阅读说明：本技术 干细胞提取液及其制备方法与应用 (Stem cell extracting solution and preparation method and application thereof ) 是由 董健伸 徐汝强 孙永沛 程洪斌 王晓东 徐俊 于 2020-07-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了干细胞提取液及其制备方法与应用,其制备方法包括以下步骤：将原代干细胞接种于培养基中,原代培养,隔天换液,当原代干细胞生长至80～90%时,去除培养基,剩余的干细胞经过漂洗后与生理盐水混合,诱导培养后进行离心分离,得到上清液；然后将上清液过滤后,得到干细胞提取液。本发明公开了干细胞提取液及其制备方法与应用,没有外源性动物成分而更安全,得到的提取液呈现丰富的细胞因子,可以直接作为药物制剂,或者冻存后与辅料混合配置药物。(The invention discloses a stem cell extracting solution, a preparation method and application thereof, wherein the preparation method comprises the following steps: inoculating the primary stem cells into a culture medium, carrying out primary culture, changing the culture medium every other day, removing the culture medium when the primary stem cells grow to 80-90%, rinsing the rest stem cells, mixing with normal saline, carrying out induction culture, and carrying out centrifugal separation to obtain a supernatant; then filtering the supernatant to obtain the stem cell extracting solution. The invention discloses a stem cell extracting solution, a preparation method and application thereof, wherein the stem cell extracting solution is safer without exogenous animal components, and the obtained extracting solution presents rich cell factors and can be directly used as a medicinal preparation or mixed with auxiliary materials to prepare a medicament after being frozen.)

干细胞提取液及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及干细胞提取液及其制备方法与应用。

背景技术

在细胞的实际工作场景中，细胞内大多数分子（如：蛋白质）都很大，无法直接穿过细胞中的膜结构，所以，需要时时刻刻进行细胞间的能量转换、信息识别与传递、物质运送等基本生命过程。近年来，科学技术的发展日新月异，作为囊泡的其中一种，外泌体参与细胞活动的重要调控，在多种疑难杂症的治疗方面崭露头角。外泌体是一种由各种活细胞通过内吞-融合-外排等一系列生物学机制产生，并通过主动分泌方式排出细胞膜外的脂质双分子层膜性囊泡，其本质是脂质双分子层，直径为30-100nm，密度为1.15-1.19g/mL。现已证实可以分泌外泌体的细胞有：肥大细胞、淋巴细胞、树突状细胞、肿瘤细胞、间充质干细胞等；外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。外泌体的分离纯化一直是科研工作者关注的问题，批量制备外泌体对后续的研究至关重要，目前人们多采用超速离心、免疫磁珠或试剂盒等方法实现外泌体的提取分离；现有技术工艺复杂，提取出的细胞外泌体原液杂蛋白含量高，纯度很高，对细胞外泌体的后续应用及研究造成很大影响。

江苏大学医学院的许文荣教授团队在Theranostics杂志发表的研究证明DIM在hucMSC衍生的外泌体中上调Wnt11表达，Wnt11敲低抑制了DIM-hUCMSCs中的β-连环蛋白激活和干细胞诱导，并在体内消除了其治疗效果，因此，该研究结果表明，DIM通过增加外泌体Wnt11自分泌信号促进hucMSCs的干性，为改善hucMSCs对伤口愈合的治疗效果提供了新的策略。人类脐带间充质干细胞（hucMSCs）被认为是再生医学中有希望的治疗手段，但其疗效需进一步提高。

发明内容

本发明公开了干细胞提取液及其制备方法与应用，没有外源性动物成分而更安全，得到的提取液中除了外泌体之外，还呈现丰富的细胞因子，尤其是本发明提取液对炎症有效果，可以直接作为抗炎制剂，或者冻存后与辅料混合配制抗炎药物；尤其本发明的方法不需要超速离心处理，极大简化了操作步骤，且保留外泌体混合成份，克服了现有技术需要去除细胞的上清液的步骤。

本发明采用如下技术方案：

干细胞提取液，其制备方法包括以下步骤：将原代干细胞接种于培养基中，原代培养，隔天换液，当原代干细胞生长至80～90%时，去除培养基，剩余的干细胞经过漂洗后与生理盐水混合，诱导培养后进行离心分离，得到上清液；然后将上清液过滤后，得到干细胞提取液。

本发明公开了上述干细胞提取液在药物中的应用；进一步的，药物可以作为抗炎药物、抗组织纤维化药物、抗肿瘤药物、抗衰老药物。

本发明制备的干细胞提取液为液体，具体为包含多种组分的生理盐水溶液，可以直接作为抗炎活性物质使用，也可以作为活性成分与常规药物辅料配置成多种状态的药物用于抗炎。细胞在培养过程中，产生多种细胞因子和外泌体并分泌到培养上清液中，这些组分通过直接或间接的方式产生作用，行使生物功能，多种细胞因子之间相互影响、相互作用；各种细胞因子的作用并不是孤立存在的，它们之间通过合成分泌的相互调节、受体表达的相互调控、生物学效应的相互影响等复杂交互作用而组成细胞因子网络 (Cytokinenetwork)，相比单一细胞因子，细胞自然产生的混合细胞因子则可能取得无法替代的技术效果。

本发明中，原代干细胞是指没有经过培养的干细胞，来源于人体组织，比如人类脐带间充质干细胞，相对于胚胎干细胞避免了来源有限以及安全伦理的问题，相对于骨髓干细胞避免了入侵式获取的问题。

本发明中，原代干细胞接种于培养基中的密度为10⁵～10⁷个/T150瓶，优选10⁶个/T150瓶；培养基为无血清MSC培养基(ScienCell公司)；隔天换液为现有术语；原代细胞培养在37℃、5%CO₂的培养箱中进行；当干细胞生长密度接近80～90%，去除培养基，利用生理盐水连续漂洗3遍；诱导培养时，生理盐水用量为20～30mL/T150瓶，优选25mL/T150瓶；诱导培养在37℃、5%CO₂的培养箱中进行，时间为48～96小时，优选72小时。

进一步的，诱导培养时，加入维生素E，优选的，维生素E的用量为5～10μL/L生理盐水，最好为8μL/L生理盐水。

本发明中，离心分离为1500rpm离心10分钟，去除细胞，收集上清液；将上清液过滤，滤膜直径为0.1微米，获得干细胞提取液溶液。

本发明公开的干细胞提取液成份安全，富含干细胞外泌体、多种细胞因子与营养物质，对改善炎症、组织纤维化有明显效果。

现有技术采用两步培养基法培养干细胞，细胞培养基中会人为添加多种激素、合成蛋白质、盐类物质等，以获得外泌体蛋白含量高的产品，同时现有技术采用超速离心等方法，希望获得杂质含量少的外泌体，综合操作下，造成了外泌体成份的流失或外泌体活性降低，得到的产品除外泌体外的组分含量少，甚至为单一外泌体。本方法创造性的采用生理盐水诱导制备提取液，更主要的是，成份多样富含多种干细胞外泌因子，复合组分可以取得预料不到的技术效果。

附图说明

图1为各种方法得到的外泌体中VEGF含量；

图2为各种方法得到的外泌体中bFGF含量；

图3为使用Western-blot方法鉴定获得干细胞提取液中的外泌体；

图4为实验组肺纤维化实验结果；

图5为对照组肺纤维化实验结果；

图6为空白组肺纤维化实验结果。

具体实施方式

实施例

将原代人脐带间充质干细胞按细胞密度10⁶个/ T150瓶，在无血清MSC培养基（ScienCell公司）中进行接种，然后于37℃，5%CO₂的培养箱中进行原代培养，隔天换液；细胞生长密度接近90%时，使用一次性10mL移液管，去除培养瓶中培养基，每瓶加入20mL生理盐水漂洗，重复漂洗3次；再加入生理盐水（0.9%）25mL，不加入其他物质，诱导培养，在37℃、5%CO₂的培养箱中进行诱导培养；诱导培养的时间72小时；然后1500rpm离心10分钟，收集上清液；将上清液过滤，滤膜为0.1微米，得到干细胞提取液溶液，图1、图2中的1；另外使用Western-blot方法鉴定干细胞提取液溶液中的外泌体，结果如图3，提取液至少含有CD81、CD9、TSG101；利用人白蛋白检测试剂盒（sigma），未检测到人白蛋白。

实施例二

在实施例一的基础上，诱导培养时，采用含0.2μL维生素E的生理盐水25mL，不加入其他物质，其余不变，进行平行实验，图1、图2中的2。

对比例一

在实施例一的基础上，诱导培养时，采用5%葡萄糖水溶液25mL，其余不变，进行平行实验，图1、图2中的3。

在实施例一的基础上，诱导培养时，采用纯化水25mL，其余不变，进行平行实验，图1、图2中的4。

在实施例一的基础上，诱导培养72小时后，300g离心10分钟，收集上清液，然后上清液经过10000rpm离心30分钟，收集上清液，再100000g、4℃离心70分钟，得到沉淀，用生理盐水重悬沉淀至50ml，检测步骤与实施例一相同，进行平行实验，图1、图2中的5。

对比例二

以2019104117939实施例一过滤后的产品，为图1、图2中的6。

分别使用abcam公司人VEGFA ELISA试剂盒(ab119566)，abcam公司人FGF basicELISA试剂盒(FGF2) (ab99979)进行提取液中细胞因子的检测，结果如图1、图2所示，说明本发明方法得到的干细胞原液中细胞因子成份丰富，且含量高；而且经过其他常规试剂盒检测，确定本发明产品富含外泌细胞因子，包含VEGF、PDGF、HGF、bFGF等，尤其是含有其他有效成分，比如650pg/mL的MMP2（金属蛋白酶2），而2019104117939实施例一过滤后的产品检测不到MMP2。

实施例三

经过动物实验研究，本发明干细胞提取液原液可以缓解肺纤维化症状，小鼠来自哈尔滨兽医研究所。

采用单次大剂量气管内博来霉素注射创建了肺纤维化小鼠模型（6周龄，常规方法建模，检查确定建模成功），使用实施例一干细胞提取液（实验组）与对比例二（对照组）进行对比，同时设置生理盐水组（空白组）；考察对肺纤维症状的改善，每组10只模型小鼠。

模型建立的第10天，开始进行雾化治疗，分别使用实施例一干细胞提取液、对比例二溶液与生理盐水，每次使用3mL液体加入到雾化器中，使用空气压缩型雾化器，雾化时间6分钟，连续雾化7天，期间饲养方式一致，都为常规饲养。雾化结束后，进行常规组织学检查，实验组干细胞提取液的吸入逆转了博来霉素损伤引起的肺泡上皮细胞损伤，通过组织观察，与生理盐水处理组对比，实验组肺部上皮和间充质细胞凋亡减少，减少了胶原蛋白沉积，减少了纤维化的发生，且实验组10只小鼠恢复效果近似，小鼠生长指标较对照组好，参见图4，为实验组处理过的肺部免疫组化图，两幅图针对不同小鼠；图5为对照组处理的肺部免疫组化图，有改善；图6为空白组处理的肺部免疫组化图；说明本发明制备的干细胞提取液具有有效的改善组织纤维化作用，明显优于对比例二的改善。