阅读说明：本技术 腱膜支架及其制备方法和应用 (Aponeurosis stent and preparation method and application thereof ) 是由 范存义 崔昊旻 余雅玲 文根 陈帅 于 2020-08-11 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种腱膜支架及其制备方法和应用,涉及生物材料技术领域。本发明提供的腱膜支架的制备方法,包括以下步骤：将腱膜细胞破碎、然后破碎细胞核,再通过DNA酶去除脱氧核糖核酸,最后经过切片制备得到腱膜支架。本发明的制备方法简单快捷,成本低,不涉及有害化学物质。本发明的腱膜支架,生物活性好,无免疫排斥反应,柔韧性好,能有效防止细胞透过,避免肌腱粘连。(The invention provides an aponeurosis scaffold and a preparation method and application thereof, and relates to the technical field of biological materials. The preparation method of the aponeurosis scaffold provided by the invention comprises the following steps: and (3) breaking the aponeurosis cells, then breaking cell nuclei, removing deoxyribonucleic acid by using DNase, and finally slicing to obtain the aponeurosis scaffold. The preparation method is simple and quick, has low cost and does not relate to harmful chemical substances. The aponeurosis scaffold has good biological activity, no immunological rejection and good flexibility, can effectively prevent cells from permeating and avoid tendon adhesion.)

腱膜支架及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物材料技术领域，尤其是涉及一种腱膜支架及其制备方法和应用。

背景技术

随着社会机械化的发展和体育竞技的普及，肌腱损伤的发病率逐年上升，造成巨大的经济负担和社会负担。据统计，肌腱疾病占骨骼肌系统疾病的19.2％，高达30～40％的屈肌腱损伤后发生肌腱粘连，由肌腱粘连引起的手术约900万例/年。肌腱粘连表现为肌腱的滑动功能丧失和邻近关节的运动功能受限，严重影响患者生活质量和工作能力。临床中，肌腱粘连常以松解手术为主，辅以生物材料或药物治疗，治疗效果不佳。

肌腱粘连是肌腱愈合过程中发生的病理现象。肌腱愈合包括内源性愈合和外源性愈合，其中，内源性愈合是由肌腱内的肌腱细胞增殖而完成的肌腱自身修复过程；而外源性愈合则是肌腱周围的滑膜、肉芽组织长入肌腱损伤区域形成肉芽组织，通过肉芽组织生长而完成肌腱的修复。外源性愈合常常是导致肌腱粘连的主要因素。因此，阻止外源性愈合，使损伤肌腱尽可能通过内源性愈合完成自身修复，是避免发生粘连的关键。

为此，已有研究针对预防肌腱粘连的方法和理论进行了深入研究，如肌腱缝合技术的改良、术后早期功能锻炼、口服药物以及在肌腱和周围组织之间放置阻隔外源性愈合的物理屏障等，并开发了多种治疗产品，但这些产品在取得一定治疗效果的同时仍存在严重缺陷：

(1)可吸收聚乳酸防粘连屏障膜：来源于医用合成高分子，呈薄膜状，置于肌腱和腱周组织之间形成物理屏障，用于防治肌腱粘连。但其仅可作为机械屏障，缺乏生物活性，且存在强度较低，柔韧性较差，免疫排异反应以及降解速度缓慢的缺点，常在局部形成纤维包块。

(2)透明质酸凝胶：属多糖类，具备粘弹性，可维持润滑作用，在术中涂抹于肌腱周围起着立体阻隔的作用，防止术后粘连。但其属液态易流动物质，具有向低处流动的特点，在临床实际应用中会随患肢***改变而随切口内引流条流出体外，从而影响治疗效果，另外，其降解需要蛋白酶参与，大面积涂抹或注射时偶尔出现荨麻疹或皮肤瘙痒感。

(3)抗炎药物：应用于肌腱损伤术后抗炎防粘连。由于肌腱损伤后炎症反应是粘连的诱发因素，故临床应用抗炎药物的达到抑制粘连的效果。但因需大剂量口服，属于全身给药，胃肠道反应较大，且局部药物浓度较低，临床治疗效果存在争议。

(4)粘连松解术：应用外科手术的方法切除腱周粘连组织，人为造成肌腱和腱周组织的间隔，恢复肌腱的滑动功能。但此方法是其他治疗方法失效后的选择，属于临床治疗最后一步，因肌腱损伤后极易纤维化愈合的特点，故此手术且常常陷入“粘连－松解－再粘连”的治疗循环，严重影响患者身心健康。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种腱膜支架的制备方法，该制备方法简单快捷，成本低，不涉及有害化学物质。

本发明的第二目的在于提供一种腱膜支架，该腱膜支架生物活性好，无免疫排斥反应，柔韧性好，能有效防止细胞透过，避免肌腱粘连。

本发明的第三目的在于提供一种腱膜支架在制备防止肌腱粘连产品中的应用。

为了解决上述技术问题，特采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种腱膜支架的制备方法，包括以下步骤：将腱膜细胞破碎、然后破碎细胞核，再通过DNA酶去除脱氧核糖核酸，最后经过切片制备得到腱膜支架。

作为进一步技术方案，所述将腱膜细胞破碎前还包括第一次漂洗；

优选地，所述第一次漂洗的漂洗液包括含有抗凝血剂的缓冲液，抗凝血剂优选为肝素，缓冲液优选为PBS缓冲液；

优选地，所述第一次漂洗的时间为20-40min，优选为30min。

作为进一步技术方案，所述将腱膜细胞破碎为将腱膜置于表面活性剂溶液中震荡；

优选地，所述表面活性剂溶液包括NP-40溶液或Triton X-100溶液，优选为TritonX-100溶液；

优选地，所述Triton X-100溶液的浓度为1-3％(w/v)，优选为2％(w/v)；

优选地，所述震荡的温度为2-10℃，优选为4℃；

优选地，所述震荡的时间为18-30h，优选为24h。

作为进一步技术方案，所述破碎细胞核为将腱膜置于表面活性剂溶液中震荡；

优选地，所述表面活性剂溶液包括SDS溶液、甘氨胆酸钠溶液或牛磺胆酸钠溶液，优选为SDS溶液；

优选地，所述SDS溶液的浓度为0.1-0.5％(w/v)，优选为0.25％(w/v)；

优选地，所述震荡的温度为2-10℃，优选为4℃；

优选地，所述震荡的时间为18-30h，优选为24h。

作为进一步技术方案，所述通过DNA酶去除脱氧核糖核酸为将腱膜置于DNA酶溶液中消化；

优选地，所述DNA酶溶液的浓度为0.5-2g/L，优选为1g/L；

优选地，所述消化的温度为36-38℃，优选为37℃；

优选地，所述消化的时间为0.5-1.5h，优选为1h。

作为进一步技术方案，所述切片为将腱膜切至150-250μm厚度，优选为200μm厚度。

作为进一步技术方案，所述将腱膜细胞破碎和破碎细胞核之间还包括第二次漂洗；

优选地，所述破碎细胞核和通过DNA酶去除脱氧核糖核酸之间还包括第三次漂洗；

优选地，所述通过DNA酶去除脱氧核糖核酸和切片之间还包括第四次漂洗；

优选地，所述切片后还包括第五次漂洗。

作为进一步技术方案，所述第二次漂洗、第三次漂洗、第四次漂洗和第五次漂洗的漂洗液均独立的包括缓冲液，缓冲液优选为PBS缓冲液；

优选地，所述第二次漂洗、第三次漂洗和第四次漂洗的时间均独立的为20-40min，优选为30min；

优选地，所述第五次漂洗的时间为5-15min，优选为10min。

第二方面，本发明提供了一种腱膜支架。

第三方面，本发明提供了一种腱膜支架在制备防止肌腱粘连产品中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的腱膜支架及其制备方法和应用具有如下有益效果：

本发明提供的腱膜支架的制备方法，以动物的腱膜组织为原料，首先将腱膜细胞破碎，去除细胞膜；然后破碎细胞核，除去核膜及大部分核酸；再通过DNA酶去除残留脱氧核糖核酸，避免外源脱氧核糖核酸或蛋白与伤口接触引起免疫排斥反应；最后将腱膜切片，得到性能良好的腱膜支架。本发明的制备方法简单快捷，成本低，不涉及有害化学物质。

本发明的腱膜支架，该腱膜支架为动物源性生物材料，生物活性好，无免疫排斥反应，柔韧性好，能有效防止细胞透过，避免肌腱粘连。

附图说明

为了更清楚地说明本发明

具体实施方式

或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的猪腱膜及本发明的猪腱膜支架图；

图2A为本发明试验例1提供的猪腱膜及本发明猪腱膜支架的行苏木精-伊红(H&E)染色图，上行放大倍数为100X，下行放大倍数为200X；

图2B为本发明试验例2提供的猪腱膜及本发明猪腱膜支架的Masson三色染色图，上行放大倍数为100X，下行放大倍数为200X；

图3为本发明试验例3提供的结晶紫染色图。

具体实施方式

下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

第一方面，本发明提供了一种腱膜支架的制备方法，包括以下步骤：将腱膜细胞破碎、然后破碎细胞核，再通过DNA酶去除脱氧核糖核酸，最后经过切片制备得到腱膜支架。

本发明的腱膜来源于动物腱膜组织，例如猪腱膜组织、羊腱膜组织和牛粘膜组织等。本发明的腱膜支架的制备方法以动物的腱膜组织为原料，首先将腱膜细胞破碎，去除细胞膜；然后破碎细胞核，除去核膜及大部分核酸；再通过DNA酶去除残留脱氧核糖核酸，避免外源脱氧核糖核酸或蛋白与伤口接触引起免疫排斥反应；最后将腱膜切片，得到性能良好的腱膜支架。本发明的制备方法简单快捷，成本低，不涉及有害化学物质。

在一些优选的实施方式中，所述将腱膜细胞破碎前还包括第一次漂洗。新鲜的动物腱膜组织表面带有血渍，因此，首先要对腱膜组织进行清洗，去除腱膜组织表面的血渍。

优选地，所述第一次漂洗的漂洗液包括含有抗凝血剂的缓冲液，抗凝血剂优选为肝素，缓冲液优选为PBS缓冲液。

在本发明中，为了保护腱膜组织的生物活性不被破坏，在制备过程中需要将腱膜维持在适宜的环境。抗凝血剂有助于血渍的去除，因此，本发明采用含有抗凝血剂，pH为7.2-7.4的缓冲液对腱膜组织进行漂洗。抗凝血剂包括但不限于肝素，或者本领域技术人员所熟知的其他抗凝血剂；缓冲液包括但不限于PBS缓冲液，或者本领域技术人员所熟知的其他能够用于生物材料的缓冲液。

优选地，所述第一次漂洗的时间为20-40min，优选为30min。

在本发明中，第一次漂洗的时间典型但非限制性的为20min、24min、28min、32min、36min或40min，优选为30min。

通过对抗凝剂、缓冲液和漂洗时间的进一步优化和调整，使得腱膜组织的血渍被充分去除。

在一些优选的实施方式中，所述将腱膜细胞破碎为将腱膜置于表面活性剂溶液中震荡。表面活性剂可以溶解细胞膜表面的脂，改变细胞膜的通透性，从而达到破碎细胞的目的，表面活性剂破碎细胞相较于其他破碎细胞的方法温和，因此，本发明采用表面活性剂的方法破碎细胞。

优选地，所述表面活性剂溶液包括但不限于NP-40溶液或Triton X-100溶液，或者本领域技术人员所熟知的其他较为温和的表面活性剂，优选为Triton X-100溶液。本发明的腱膜为生物材料，具有生物活性，因此在破碎细胞膜时要采用破坏性小的表面活性剂，尽可能的保护腱膜的生物活性。

优选地，所述Triton X-100溶液的浓度典型但非限制性的为1％(w/v)、1.4％(w/v)、1.8％(w/v)、2.2％(w/v)、2.6％(w/v)或3％(w/v)，优选为2％(w/v)。

优选地，所述震荡的温度典型但非限制性的为2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃，优选为4℃。在低温条件下有助于保持腱膜的生物活性。

优选地，所述震荡的时间典型但非限制性的为18h、20h、22h、24h、26h、28h或30h，优选为24h。

通过对破碎细胞操作条件的进一步优化和调整，使得在不破坏腱膜生物活性的前体下，充分破碎细胞，去除细胞膜和基质。

在一些优选的实施方式中，所述破碎细胞核为将腱膜置于表面活性剂溶液中震荡。在本发明中，核膜的破碎同样采用表面活性剂破碎，由于核膜较细胞膜结构不同，更难破碎，因此需采用破膜效果更好的表面活性剂。

优选地，所述表面活性剂溶液包括但不限于SDS溶液、甘氨胆酸钠溶液或牛磺胆酸钠溶液，或者本领域技术人员所熟知的能够用于破碎细胞核的表面活性剂溶液，优选为SDS溶液。

优选地，所述SDS溶液的浓度典型但非限制性的为0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.4％(w/v)或0.5％(w/v)，优选为0.25％(w/v)。

优选地，所述震荡的温度典型但非限制性的为2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃，优选为4℃。

优选地，所述震荡的时间典型但非限制性的为18h、20h、22h、24h、26h、28h或30h，优选为24h。

通过对破碎细胞核操作条件的进一步优化和调整，使得充分破碎细胞核，去除大部分核酸。

在一些优选的实施方式中，所述通过DNA酶去除脱氧核糖核酸为将腱膜置于DNA酶溶液中消化。将细胞膜和细胞核破碎后，腱膜上仍会有少量脱氧核糖核酸残留，需要将这些脱氧核糖核酸去除。在本发明中，采用DNA酶将这些残留的脱氧核糖核酸降解去除。

优选地，所述DNA酶溶液的浓度典型但非限制性的为0.5g/L、0.6g/L、0.8g/L、1g/L、1.2g/L、1.4g/L、1.6g/L、1.8g/L或2g/L，优选为1g/L。

优选地，所述消化的温度为典型但非限制性的36℃、36.4℃、36.8℃、37.2℃、37.6℃或38℃，优选为37℃。

优选地，所述消化的时间为典型但非限制性的0.5h、0.7h、0.9h、1.1h、1.3h或1.5h，优选为1h。

通过对去除残留脱氧核糖核酸操作条件的进一步优化和调整，使得充分去除腱膜上残留的脱氧核糖核酸。

在一些优选的实施方式中，所述切片为将腱膜切至150-250μm厚度，优选为200μm厚度。在本发明中，腱膜厚度典型但非限制性的为150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、210μm、220μm、230μm、240μm或250μm。以上厚度的腱膜具有良好的柔韧性，能有效防止细胞透过。

在一些优选的实施方式中，所述将腱膜细胞破碎和破碎细胞核之间还包括第二次漂洗。

优选地，所述破碎细胞核和通过DNA酶去除脱氧核糖核酸之间还包括第三次漂洗；

优选地，所述通过DNA酶去除脱氧核糖核酸和切片之间还包括第四次漂洗；

优选地，所述切片后还包括第五次漂洗。

在本发明中，将腱膜细胞破碎、破碎细胞核和通过DNA酶去除脱氧核糖核酸三个步骤均采用了不同的试剂，为了避免上个步骤的试剂对下个步骤的影响，充分发挥试剂的作用，需要增加第二次漂洗、第三次漂洗和第四次漂洗以去除上一步骤中的试剂残留；为了保护切片后腱膜的生物活性，去除碎屑，在切片后需要进行第五次漂洗。

在一些优选的实施方式中，所述第二次漂洗、第三次漂洗、第四次漂洗和第五次漂洗的漂洗液均独立的包括但不限于缓冲液，缓冲液优选为PBS缓冲液。为了避免腱膜生物活性发生改变，本发明采用缓冲液对腱膜进行漂洗。

优选地，所述第二次漂洗、第三次漂洗和第四次漂洗的时间均独立的典型但非限制性的为20min、24min、28min、32min、36min或40min，优选为30min。

通过对第二次漂洗、第三次漂洗和第四次漂洗的时间进一步优化和调整，使得充分去除上一步骤中的试剂残留。

优选地，所述第五次漂洗的时间典型但非限制性的为5min、7min、9min、11min、13min或15min，优选为10min。切片后，采用缓冲液对腱膜进行漂洗润湿，有助于腱膜的保存。

第二方面，本发明提供了一种腱膜支架。

本发明的腱膜支架，该腱膜支架为动物源性生物材料，生物活性好，无免疫排斥反应，柔韧性好，可直接于-80℃保存，保存方便。

第三方面，本发明提供了一种腱膜支架在制备防止肌腱粘连产品中的应用。

本发明的腱膜支架能有效防止细胞透过，能够应用于制备防止肌腱粘连的产品。

下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1

一种腱膜支架的制备方法，包括以下步骤：

选取新鲜猪四肢，无菌条件下取下猪的腱膜组织，如图1左图(native)所示，剪切成大小约2cm*1cm大小，置于15mL无菌离心管内，肝素PBS缓冲液，漂洗30分钟，置于实验室震荡器内进行震荡，速度设定为80转/分钟，温度设定为4℃。震荡液体依次为：2％TritonX-100溶液24小时，无菌PBS溶液30分钟，0.25％SDS溶液24小时。震荡完成后，用无菌PBS溶液漂洗30分钟，1mg/mL DNA酶37℃消化1小时，无菌PBS溶液漂洗30分钟。置于冰冻切片机内，设定切片厚度为200微米，将组织切成200微米厚的薄片。无菌PBS溶液漂洗10分钟，制备得到腱膜支架，如图1右图(dTendon membrane)所示。

对比例1

一种临床常用的防肌腱粘连膜PLA membrane，成分为聚乳酸(PLA)。

试验例1行苏木精-伊红(H&E)染色

将未经处理的猪腱膜(native)和实施例1制备得到的腱膜支架(dTendonmembrane)，经***溶液固定、梯度酒精脱水硬化、二甲苯透明、石蜡浸透等过程，制成石蜡切片，使用切片机制成5微米厚的组织切片。取干燥的切片，置于二甲苯缸内脱蜡10min，梯度酒精复水，蒸馏水洗去酒精，苏木素染液15min，盐酸分色30秒，伊红溶液染色3min，二甲苯透明，中性树脂封片。光学显微镜下观察结构，如图2A所示，图中红色部分为细胞外基质部分，蓝色颗粒为细胞核结构。

从图2A中可以看出，本发明的腱膜支架结构与未经处理的腱膜类似，结构蛋白未发生断裂，并且本发明的腱膜支架的细胞已被去除。

试验例2Masson三色染色

将未经处理的猪腱膜(native)和实施例1制备得到的腱膜支架(dTendonmembrane)，经***溶液固定、梯度酒精脱水硬化、二甲苯透明、石蜡浸透等过程，制成石蜡切片，使用切片机制成5微米厚的组织切片。石蜡切片常规脱蜡至水，天青石蓝10min，蒸馏水洗去，masson甲染液10min，蒸馏水洗去，masson乙染液1min，蒸馏水洗去，masson丙染液2min，蒸馏水洗去，常规脱水封片。组织内胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色，如图2B所示。

从图2B中可以看出，本发明的腱膜支架内胶原蛋白保留完好，且未见明显断裂，说明本发明的腱膜支架保留了较好的原腱膜结构。

试验例3防粘连检测

将实施例1制备得到的腱膜支架(dTendon membrane)和对比例1的防肌腱粘连膜(PLAmembrane)，修剪成为直径6.5毫米的圆形，置于24孔transwell孔板小室内，与transwell膜进行贴合。在下室加入600微升含10％胎牛血清的培养基，上室接种NIH 3T3成纤维细胞(密度：2x10⁶个/孔)，并做空白对照(control)，细胞培养箱中孵育24小时、48小时、72小时，检测细胞的穿透效率。

结晶紫染色：transwell孔板孵育24小时、48小时、72小时后，吸去孔板内的培养基，PBS洗3次，多聚甲醛固定30分钟，取出上室，吸干上室固定液，移到预先加入约800微升的0.1％结晶紫染液的孔中，室温染色30分钟。轻轻用清水冲洗浸泡数次，取出上室，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去transwell滤膜上表面的细胞。自然晾干后，光学显微镜下观察，采集图片，如图3所示。

从图3中可以看出，对照组(control)24小时有少量细胞穿透，48小时穿透明显增多，72小时穿透的细胞铺满滤膜低表面。PLA membrane组24小时无细胞穿透，48小时有部分细胞穿透，72小时穿透细胞明显增多。本发明的腱膜支架组在24小时、48小时、72小时均未观察到有细胞穿透。

综上，本发明方法制备的腱膜支架，细胞成分完全去除，保留细胞外基质，具有较强的防止细胞穿透的能力，能够用于防止肌腱粘连。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。