阅读说明：本技术 血小板裂解产物促进脐带干细胞活化并协同干预膝骨性关节炎的方法 (Method for promoting umbilical cord stem cell activation and synergistically intervening knee osteoarthritis by using platelet lysate ) 是由 单乐天 于 2020-07-10 设计创作，主要内容包括：血小板裂解产物促进脐带干细胞活化并协同干预膝骨性关节炎的方法,属于脐带干细胞应用技术领域。本发明提出了血小板裂解产物在制备脐带干细胞辅助剂中的应用和血小板裂解产物协同脐带干细胞在制备治疗膝骨性药物中的应用。本发明通过血小板裂解产物的制备,测定了血小板裂解产物纯度、细胞因子含量,测定脐带干细胞增殖活性、周期进展、细胞周期相关基因表达、划痕修复能力、趋化迁移能力和趋化迁移相关基因表达,大鼠行为学及组织病理学观察试验。验证了血小板裂解产物适合作为脐带干细胞的辅助剂,并且进一步明确了基于生长因子的血小板裂解产物作用于脐带干细胞的机制及其在膝骨性关节炎治疗中的协同应用。(A method for promoting the activation of umbilical cord stem cells and cooperatively intervening knee osteoarthritis by using platelet lysate belongs to the technical field of umbilical cord stem cell application. The invention provides application of a platelet lysate in preparing an umbilical cord stem cell adjuvant and application of the platelet lysate in preparing a medicament for treating knee osteoarthritis in cooperation with umbilical cord stem cells. The invention determines the purity and the cytokine content of the platelet lysate, determines the proliferation activity, the cycle progression, the cell cycle related gene expression, the scratch repair capability, the chemotactic migration capability and the chemotactic migration related gene expression of the umbilical cord stem cells, and performs behavioral and histopathological observation tests on rats. The platelet lysate is proved to be suitable for being used as the auxiliary agent of the umbilical cord stem cells, and the mechanism of the platelet lysate acting on the umbilical cord stem cells based on the growth factors and the synergistic application of the platelet lysate in the treatment of knee osteoarthritis are further defined.)

血小板裂解产物促进脐带干细胞活化并协同干预膝骨性关节 炎的方法

技术领域

本发明属于脐带干细胞应用技术领域，具体涉及血小板裂解产物促进脐带干细胞活化并协同干预膝骨性关节炎的方法。

背景技术

间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSCs）具有自我更新能力、多向分化潜能、旁分泌效应和免疫调节功能，可促进受损组织再生，是细胞治疗和再生医学的重要治疗工具。间充质干细胞的来源非常广泛，如骨髓、脂肪组织、经血等。脐带长期被认为是一种医疗废弃物，但与骨髓等来源的干细胞相比，脐带干细胞（human umbilical cord-derivedMSCs，huc-MSCs）具有更高的可塑性和更少的伦理约束，因此脐带是一种非常有前景干细胞来源。huc-MSCs不仅增殖速度快，扩增能力强，且具有不形成畸胎瘤或肿瘤和免疫调节能力强等优点。更有趣的是，huc-MSCs的免疫原性不如其他干细胞，这使得huc-MSCs更适合作为异体移植的候选细胞。

在生理条件下，血小板活化释放生长因子，血小板不仅在止血中发挥重要作用，而且在伤口愈合和组织再生中也发挥重要作用。血小板冻融裂解后，可获得血小板裂解产物（Platelet lysates，PL）。从PL中释放的主要因子包括血小板衍生生长因子（PDGF）、***（IGF），表皮生长因子（EGF）、纤维母细胞生长因子（FGF）、转化生长因子（TGF-β）和血管内皮细胞生长因子（VEGF）。这些生长因子可以促进细胞增殖、趋化和细胞外基质的产生、血管生成等。

MSCs在细胞治疗、组织工程、再生医学等临床应用中都需要一个分离和体外扩增的阶段，使其达到有临床意义的细胞数量。基于MSCs细胞治疗的临床应用中，存在一个主要的技术障碍，就是难以从低水平MSCs含量的组织中分离出MSCs，以及难以培养出足够质量和数量的MSCs。为实现MSCs的成功分离和快速扩增，需要在培养基中补充大量生物活性物质，如胎牛血清。目前，由于使用胎牛血清的免疫反应和人畜共患病感染相关安全问题，大多数研究将使用血清替代物作为培养基补充物，或选用无血清培养基，来替代胎牛血清的使用。然而，血清替代物或无血清培养基往往无法完全替代胎牛血清的作用，且成本高昂，不适用于MSCs大规模扩增。生长因子富集的PL具有巨大的潜力，它可以在一个培养周期内，使MSCs在无胎牛血清的情况下大规模扩增，同时保持基因组的稳定性，供临床使用。这种用法背后的科学原理是基于血小板中存在大量的生长因子，可促进干细胞增殖。然而，人血通常不能作为常规来源，即使它比胎牛血清更具有安全性。因此PL不适合作为胎牛血清的替代物，但仍可以在MSCs培养和应用阶段发挥辅助作用。

在现有技术中，已有关于血小板裂解产物扩增培养脐带干细胞的报道，此前公开了一种无动物血清、无异体蛋白的脐带间充质干细胞培养办法，但是该技术未提供血小板裂解产物对脐带干细胞增殖、趋化与再生相关的具体细胞分子机制，此外，在现有的研究报道中，血小板裂解产物对干细胞移植治疗的辅助作用尚缺乏动物实验方面的验证，针对以上问题本发明采用CCK-8法、流式细胞术鉴定、ELISA法、划痕实验、Transwell以及RT-PCR法，将血小板裂解产物与脐带干细胞进行优化组合，探究基于生长因子的血小板裂解产物作用于脐带干细胞的机制。此外，将血小板裂解产物与脐带干细胞联合用于膝骨性关节炎的治疗，从而提供了血小板裂解产物对干细胞移植治疗的辅助作用在体内动物实验方面的借鉴依据，同时也为膝骨性关节炎的临床应用提供了实验依据。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供血小板裂解产物促进脐带干细胞活化并协同干预膝骨性关节炎的方法。本发明证实了血小板裂解产物作为一种辅助剂用于促进和增强细胞治疗中的脐带干细胞，并且血小板裂解产物作为脐带干细胞应用的辅助补充，血小板裂解产物联合脐带干细胞应用于膝骨性关节炎治疗中的软骨修复作用机制。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

血小板裂解产物作为促进和增强细胞治疗中的脐带干细胞辅助剂的应用。

血小板裂解产物在基于生长因子对脐带干细胞进行增殖、趋化和再生中的应用。

血小板裂解产物在提高脐带干细胞的生存能力和生物学功能中的应用。

血小板裂解产物联合脐带干细胞在制备治疗膝骨性关节炎药物中的应用。

血小板裂解产物联合脐带干细胞在制备治疗膝骨性关节炎的软骨修复药物中的应用。

本发明具有以下有益效果：

（1）验证了血小板裂解产物适合作为脐带干细胞的辅助剂。此外，血小板裂解产物中的生长因子对脐带干细胞的增殖、趋化、再生等有重要作用。

（2）验证了基于生长因子的血小板裂解产物作用于脐带干细胞的机制及其在膝骨性关节炎治疗中的协同应用，提高脐带干细胞的生存能力和生物学功能。利用血小板裂解产物对脐带干细胞的活性作用，将两者结合，以达到协同治疗膝骨性关节炎（osteoarthritis，OA）的潜力。

附图说明

图1中A为采用流式细胞术鉴定人血小板裂解产物纯度图，B为采用ELISA法检测人血小板裂解产物生长因子浓度图，C为采用CCK-8法测定人血小板裂解产物对脐带干细胞的活力影响图；

图2中A为流式细胞周期检测结果图，B为细胞周期相关分子靶点结果图；

图3为细胞划痕检测结果图；

图4中A为人血小板裂解产物对脐带干细胞趋化迁移影响图，B为人血小板裂解产物对脐带干细胞趋化迁移相关分子靶点影响图；

图5中A为人血小板裂解产物的safranin-O切片染色结果图，B为机械异常性疼痛和热痛觉检测结果图。

具体实施方式

以下将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

鉴于血小板裂解产物（Platelet lysates，PL）产生大量丰富的生长因子，假定PL不仅可以用于细胞培养，还可以作为一种辅助剂用于促进和增强细胞治疗中的MSCs。为了验证这一假设，分离出人脐带干细胞，在细胞和分子水平上评估其对MSCs的作用。因为MSCs对膝骨性关节炎（osteoarthritis，OA）有明显疗效，进一步利用大鼠OA模型，评价PL与MSCs联合对软骨损伤的协同作用，为PL基于MSCs的细胞治疗中的辅助作用提供证据。目前，PRP（富血小板血浆）或PL治疗骨性关节炎的机制尚未被阐明，而将PL和MSCs结合用于软骨再生也从未被尝试过。因此本发明数据超越现有的知识，为再生医学提供了新的信息，即PL作为MSCs应用的辅助补充，与PL联合MSCs应用于OA治疗中的软骨修复作用机制。

实施例1：血小板裂解产物的制备

用含3.2%抗凝剂（枸橼酸钠）的采血管采集外周血，室温静置30分钟以上，以210 g离心10分钟，取上层和中层，弃下层血浆，再以210 g离心5分钟，去除剩余红细胞。然后放入液氮或-80°C冰箱进行反复冻融裂解（3个循环），或者超声裂解，得到血小板裂解产物（PL）。

实施例2：血小板裂解产物纯度的测定

对实施例1提取得到的PL采用流式细胞术鉴定，添加物0.9%生理盐水，10% PL。结果如图1A所示，PL中CD41a的阳性表达率为99.11%，说明制备完成的人血小板裂解产物PL纯度较高。

实施例3：血小板裂解产物中细胞因子的含量测定

采用ELISA法检测PL中细胞因子含量，添加物为0.9%生理盐水，10% PL。结果如图1B所示，PDGF含量为26.25±0.48 ng/ml，TGF-β含量为7.62±1.29 ng/ml，IFG-1含量为5.05±0.15 ng/ml，EGF含量为1.39±0.08 ng/ml，FGF含量为0.33±0.01 ng/ml。

实施例4：脐带干细胞增殖活性的测定

采用CCK-8法分别检测不同浓度的PL、PRP对脐带干细胞的活性影响，添加物10%胎牛血清，0.9%生理盐水，0.025% PL、0.05% PL、0.125% PL、0.25% PL、0.5% PL、1% PL、2.5% PL；0.025% PRP、0.05% PRP、0.125% PRP、0.25% PRP、0.5% PRP、1% PRP、2.5% PRP。结果如图1C所示，处理24h和48h后，稀释率为1/200至1/10的PL和稀释率为1/100至1/10的PRP均对脐带干细胞产生显著的增殖作用。在1/50、1/25和1/10稀释率下，24 h后PL的影响显著；在1/100、1/50、1/25和1/10稀释率下，48 h后PL的影响显著。在稀释1/50至1/10的情况下，48h后PRP的效果显著。说明PL对脐带干细胞的促增殖作用强于PRP。

实施例5：脐带干细胞细胞周期进展的测定

采用流式细胞周期检测低、中、高浓度的PL与PRP对脐带干细胞的周期影响，添加物10%胎牛血清，0.9%生理盐水，0.3125% PL、0.625% PL、1.25% PL。结果如图2A所示，PL调控脐带干细胞的细胞周期从G0/G1期向S期和G2/M期发展。且随着PL剂量的增加，与对照组相比，G0/G1期百分比逐渐下降，S期和G2/M期逐渐上升。PRP虽也可调控细胞周期进展，但其作用远远小于高浓度PL。说明PL可以调控干细胞周期的进展，且呈剂量依赖性。

实施例6：脐带干细胞细胞周期相关基因表达的测定

采用Real Time PCR法检测PL对脐带干细胞细胞周期相关基因mRNA表达的影响情况，添加物10%胎牛血清，0.9%生理盐水，1.25% PL。结果如图2B所示，高浓度PL显著上调脐带干细胞中CDC25A、CCNA2、CCNB1、CCND1、CDK2、E2F1和E2F2基因的表达（均P < 0.01），下调脐带干细胞中P15和P16基因的表达。说明PL可以促进干细胞周期相关分子靶点基因的表达。

实施例7：脐带干细胞划痕修复能力的测定

对实施例1提取得到的PL采用细胞划痕检测，评价PL对脐带干细胞迁移能力的影响，添加物10%胎牛血清，0.9%生理盐水，0.3125% PL、0.625% PL、1.25% PL。结果如图3，与正常水平相比，PL处理24h、36h和48h创面面积与未处理（0h）创面面积之比，随PL浓度的升高而显著降低（P<0.01）。说明PL以剂量依赖的方式，通过增强脐带干细胞的迁移能力促进其创面愈合。甚至72h后，高浓度PL完成了创面愈合。说明PL能促进脐带干细胞的划痕修复。

实施例8：脐带干细胞趋化迁移能力的测定

对实施例1提取得到的PL采用Transwell检测，评价PL对脐带干细胞趋化迁移能力的影响，添加物10%胎牛血清，0.9%生理盐水，0.3125% PL、0.625% PL、1.25% PL。结果如图4A，与正常水平相比，随着PL浓度的升高，迁移到下室的脐带干细胞数量显著增加（各P< 0.01），说明PL对脐带干细胞的迁移具有剂量依赖性的促进作用。经PRP处理的脐带干细胞与正常水平的迁移细胞数差异无统计学意义。结果表明，与PRP相比，PL增加了脐带干细胞的趋化迁移能力。

实施例9：脐带干细胞趋化迁移相关基因表达的测定

采用Real Time PCR法检测PL对脐带干细胞相关基因mRNA表达的影响情况，添加物10%胎牛血清，0.9%生理盐水，1.25% PL。结果如图4B，中浓度PL显著上调脐带干细胞中MMP2、FIBRONECTIN、VEGF-A、VEGF-C、VIMENTIN、TWIST1基因的表达(均P< 0.01)。说明PL能促进脐带干细胞趋化迁移相关靶点基因的表达。

实施例10：大鼠行为学及组织病理学观察

采用大鼠关节腔内注射碘乙酸建立大鼠膝骨性关节炎（OA）模型，通过实施例1提取得到的PL及其培养的脐带干细胞联合干预治疗后，采用机械异常性疼痛和热痛觉过敏法，检测机械压痛阈值（TWL）和热痛觉过敏时间（MWT）。解剖取大鼠双侧膝关节，脱钙处理后对大鼠软骨切片行safranin-O染色和OARSI评分，添加物0.9%生理盐水，0.625% PL，1×10⁶MSC。结果如图5A，模型组染色结果显示了典型的软骨退变现象：软骨细胞丢失和胶原蛋白破坏。通过PL和脐带干细胞的处理后，软骨细胞和胶原蛋白的恢复使退变发生逆转，逆转效果为PL+MSC > MSC >PL。OARSI评分证实模型组评分较正常组水平显著升高（P<0.05），而经PL+MSC、MSC、PL处理后，相较于模型组，评分显著降低（P<0.05）。大鼠行为学结果如图5B，与正常水平相比，OA模型组显著降低TWL和MWT水平（P<0.05）。与模型组相比，PL+MSC、MSC和PL处理后显著提高了TWL和MWT水平（P<0.05）。PL+MSC、MSC、PL对TWL的影响相似，而PL+MSC对MWT的影响与MSC相似，但优于PL。说明PL与脐带干细胞联合可以协同促进骨关节炎软骨的修复，二者具有联合效应。