一种（s）-2-氯-1-（3，4-二氟苯基）乙醇的生物合成方法
阅读说明：本技术 一种（s）-2-氯-1-（3，4-二氟苯基）乙醇的生物合成方法 (Biosynthesis method of (S) -2-chloro-1- (3, 4-difluorophenyl) ethanol ) 是由 曹金辉 宗匡 喻海亮 曾鹏 刘建明 于 2021-07-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的生物合成方法,其包括如下步骤：酮基还原酶野生型基因进行突变处理、添加酶切位点、制备重组质粒、导入菌株、菌株的分泌和表达、反应。本发明提供的生物合成方法有着成本更低、选择性更高的优点。(The invention discloses a biosynthesis method of (S) -2-chloro-1- (3, 4-difluorophenyl) ethanol, which comprises the following steps: carrying out mutation treatment on the ketoreductase wild type gene, adding enzyme cutting sites, preparing recombinant plasmids, introducing a strain, and carrying out secretion, expression and reaction on the strain. The biosynthesis method provided by the invention has the advantages of lower cost and higher selectivity.)
技术领域
本发明涉及生物合成技术领域，特别是涉及一种(S)-2-氯-1-(3，4-二氟苯基)乙醇的生物合成方法。
背景技术
替卡格雷(又名替格瑞洛)是阿斯利康开发的新一代抗凝血药物，用于急性冠脉综合症和支架置入术后的抗栓治疗，2011年美国FDA批准上市。与目前的临床一线药物氯吡格雷相比，替卡格雷具有服用后可直接起效、停药后血小板功能可很快恢复和降低心血管死亡和心肌梗死的优点，因而具有良好的市场前景。美国专利US7250419报道了此药物的合成路线，中间体10(如下图)是合成替卡格雷的三个关键中间体之一，具有很高的经济价值。如US7067663所述，中间体10可以通过薄荷醇作为手性辅基的不对称环丙烷化来合成，但是成本很高。也有专利(EP2589587A1)报道通过硝基酮制备中间体10的方法，酮基还原酶作为催化剂，但是产物收率低，手性值只有80％。EP2589587A1报道的另外一条路线是通过CBS催化还原得到(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇(手性氯醇)，但是手性值只有90-93％，需要反复精制，而且催化剂的价格较高。CN109112166A报道使用生物酶催化剂代替CBS合成手性氯醇，反应温和，成本有所降低，但是底物浓度依然不够高(50-100克/升)、反应时间长，以及手性值依然需要提升(一般手性产品需要≥99.5％)。总之，本领域需要一种成本更低、选择性更高的合成手性氯醇的方法。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有替卡格雷中间体制备方法中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明其中一个目的是，克服现有替卡格雷中间体制备方法的不足，提供一种(S)-2-氯-1-(3，4-二氟苯基)乙醇的生物合成方法。
为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种(S)-2-氯-1-(3，4-二氟苯基)乙醇的生物合成方法，其包括如下步骤：
酮基还原酶野生型基因进行突变处理：将酮基还原酶基因，酮基还原酶的基因序列如Seq ID No.1所示进行突变处理，处理后得到酮基还原酶突变子基因，酮基还原酶突变子基因序列如Seq ID No.2所示。
添加酶切位点：向酮基还原酶突变子基因中插入双酶切位点；
制备重组质粒：将酮基还原酶突变子基因插入到表达载体中得到重组质粒；
导入菌株：将带有酮基还原酶基因的重组质粒导入到菌株中得到重组表达菌株；
菌株的分泌和表达：将重组表达菌株在培养液中诱导表达然后收集酶液；
反应：将酶液进在水/有机双相体系中，进行反应制备(S)-2-氯-1-(3，4-二氟苯基)乙醇。
作为本发明所述(S)-2-氯-1-(3，4-二氟苯基)乙醇的生物合成方法，其中：酮基还原酶野生型基因进行突变处理中，突变处理的方式为易错PCR。
作为本发明所述(S)-2-氯-1-(3，4-二氟苯基)乙醇的生物合成方法，其中：添加酶切位点中，双酶切位点为NdeI/HindIII。
作为本发明所述(S)-2-氯-1-(3，4-二氟苯基)乙醇的生物合成方法，其中：制备重组质粒中，表达载体为pET21a(+)22。
作为本发明所述(S)-2-氯-1-(3，4-二氟苯基)乙醇的生物合成方法，其中：导入菌株中，所述菌株为BL21(DE3)。
作为本发明所述(S)-2-氯-1-(3，4-二氟苯基)乙醇的生物合成方法，其中：菌株的分泌和表达中，所述培养液为LB培养基。
作为本发明所述(S)-2-氯-1-(3，4-二氟苯基)乙醇的生物合成方法，其中：菌株的分泌和表达中，还包括诱导培养，当培养基中OD600＝1.0后，加入0.2mM IPTG并且保持温度为30℃。
作为本发明所述(S)-2-氯-1-(3，4-二氟苯基)乙醇的生物合成方法，其中：述反应中，所述水/有机双相体系为质量分数40％的水和60％的乙醇互溶的水/有机双向体系。
作为本发明所述(S)-2-氯-1-(3，4-二氟苯基)乙醇的生物合成方法，其中：反应中，反应体系中还包括NADP。
作为本发明所述(S)-2-氯-1-(3，4-二氟苯基)乙醇的生物合成方法，其中：NADP的浓度维持0.05～1.0mM。
本发明提供了一种(S)-2-氯-1-(3，4-二氟苯基)乙醇的生物合成方法，有着成本更低、选择性更好的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明中合成替卡格雷关键手性中间体(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的过程图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
本发明设计的具体原理为使用酮基还原酶突变子合成替卡格雷关键手性中性体(S)-2-氯-1-(3，4-二氟苯基)乙醇，涉及的具体反应过程如图1所示，酮基还原酶突变子来源为野生型酮基突变子，其具体的合成方法为：将酮基还原酶野生基因如Seq ID No.1所示，或者将酮基还原酶突变子基因如Seq ID No.2所示，两点加入酶切位点NdeI/HindIII，DNA酶切纯化后插入到表达载体pET21a(+)22中得到重组质粒，将重组质粒转化入BL21(DE3)中构建成重组表达菌株。上述重组菌株在LB培养基中培养到OD600＝1.0后，加入0.2mMIPTG并在30℃诱导培养4-5小时，离心收集菌体并超声破碎就得到野生型或者突变子粗酶液。将上述粗酶液加入到40％的质量分数的水和60％质量分数的乙醇互溶的水/有机双向体系中，同时在体系中维持NADP浓度为0.05～1.0mM进行反应。
实施例2
野生型酮基突变子的制备方法如下：
将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酮基还原酶野生基因序列如Seq IDNo.1所示，通过易错PCR的方式导入随机突变和(或者)基于酶蛋白结构/模拟底物对接而的导入的点饱和突变，然后进行高通量筛选，得到我方发明中野生型酮基突变子如Seq IDNo.2所示。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酮基还原酶野生基因进行转录翻译后的蛋白序列如Seq ID No.3所示，野生型酮基突变子翻译的蛋白序列如Seq ID No.4所示，野生型酮基突变子相较酮基还原酶野生基因相比有着87位的苯丙氨酸突变为酪氨酸，130位的半胱氨酸突变为苏氨酸或者亮氨酸或者甲硫氨酸、134位的异亮氨酸突变为甲硫氨酸、165位的酪氨酸突变为异亮氨酸、171位的赖氨酸突变为精氨酸或者组氨酸、198位的亮氨酸突变为色氨酸或者组氨酸的区别，Seq ID No.4表示了其中一种蛋白质序列的可能，但是其他各种蛋白质序列发生突变的可能性也有着相同的性能。
野生型酮基突变子基因除Seq ID No.2所示外，第259～261位更改为TAT、第388～390位更改为CTA或者ATG、第400～402位更改为ATG、第498～599位更改为ATT、第211～513位更改为CGT或者CAT、第598～600位更改为TGG或者CAT，还包括其中任一位点发生以上所述变化的任意情况。
实施例3
将诱导培养得到的酮基还原酶突变子酶液加入到水/有机相双相体系中，在葡萄糖脱氢酶/葡萄糖组成的高效辅酶再生系统协助下，对于实施例1中的生成过程进行复核，得到的底物转化率和产物手性率进行测量，得到的底物转化率多次实验后得到的结果均＞99.5％，最高的转化率99.9％，多次实验后产物的手性值均＞99.5％，最高手性值百分比＞99.5％。
实施例4
反应过程中底物转化率的测量如下：取反应液200微升至800微升溶剂，振荡混合、离心后上清继续在乙腈里稀释，进样分析。使用Agilent 5TC-C18(250×4.6mm)，检测波长264nm，流速1.0mL/min，柱温15℃，流动相为乙腈：水＝45：55(V/V)。底物出峰时间8.20分钟，产物出峰时间为11.63分钟。产物的手性值测量如下：将产物用流动相配制成0.1mg/ml的浓度进样分析，使用CHIRALPAK IA(150×4.6mm，5μm)手性柱，，检测波长264nm，流速1.0ml/min，柱温15℃,流动相为正己烷：乙醇＝98：2(V/V)。R-异构体出峰时间为13.52分钟，S-异构体出峰时间为11.73分钟。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 江西科苑生物股份有限公司
<120> 一种（S）-2-氯-1-（3，4-二氟苯基）乙醇的生物合成方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1035
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtctaata cagttctagt ttctggcgct tcaggtttta ttgccttgca tatcctgtca 60
caattgttaa aacaagatta taaggttatt ggaactgtga gatcccatga aaaagaagca 120
aaattgctaa gacaatttca acataaccct aatttaactt tagaaattgt tccggacatt 180
tctcatccaa atgctttcga taaggttctg cagaaacgtg gacgtgagat taggtatgtt 240
ctacacacgg cctctccttt tcattatgat actaccgaat atgaaaaaga cttattgatt 300
cccgcgttag aaggtacaaa aaacatccta aattctatca agaaatatgc agcagacact 360
gtagagcgtg ttgttgtgac ttcttcttgt actgctatta taacccttgc aaagatggac 420
gatcccagtg tggtttttac agaagagagt tggaacgaag caacctggga aagctgtcaa 480
attgatggga taaatgctta ctttgcatcc aagaagtttg ctgaaaaggc tgcctgggag 540
ttcacaaaag agaatgaaga tcacatcaaa ttcaaactaa caacagtcaa cccttctctt 600
ctttttggtc ctcaactttt cgatgaagat gtgcatggcc atttgaatac ttcttgcgaa 660
atgatcaatg gcctaattca taccccagta aatgccagtg ttcctgattt tcattccatt 720
tttattgatg taagggatgt ggccctagct catctgtatg ctttccagaa ggaaaatacc 780
gcgggtaaaa gattagtggt aactaacggt aaatttggaa accaagatat cctggatatt 840
ttgaacgaag attttccaca attaagaggt ctcattcctt tgggtaagcc tggcacaggt 900
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 3
<211> 344
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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His Ile Leu Ser Gln Leu Leu Lys Gln Asp Tyr Lys Val Ile Gly Thr
20 25 30
Val Arg Ser His Glu Lys Glu Ala Lys Leu Leu Arg Gln Phe Gln His
35 40 45
Asn Pro Asn Leu Thr Leu Glu Ile Val Pro Asp Ile Ser His Pro Asn
50 55 60
Ala Phe Asp Lys Val Leu Gln Lys Arg Gly Arg Glu Ile Arg Tyr Val
65 70 75 80
Leu His Thr Ala Ser Pro Phe His Tyr Asp Thr Thr Glu Tyr Glu Lys
85 90 95
Asp Leu Leu Ile Pro Ala Leu Glu Gly Thr Lys Asn Ile Leu Asn Ser
100 105 110
Ile Lys Lys Tyr Ala Ala Asp Thr Val Glu Arg Val Val Val Thr Ser
115 120 125
Ser Cys Thr Ala Ile Ile Thr Leu Ala Lys Met Asp Asp Pro Ser Val
130 135 140
Val Phe Thr Glu Glu Ser Trp Asn Glu Ala Thr Trp Glu Ser Cys Gln
145 150 155 160
Ile Asp Gly Ile Asn Ala Tyr Phe Ala Ser Lys Lys Phe Ala Glu Lys
165 170 175
Ala Ala Trp Glu Phe Thr Lys Glu Asn Glu Asp His Ile Lys Phe Lys
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Leu Thr Thr Val Asn Pro Ser Leu Leu Phe Gly Pro Gln Leu Phe Asp
195 200 205
Glu Asp Val His Gly His Leu Asn Thr Ser Cys Glu Met Ile Asn Gly
210 215 220
Leu Ile His Thr Pro Val Asn Ala Ser Val Pro Asp Phe His Ser Ile
225 230 235 240
Phe Ile Asp Val Arg Asp Val Ala Leu Ala His Leu Tyr Ala Phe Gln
245 250 255
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Gly Asn Gln Asp Ile Leu Asp Ile Leu Asn Glu Asp Phe Pro Gln Leu
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Arg Gly Leu Ile Pro Leu Gly Lys Pro Gly Thr Gly Asp Gln Val Ile
290 295 300
Asp Arg Gly Ser Thr Thr Asp Asn Ser Ala Thr Arg Lys Ile Leu Gly
305 310 315 320
Phe Glu Phe Arg Ser Leu His Glu Ser Val His Asp Thr Ala Ala Gln
325 330 335
Ile Leu Lys Lys Glu Asn Arg Leu
340
<210> 4
<211> 343
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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Asn Pro Asn Leu Thr Leu Glu Ile Val Pro Asp Ile Ser His Pro Asn
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85 90 95
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340
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