蛋白酶K浓度为0.05～2mg/mL。

④醋酸铵溶液中醋酸铵浓度为2.5～10mol/L。

⑤无水乙醇和75％乙醇。

⑥TE溶液，其配方为Tris-HCl 1mol/L，EDTA0.5mol/L，pH 8.0。

⑦1.5mL无核酸酶污染的离心管。

(2)本试剂盒的主要操作过程如下：

①取200μL全血样本放置于1.5mL离心管内，加入800μL红细胞裂解液，上下颠倒3-5次混匀，室温放置5min，放置期间颠倒混匀1-2次。12000rpm离心2min，弃上清。

②加入10μLProteinase K溶液，200μL白细胞裂解液，涡旋使沉淀充分重悬。65℃水浴10min。

③加入100μL醋酸铵溶液，混匀，离心，取上清，加入400μL预冷的无水乙醇，混匀，室温放置5min。12000rpm离心10min。

④弃上清，加入1mL 75％的乙醇，上下颠倒3-5次，12000rpm离心2min。

⑤弃上清，室温晾5-10min，以彻底挥发残余的乙醇。

⑥加入100μLTE，短暂涡旋，65℃水浴5min。稍稍离心使溶液集中至管底，4℃或-20℃保存。

实施例2健康人外周血样本的DNA提取及提取效果检测

本实施例是采用健康人外周血样本进行DNA提取，超微量分光光度计(NanoDrop2000)测定DNA浓度及纯度，MTHFR(C677T)基因多态性检测试剂进一步检测DNA提取产物PCR扩增效果。具体详述如下：

(1)样本准备

采集0.5mL新鲜的人类外周血，加至EDTAK2/K3抗凝管中，采集后立即轻柔颠倒混匀5次，置于2-8℃环境保存。

(2)DNA提取

DNA提取步骤同实施例1第(2)部分的①-⑥。

(3)DNA浓度及纯度检测

15例人类血液样本DNA提取产物采用超微量分光光度计(NanoDrop2000)测定DNA浓度及纯度。15例样本DNA浓度范围31.7-94.5ng/μL，260/280在1.8～2.0之间，具体检测结果见表1：

表1.DNA提取浓度及纯度检测

(4)DNA提取产物PCR扩增效果检测

15例人类血液样本，分别使用本试剂盒和核酸提取试剂盒(YC-B)(武汉海吉力生物科技有限公司)进行DNA提取，提取产物采用MTHFR(C677T)基因多态性检测试剂进一步检测DNA提取产物PCR扩增效果。两种方法提取DNA后，PCR检测的基因型结果一致，检测结果见表2：

表2.样本PCR检测结果比对

注：编号Y表示YC-B提取方法，编号H表示本试剂盒提取方法。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。