新型冠状病毒rbd蛋白的制备方法以及新型冠状病毒疫苗
阅读说明：本技术 新型冠状病毒rbd蛋白的制备方法以及新型冠状病毒疫苗 (Preparation method of novel coronavirus RBD protein and novel coronavirus vaccine ) 是由 董飚 刘瑜 戚世乾 杨荔 张体重 陈治安 杨青哲 干春梅 于 2021-07-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了新型冠状病毒RBD蛋白的制备方法以及新型冠状病毒疫苗,涉及基因工程技术领域。本发明公开的制备方法采用高效表达RBD蛋白的如SEQ ID NO.1所示核酸序列表达RBD蛋白,有效提高RBD蛋白的表达水平,大幅提高RBD蛋白产量,降低成本,本发明为新型冠状肺炎的疫苗研发奠定了基础。(The invention discloses a preparation method of a novel coronavirus RBD protein and a novel coronavirus vaccine, and relates to the technical field of genetic engineering. The preparation method disclosed by the invention adopts the nucleotide sequence which is expressed with high efficiency and is shown as SEQ ID NO.1 to express the RBD protein, so that the expression level of the RBD protein is effectively improved, the yield of the RBD protein is greatly improved, the cost is reduced, and the invention lays a foundation for the research and development of novel vaccines for coronary pneumonia.)
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及新型冠状病毒RBD蛋白的制备方法以及新型冠状病毒疫苗。
背景技术
新型冠状病毒是通过刺突蛋白S与ACE2受体作用来感染人体细胞，且较SARS病毒而言，新型冠状病毒的S蛋白与ACE2的亲和力更强，因此S蛋白有助于疫苗的研发，该序列已发布于NCBI(MN908947.3)。后续通过解析S蛋白的结构发现，S1亚基中的RBD会经历铰链式运动，该运动可使受体的可结合部位不稳定，因此S蛋白的RBD(319-541aa)区域可作为疫苗设计的位点。
目前针对RBD蛋白的表达系统的蛋白产量较低。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供新型冠状病毒RBD蛋白的制备方法以及新型冠状病毒疫苗。本发明的制备方法采用高效表达RBD蛋白的核酸序列表达RBD蛋白，有效提高RBD蛋白的表达水平，大幅提高RBD蛋白产量，降低成本，本发明为新型冠状肺炎的疫苗研发奠定了基础。
本发明是这样实现的：奠定了基础
一方面，本发明提供一种分离的核酸分子，其编码新型冠状病毒的RBD蛋白，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明通过对野生型新型冠状病毒的S(Spike)基因的RBD序列进行分析，依毕赤酵母密码子偏好性、结合GC含量以及CpG岛等多种参数对该野生型RBD序列进行密码子优化，得到了能够在毕赤酵母中高效表达的核酸序列，如SEQ ID NO.1所示，采用该酸序列表达RBD蛋白，能够给大幅度提高RBD蛋白产量，降低成本，为新型冠状肺炎的疫苗研发奠定基础。
另一方面，本发明提供一种重组载体，其含如上所述的核酸分子。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述重组载体为克隆载体或表达载体。
需要说明的是，本领域技术人员根据需要，可以将上述核酸分子连接至任何合适的载体，包括但不限于克隆载体或表达载体。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述重组载体为pPICZαA。
另一方面，本发明提供一种重组细胞，其含有如上所述的核酸分子，或如上所述的重组载体。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述重组细胞为昆虫细胞、哺乳动物细胞、细菌或酵母。
需要说明的是，本领域技术人员根据需要，可以将上述核酸分子或上述重组载体导入任何感兴趣的宿主细胞中，包括但不限于昆虫细胞、哺乳动物细胞、细菌(如大肠杆菌)或酵母，无论何种宿主细胞，均属于本发明的保护范围。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述酵母为毕赤酵母。
另一方面，本发明提供一种新型冠状病毒RBD蛋白的制备方法，其包括：将如上所述的核酸分子导入宿主细胞并进行表达，从培养产物中获得RBD蛋白。
该制备方法采用如SEQ ID NO.1所示核酸分子表达生产RBD蛋白，能够大幅度提高RBD蛋白产量，降低成本，为新型冠状肺炎疫苗的开发奠定基础。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述宿主细胞为毕赤酵母。
毕赤酵母系统为真核细胞表达系统，具有低成本，高产出，具有翻译后修饰等优点，得到的RBD蛋白能够保持其免疫原性，用该方法得到的RBD蛋白免疫动物，能够刺激机体产生有效的中和抗体。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述核酸分子以连接在表达载体上的形式导入所述宿主细胞。
可选地，在本发明的一些实施方案中，所述表达载体为pPICZαA。
可选地，在本发明的一些实施方案中，在所述表达载体上，所述核酸分子的下游连接有EK蛋白酶编码序列。
可选地，在本发明的一些实施方案中，在所述表达载体上，所述EK蛋白酶编码序列的下游连接有His标签序列。
通过EK蛋白酶编码序列和His标签序列能够便于RBD蛋白的纯化，可更高效地纯化出RBD蛋白。
另一方面，本发明提供如上所述的核酸分子、如上所述的重组载体、或如上所述的重组细胞在制备新型冠状病毒疫苗中的应用。
另一方面，本发明提供一种新型冠状病毒疫苗，其含有由如上任一项所述的方法制得的RBD蛋白。
本发明提供的新型冠状病毒疫苗能够有效地刺激机体产生中和抗体，抵抗新型冠状病毒的侵袭感染。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1中pPICZαA载体的图谱；
图2为实施例1中RBD蛋白SDS-PAGE结果图；
图3为RBD蛋白纯化westernblot验证结果图；
图4为实施例2中第一次免疫后3周的血清Elisa检测结果，图中：1-5：注射Tris+Al佐剂的小鼠；6-9：注射RBD 30μg+Al佐剂的小鼠；
图5为实施例2中第二次免疫后3周的血清Elisa检测结果，图中：1-5：注射Tris+Al佐剂的小鼠；6-9：注射RBD 30μg+Al佐剂的小鼠；10：为第一次免疫后6号小鼠的血清保留样品；
图6为实施例2中的中和抗体的检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
RBD蛋白的制备
对野生型新型冠状病毒的S(Spike)基因的RBD序列分析(SEQ ID NO.2)，GC含量以及CpG岛等参数，并依据毕赤酵母密码子偏好性等参数对该序列进行密码子优化，且在所优化的RBD序列(SEQ ID NO.1)的C端加EK蛋白酶(核酸序列为：gatgatgacgacaag)及6×His(核酸序列为：catcatcatcatcatcat)标签序列，采用基因合成获得目的基因，将野生型和优化后的RBD分别克隆到表达载体pPICZαA上(图1)。随后将重组表达质粒pPICZαA-RBD通过SacⅠ进行线性化，并将线性化后的质粒电转至酵母感受态细胞X33中，涂YPDS(含100μg/mLZ+)平板，30℃倒置培养约2～3天。待单克隆菌落形成，利用PCR技术检测单克隆，各挑选10个PCR验证为阳性克隆菌落接种至BMGY培养基中，28.5℃培养至OD600＝2～6后更换BMMY培养基进行诱导，并将重悬后的菌液放至28.5℃培养70h后，取100μL培养物12000rpm离心5min后，取80μL上清于1.5mL离心管中，并在其中加入20μL 5×Loading Buffer，沸水浴10min，利用SDS-PAGE与Western Blot检测蛋白分泌表达情况，表明优化后的RBD蛋白表达水平远高于野生型的RBD蛋白表达水平(见图2)。
其次，从中挑选RBD蛋白表达量高的菌株进行蛋白表达纯化。首先，将菌株接种至BMGY培养基中，28.5℃培养至OD600＝2～6后更换BMMY培养基进行诱导72h，每24h补加0.5％的甲醇，72h后，离心收集上清，并通过0.22μm过滤后，经HisTrap初步纯化，加入EK蛋白酶，4℃过夜，WB验证His标签切掉后，再经离子交换和分子筛进一步纯化，最后用由20mM Tris-HCl(pH8.0)和150mMNaCl组成的缓冲液中洗脱，至-80℃保存使用。经westernblot验证发现(图3)，未加甲醇诱导的上清中无RBD蛋白产生，加甲醇诱导后上清中可分泌RBD蛋白，表明该蛋白是目的蛋白。随后进行纯化，经Spike蛋白抗体和His抗体孵育后，均检测到目的蛋白，进一步证明所纯化的蛋白是正确的。最后使用EK蛋白酶将His标签切掉，以免影响RBD蛋白功能，经His抗体检测，发现并未出现目的条带，但Spike抗体孵育可检测到目的条带，表明His标签已切掉。
实施例2
实施例1的RBD蛋白刺激机体产生抗体
通过肌肉注射不同剂量(0μg，30μg)的RBD蛋白(由实施例1提供)于6-8周的Balb/c小鼠体内，免疫两次，间隔时间为42天，通过眼部取血方式分别采集注射后3周的小鼠血清，以RBD蛋白为抗原，通过Elisa检测血清中抗体产生情况(图4和图5)，图4表明一次免疫后，注射30μg的小鼠(6-9)较0μg的小鼠(1-5)而言，产生少量针对新型冠状病毒抗体，但二次免疫后(图5)，注射30μg的小鼠(6-9)均产生大量针对新型冠状病毒的抗体。图5中10号样品是第一次免疫中的6号样品作为分析的正对照。并采用中国食品药品检定研究院所发布的新冠病毒的假病毒中和抗体检测方法来测定血清中的中和抗体产生(图6)，发现二次免疫后，注射30μg的小鼠(6-9)的血清中均有中和抗体产生。
综上，本发明通过使用密码子优化新型冠状病毒S(Spike)基因的RBD区域，获得了能够在酵母中高效表达RBD蛋白的基因序列(SEQ ID NO.1)，并构建出高产RBD蛋白的酵母菌株，大幅度增高RBD蛋白产量。通过毕赤酵母表达并纯化新型冠状病毒RBD蛋白具有以下优势：(1)经密码子优化后的RBD的蛋白表达量高，且所构建载体上带有EK蛋白酶以及His标签序列，可更高效地纯化出RBD蛋白；(2)通过毕赤酵母表达RBD蛋白，最大程度上保证了蛋白的产量及活性，降低成本，为新型冠状肺炎疫苗的开发奠定了基础。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学华西医院，四川至善唯新生物科技有限公司
<120> 新型冠状病毒RBD蛋白的制备方法以及新型冠状病毒疫苗
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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