CN111778307A - 静息细胞法制备孕甾-5-烯-3β,21-二醇的方法 - Google Patents
静息细胞法制备孕甾-5-烯-3β,21-二醇的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111778307A CN111778307A CN202010716189.XA CN202010716189A CN111778307A CN 111778307 A CN111778307 A CN 111778307A CN 202010716189 A CN202010716189 A CN 202010716189A CN 111778307 A CN111778307 A CN 111778307A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ene
- diol
- preparing
- phytosterol
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 230000000284 resting Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 53
- 230000001131 transforming Effects 0.000 claims abstract description 31
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000007670 refining Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000003301 hydrolyzing Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000002633 protecting Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000001963 growth media Substances 0.000 claims description 21
- DLYUQMMRRRQYAE-UHFFFAOYSA-N Phosphorus pentoxide Chemical compound O1P(O2)(=O)OP3(=O)OP1(=O)OP2(=O)O3 DLYUQMMRRRQYAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 claims description 20
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 20
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N acetic acid ethyl ester Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 17
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 15
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 15
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 claims description 15
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[[email protected]]1OC(O)[[email protected]](O)[[email protected]@H](O)[[email protected]@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 13
- NKDDWNXOKDWJAK-UHFFFAOYSA-N Dimethoxymethane Chemical compound COCOC NKDDWNXOKDWJAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 13
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 13
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 13
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 13
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 13
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 13
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 claims description 12
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 12
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 11
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 11
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 11
- 230000001954 sterilising Effects 0.000 claims description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 10
- ODLHGICHYURWBS-LKONHMLTSA-N Trappsol Cyclo Chemical compound CC(O)COC[[email protected]]([[email protected]]([[email protected]@H]([[email protected]]1O)O)O[[email protected]]2O[[email protected]@H]([[email protected]@H](O[[email protected]]3O[[email protected]](COCC(C)O)[[email protected]]([[email protected]@H]([[email protected]]3O)O)O[[email protected]]3O[[email protected]](COCC(C)O)[[email protected]]([[email protected]@H]([[email protected]]3O)O)O[[email protected]]3O[[email protected]](COCC(C)O)[[email protected]]([[email protected]@H]([[email protected]]3O)O)O[[email protected]]3O[[email protected]](COCC(C)O)[[email protected]]([[email protected]@H]([[email protected]]3O)O)O3)[[email protected]](O)[[email protected]]2O)COCC(O)C)O[[email protected]@H]1O[[email protected]]1[[email protected]](O)[[email protected]@H](O)[[email protected]@H]3O[[email protected]@H]1COCC(C)O ODLHGICHYURWBS-LKONHMLTSA-N 0.000 claims description 8
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 8
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 claims description 8
- 239000012265 solid product Substances 0.000 claims description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 6
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 6
- 241000187488 Mycobacterium sp. Species 0.000 claims description 5
- 239000012043 crude product Substances 0.000 claims description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 4
- 239000002609 media Substances 0.000 claims description 4
- 238000000643 oven drying Methods 0.000 claims description 4
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 claims description 4
- 238000010992 reflux Methods 0.000 claims description 4
- 238000004537 pulping Methods 0.000 claims description 3
- 238000005086 pumping Methods 0.000 claims description 3
- 239000002910 solid waste Substances 0.000 claims description 3
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 4
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 abstract 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 abstract 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L sodium carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 14
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 7
- 239000001187 sodium carbonate Substances 0.000 description 7
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 2-nitrosoguanidine Chemical compound NC(N)=NN=O WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000006266 etherification reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 2
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic Effects 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 229940068065 Phytosterols Drugs 0.000 description 1
- 230000003213 activating Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000024881 catalytic activity Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000009740 moulding (composite fabrication) Methods 0.000 description 1
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical group OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J9/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of more than two carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, coprostane
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
Abstract
本发明涉及甾体类药物中间体的生产方法，具体来说是一种静息细胞法制备孕甾‑5‑烯‑3β,21‑二醇的方法。发明内容包括(1)植物甾醇的3位保护、(2)静息细胞转化、(3)提取、(4)水解、(5)精制步骤。本发明以植物甾醇为原料生产孕甾‑5‑烯‑3β,21‑二醇，原料易得，降低了生产成本；本发明采用保护剂对植物甾醇3位羟基进行官能团保护，发酵后水解可直接制得孕甾‑5‑烯‑3β,21‑二醇，副产物少，收率更高，反应路线更短，省掉了许多传统制备方法所需要的反应步骤和后处理步骤。
Description
技术领域
本发明涉及甾体类药物中间体的生产方法，具体来说是一种静息细胞法制备孕甾-5-烯-3β,21-二醇的方法。
背景技术
孕甾-5-烯-3β,21-二醇是甾体合成中重要的中间体，传统的工艺是利用3位酮基的类似结构，用化学方法选择性还原3位酮基为β羟基得到的产品，常常带有一定量的3位α羟基异构体，收率低且步骤繁琐，使用多种有机试剂容易带来污染。
菌株Mycobacterium sp.B-NRRL 3683记载在美国专利号为4755463的文献中，一般只用来进行植物甾醇到4-AD和ADD的发酵，目前普遍的研究是通过控制反应条件来提高4-AD和ADD的收率。
发明内容
针对以上技术问题，本发明的目的是提供一种高收率，高质量，低污染，易操作的静息细胞转化植物甾醇制备孕甾-5-烯-3β,21-二醇的方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种静息细胞法制备孕甾-5-烯-3β,21-二醇的方法，包括以下步骤：
(1)3位保护：利用甲缩醛作为保护剂，将植物甾醇的3位羟基进行保护，得到植物甾醇醚化物，反应过程中加入五氧化二磷作为催化剂和硅藻土作为助滤剂；
(2)静息细胞转化：将分枝杆菌(Mycobacterium sp.)B-NRRL 3683诱变菌种经过斜面培养和液体种子培养后，种子过滤分离，加入到PBS缓冲体系中，对所述植物甾醇醚化物进行发酵转化，得到发酵产物；
(3)提取：将步骤(2)中所得发酵产物静置分层，上层菌液抽入烧杯中备用；下层固体抽滤，得固体产物，滤出液与所述上层菌液合并，套用于下批次转化；
(4)水解:将步骤(3)中所得固体产物用乙酸乙酯萃取，减压升温浓缩后用盐酸水解，得水解产物；
(5)精制：将步骤(4)中所得水解产物进行精制提纯，得到孕甾-5-烯-3β,21-二醇产品。
优选地，所述步骤(1)中甲缩醛与植物甾醇的质量比为10-40:1。
优选地，所述步骤(2)中B-NRRL 3683诱变菌种种子培养的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，琼脂20g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；接种后，30℃培养4-5d；
(2)一级种子培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；接种后，于30℃，200rpm摇床培养48h；
(3)二级种子培养：培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；将一级种子液按体积比10％接种至二级种子培养基，接种后，于30℃，200rpm摇床培养48h；
(4)种子罐培养：
培养基配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0，按上述配方配制培养基，121℃灭菌30min；将二级种子液按体积比10％接种至种子培养基，培养参数：于28-32℃，空气流量0.5-1.0vvm，搅拌速度50-500rpm，罐压0.05-0.06MPa条件下培养，培养时间14-96h。
优选地，步骤(2)中转化培养基配方包括以质量百分比计的以下成分：植物甾醇醚化物1-10％，羟丙基-β-环糊精1-40％，菌体2-20％，余量用20mM pH＝8.0的PBS补足。
优选地，所述植物甾醇醚化物粉碎至200目。
优选地，所述步骤(2)中的静息细胞转化方法具体为：按所述配方配制转化体系，于28-32℃，搅拌速度50-500rpm，空气流量0.5-1.0vvm，罐压0.05-0.06MPa条件下转化。
优选地，所述步骤(4)中水解方法具体为：将所述固体产物用乙酸乙酯溶解，搅拌1h，抽滤，滤饼淋洗后作为固废，合并滤液，45℃减压浓缩至无馏分，加入5％盐酸，升温至60℃，水解1-2h，HPLC跟踪至反应完全，抽滤，弃滤液，收集滤饼，得水解产物。
优选地，所述步骤(5)精制方法具体为：将所述水解产物70℃烘干，加入甲醇溶解、抽滤，滤液减压升温浓缩至小体积，降温、抽滤、烘干得到粗品；将所述粗品加入石油醚，升温、回流打浆、冷却、过滤得类白色固体，烘干后，加入甲醇升温溶解，减压浓缩至糊状，降温至0-4℃，养晶2小时后抽滤烘干。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明以植物甾醇为原料生产孕甾-5-烯-3β,21-二醇，原料易得，降低了生产成本。
2.植物甾醇的3位羟基的活性很高，在转化过程中很容易被氧化导致转化失败，本发明采用保护剂对植物甾醇3位羟基进行官能团保护，发酵后水解可直接制得孕甾-5-烯-3β,21-二醇，副产物少，收率更高，反应路线更短，省掉了许多传统制备方法所需要的反应步骤和后处理步骤。
3.本发明采用静息细胞转化法，其转化体系营养单一，染菌风险低，菌体量可调节，可增大底物投料浓度，缩短转化反应时间，磷酸盐的缓冲体系可调节pH，转化过程酶活比较稳定，保证了良好的转化能力，同时所需环糊精和菌体可以重复多次的利用，且与产物及环糊精之间分离方便。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1菌种诱变
出发菌种：Mycobacterium sp.B-NRRL 3683
(1)菌种培养：
固体斜面培养基：M1+2％琼脂(M1+2％琼脂指代不明确，改为：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，琼脂20g/L，pH＝7.5-8.0)。
液体种子培养基：M1。(M1指代不明确，改为：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0)。
在固体斜面培养基中培养菌株B-NRRL 3683，接一环生长良好的斜面种子在装有100ml液体种子培养基的500ml三角瓶中活化，30℃，200rpm摇床振荡培养48h；取活化好的一级液体种子10ml，接入装有100ml液体种子培养基的500ml三角瓶中进行二级种子培养，30℃，200rpm摇床振荡培养48h。
(2)菌悬液制备
将生长好的二级种子装入10ml离心管中10000rpm离心5min，弃上清液，收集菌体，用ph6.0的磷酸钾缓冲液离心洗涤两次，再用无菌磷酸钾缓冲溶液(pH6.0)制成菌悬液，并将浓度稀释至108-109个/ml。
(3)亚硝基胍(NTG)诱变处理
取上述菌悬液2ml，0.1mol/L亚硝基胍溶液1ml，0.2mol/Lph6.0的磷酸钾缓冲液2ml，加入离心管中，充分混匀，立即置于30℃水浴分别振荡(避光条件下)处理25-35分钟后，离心收集菌体，用PBS冲洗3次以去除NTG残留，最后向离心管中加入5ml无菌生理盐水，摇匀后取出一定的菌悬液，用生理盐水稀释至一定浓度备用。取100ul上述菌悬液涂布到固体平板培养基上，30℃避光培养，并计算致死率。
致死率＝(0s时的菌落数-不同诱变时间的菌落数)/0s时的菌落数*100％
经计算得出，25-35分钟平均分别为:65.2％、82.1％、91.7％。当致死率在80％时，细菌诱变效果最好，30min为最佳处理时间。
将30min作为试验中最佳诱变时间，按上述方法对出发菌株的菌悬液进行诱变处理，在1200个单菌落中选出8个生长良好的单菌落，用筛选出的8支突变菌株和出发菌株进行植物甾醇发酵，并检测孕甾-5-烯-3β,21-二醇产量，得到目标诱变菌种。
实施例2种子培养
菌种名称：Mycobacterium sp.B-NRRL 3683诱变菌种
(1)斜面培养
配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，琼脂20g/L，pH＝7.5-8.0；
121℃灭菌30min。凝固成型后，在无菌条件下接种。
接种后，30℃培养4d，入4℃冰箱保存，保存时间不超过1个月。
(2)摇瓶种子培养
配方：蛋白胨0.1-10g/L，酵母膏0.1-10g/L，葡萄糖0.1-10g/L，磷酸氢二钠0.1-10g/L，pH＝7.5-8.0。
121℃灭菌30min。冷却至室温。
1.一级种子培养
在无菌条件下接种，接种量：每100ml刮取1环。接种后，30℃，200rpm摇床培养48h。
2.二级种子培养
在无菌条件下接种，接种量：10％。接种后，30℃，200rpm摇床培养48h。
3.种子罐培养：
培养基配方：蛋白胨0.1-1.0g/L，酵母膏0.1-1.0g/L，葡萄糖0.1-1.0g/L，磷酸氢二钠0.1-1.0g/L，pH＝7.5-8.0。
121℃灭菌30min；将二级种子液按体积比10％接种至种子培养基，培养参数：于28-32℃，空气流量0.5-1.0vvm，搅拌速度50-500rpm，罐压0.05-0.06MPa条件下培养，培养时间14-96小时。
4.菌种分离
将发酵得到的菌种过滤分离，滤饼用20mM的pH＝8.0的PBS进行淋洗至滤液无色，抽滤干，将滤饼悬浮于20mM的pH＝8.0的PBS中备用。
实施例3植物甾醇3位醚化保护
物料配比：甲缩醛1500g，植物甾醇100g，硅藻土100g,五氧化二磷50g，碳酸钠4g(配成1％水溶液使用)，水200g。
反应瓶中按比例投入植物甾醇和甲缩醛，升温到25℃，搅拌至完全溶清，加入硅藻土，再缓慢加入五氧化二磷，加入过程中控制温度不超过30℃，25℃左右搅拌1-1.5小时，薄层色谱检测反应完全，升温至30℃以上，趁热过滤，滤饼和反应瓶用少量水洗，50℃烘干。得淡黄色固体，在烘箱中于40-50℃烘干至恒重，重量117.1g，即得到所述植物甾醇醚化物粗品。
将得到的醚化物粗品，2倍体积的丙酮，升温至50-60℃，搅拌回流30min，冷却至-10℃，抽滤，滤饼使用-10℃丙酮淋洗，滤饼40-50℃烘干至恒重，收白色粉末100.3g，即得到所述植物甾醇醚化物。
3位醚化保护的反应式如下所示：
实施例4静息细胞转化
(1)按照实施例2进行种子培养；
(2)按照实施例3进行底物制备；
物料配比：甲缩醛1500g，植物甾醇100g，硅藻土100g,五氧化二磷50g，碳酸钠4g(配成1％水溶液使用)，水200g。
(3)10L罐发酵转化
转化在10L罐中进行。计料体积：6L。接种后体积：6L。
本实施例中所使用的转化培养基组分具体如下：200目植物甾醇醚化物1％，羟丙基-β-环糊精1％，菌体5％，余量用20mM PBS(pH＝8.0)补足。
转化条件：30℃，200rpm，空气流量0.1vvm，罐压0.05MPa，转化时间88h，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。
静息细胞转化的反应式如下所示：
(4)提取
转化结束，停止搅拌，静置分层2小时。上层菌液抽入烧杯中备用；下层固体抽滤干，滤出液与上层分出的菌液合并，得到分离菌液，套用于下批次转化，菌液可循环套用10次。
(5)水解
物料配比：乙酸乙酯1升，5％盐酸1.5升。
抽滤得到的固体产物用乙酸乙酯溶解，搅拌1h，抽滤，滤饼淋洗，作为固废，合并滤液，45℃下减压浓缩至无馏分，加入5％盐酸，升温至60℃，水解1-2h，HPLC跟踪至反应完全，抽滤，弃滤液，收集滤饼。
水解反应的反应式如下所示：
(6)精制工序
物料配比：甲醇2升，石油醚0.5升。
将水解得到的滤饼于70℃烘干，使用甲醇1升进行溶解，抽滤，滤液减压浓缩至小体积，降温至4℃左右，抽滤，烘干。得到的产品加入石油醚，70℃回流打浆2-3h，降温至25℃，过滤得类白色固体，烘干，加入2L甲醇，升温至70℃溶解，减压浓缩至糊状，缓慢降温至0-4℃，养晶2h，抽滤，烘干，得产物19.8g，其液相归一含量：98.35％。
实施例5静息细胞转化
(1)按照实施例2进行种子培养；
(2)按照实施例3进行底物制备；
物料配比：甲缩醛600g，植物甾醇200g，硅藻土200g，五氧化二磷100g，碳酸钠8g(配成1％水溶液使用)，水400g。
(3)发酵转化
转化在10L罐中进行。计料体积：6L。接种后体积：6L。
转化体系配方：植物甾醇醚化物2％，羟丙基-β-环糊精1％，新菌体0.5％，套用实施例4菌液，余量用20mM pH＝8.0的PBS补足。
转化条件：30℃，200rpm，空气流量0.1vvm，罐压0.01MPa，转化时间96h，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。
(4)提取、水解及精制
按照实施例4提取、水解及精制方法进行后处理，相关试剂用量为实施例4用量的2倍，得产物42.3g，液相归一含量：98.47％。
实施例6静息细胞转化
(1)按照实施例2进行种子培养；
(2)按照实施例3进行底物制备；
物料配比：甲缩醛2000g，植物甾醇400g，硅藻土400g，五氧化二磷200g，碳酸钠16g(配成1％水溶液使用)，水800g。
(3)发酵转化
转化在10L罐中进行。计料体积：6L。接种后体积：6L。
转化体系配方：植物甾醇醚化物4％，羟丙基-β-环糊精10％，菌体15％，余量用20mM pH＝8.0的PBS补足。
转化条件：28℃，200rpm，空气流量1.0vvm，罐压0.1MPa，转化时间96h，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。
(4)提取、水解及精制
按照实施例4提取、水解及精制方法进行后处理，相关试剂用量为实施例4用量的4倍，得产物80.1g，液相归一含量：98.16％。
实施例7静息细胞转化
(1)按照实施例2进行种子培养；
(2)按照实施例3进行底物制备；
物料配比：甲缩醛12000g，植物甾醇800g，硅藻土800g，五氧化二磷400g，碳酸钠30g(配成1％水溶液使用)，水1600g。
(3)发酵转化
转化在10L罐中进行。计料体积：6L。接种后体积：6L。
转化体系配方：植物甾醇醚化物8％，羟丙基-β-环糊精20％，菌体10％，余量用20mM pH＝8.0的PBS补足。
转化条件：28℃，200rpm，空气流量0.5vvm，罐压0.1MPa，转化时间192h，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。
(4)提取、水解及精制
按照实施例4提取、水解及精制方法进行后处理，相关试剂用量为实施例4用量的8倍，得产物167.2g，液相归一含量：98.36％。
实施例8静息细胞转化
(1)按照实施例2进行种子培养；
(2)按照实施例3进行底物制备；
物料配比：甲缩醛4000g，植物甾醇200g，硅藻土200g，五氧化二磷100g，碳酸钠10g(配成1％水溶液使用)，水400g。
(3)发酵转化
转化在10L罐中进行。计料体积：6L。接种后体积：6L。
转化体系配方：植物甾醇醚化物2％，羟丙基-β-环糊精5％，菌体2％，余量用20mMpH＝8.0的PBS补足。
转化条件：32℃，200rpm，空气流量0.1vvm，罐压0.05MPa，转化时间160h，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。
(4)提取、水解及精制
按照实施例4提取、水解及精制方法进行后处理，相关试剂用量为实施例4用量的2倍，得产物41.2g，液相归一含量：98.65％。
实施例9静息细胞转化
(1)按照实施例2进行种子培养；
(2)按照实施例3进行底物制备；
物料配比：甲缩醛10000g，植物甾醇1000g，硅藻土1100g，五氧化二磷500g，碳酸钠60g(配成1％水溶液使用)，水3000g。
(3)发酵转化
转化在10L罐中进行。计料体积：6L。接种后体积：6L。
转化体系配方：植物甾醇醚化物10％，羟丙基-β-环糊精40％，菌体20％，余量用20mM pH＝8.0的PBS补足。
转化条件：32℃，200rpm，空气流量1.0vvm，罐压0.01MPa，转化时间240h，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。
(4)提取、水解及精制
按照实施例4提取、水解及精制方法进行后处理，相关试剂用量为实施例4用量的10倍，得产物203.4g，液相归一含量：98.43％。