阅读说明：本技术 一种季也蒙毕赤酵母及分泌的胞外蛋白的应用 (Pichia guilliermondii and application of secreted extracellular protein ) 是由 王鸿江 谢海峰 谢期林 胡云岭 于 2019-04-03 设计创作，主要内容包括：本发明为一种季也蒙毕赤酵母及分泌的胞外蛋白的应用,涉及微生物技术领域,具体涉及一种利用季也蒙毕赤酵母高效合成赛门苷I的方法；所述的应用通过季也蒙毕赤酵母(<I>Meyerozyma guilliermondii</I>)的分泌的胞外蛋白实现催化功能；该胞外蛋白具有较强的催化活性,具有催化效率高,反应条件温和,特异性强等特点,有望为高效合成赛门苷I的理想催化剂,拓宽赛门苷I的来源。(The invention relates to application of pichia guilliermondii and secreted extracellular protein, relates to the technical field of microorganisms, and particularly relates to a method for efficiently synthesizing siamenoside I by using pichia guilliermondii; the application is realized by using pichia guilliermondii ( Meyerozyma guilliermondii ) The secreted extracellular protein realizes a catalytic function; the extracellular protein has the characteristics of strong catalytic activity, high catalytic efficiency, mild reaction conditions, strong specificity and the like, is expected to be an ideal catalyst for efficiently synthesizing the siamenoside I, and widens the source of the siamenoside I.)

一种季也蒙毕赤酵母及分泌的胞外蛋白的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种利用季也蒙毕赤酵母高效合成赛门苷I的方法。

背景技术

罗汉果(Siraitia grosvenorii)是广西道地药材，对生境的要求较严格，主要垂直分布于海拔250～1000m的亚热带有坡地区，分布区多有苔藓、兰科植物、油茶林和竹林等植物；罗汉果要求生长在昼夜温差较大、环境湿润的地区，最适温度为25～30℃，空气相对湿度为70％～85％；喜光但不耐强光，怕霜冻；适宜栽培在排水较好、有机质丰富、疏松湿润的红黄壤土中。桂林的临桂、永福、兴安、资源、龙胜、灵川栽培面积最大，也是我国最大的罗汉果生产基地。罗汉果有凉血解暑、滑肠通便、化痰止咳、舒胃、清肺和生津止渴等功效，临床用于治疗肠燥便秘、高血压和呼吸系统疾病，同时具有一定抗菌作用，对消化系统疾病也有较好的疗效。目前，以罗汉果为主要原料已经制成的中药有罗汉果咽喉片、镇咳祛痰合剂、罗汉果止咳露、止咳定喘片、罗汉果止咳剂等(黎霜等，2003)。罗汉果甜苷类物质甜度高、热值低、水溶性与热稳定性好。无毒，食用安全，没有异味，因此广泛应用于食品及保健品工业中。近年来，罗汉果被制成汁粉、果糕、柿饼汤、面包、果凉茶、单晶冰糖等食品和保健品；罗汉果在国外市场也非常受欢迎，日本、韩国、英国、新加坡等国先后批准罗汉果可以作为食品添加剂，特别是用罗汉果制成的高级润喉糖、罗汉果果汁等产品在日本深受人们的喜爱。

目前从罗汉果果实中提取和鉴定的葫芦烷型三萜类成分有：罗汉果苷Ⅳ、罗汉果苷Ⅴ、罗汉果皂苷ⅣA、罗汉果二醇Ⅰ苯甲酸酝、罗汉果新苷、罗汉果苷Ⅲ、罗汉果皂苷ⅡA1、赛门苷Ⅰ、11-氧化-罗汉果苷Ⅴ、罗汉果ⅡE、罗汉果苷ⅢE和罗汉果苷A等(杨秀伟等，2008)。以上成分是罗汉果的主要甜味成分，在罗汉果干果中的总含量为3.755％～3.858％。罗汉果中含有多种皂苷成分，目前已从罗汉果中分离并鉴定30多种葫芦烷型三萜皂苷，其中罗汉果苷IV、V和赛门苷I是迄今为止报道的罗汉果甜苷中甜度最高的3种成分，分别为蔗糖甜度的392，425和563倍。赛门苷I是葫芦烷三萜苷中最甜的成分，赛门苷I(0.01％浓度)的为5％蔗糖甜度的563倍。

此外，体外试验表明赛门苷对麦芽糖酶有抑制作用，Suzuki等研究发现，罗汉果苷提取物(包含罗汉果苷V，IV，III，赛门苷I等)对单剂量口服麦芽糖大鼠餐后血糖具有强烈的抑制作用，IC₅₀分别为14,12,10和1.6mM。日本学者Konoshima等在罗汉果甜苷的病毒抑制作用试验中,发现赛门苷I可抑制病毒的生长。赛门苷I还具有很强的降血糖血压的功用。Yasushi A.Suzuki等研究罗汉果粗提物对餐后血糖浓度增加的影响，实验发现，大鼠摄入麦芽糖之前3分钟口服罗汉果粗提物，血浆中葡萄糖浓度的增高得到显著的抑制，但摄入葡萄糖时没有抑制作用。试验结果表明罗汉果赛门苷I对麦芽糖酶有抑制能力。

然而，当前赛门苷I的生产与制备主要是通过植物提取获得，但是植物类含量极低，严重制约着赛门苷I的大规模应用，在过去的十年里文献报道了用植物组织培养法生产赛门苷I的方法，一般都是通过添加诱导物诱导植物细胞生产赛门苷I。目前，尚未有大量制备和生产赛门苷I的公开报道。

发明内容

本发明的目的是提供季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)的新用途，该菌株能生产胞外蛋白，该胞外蛋白具有高效催化合成赛门苷I的作用，将为赛门苷I大规模生产提供新的思路。

本发明的目的是提供一种利用季也蒙毕赤酵母高效合成赛门苷I的方法。其能够高效地提高合成罗汉果赛门苷I，具有见效快、成本低、操作简单、方便实施、产品无毒无残留等特征，以满足罗汉果赛门苷I的大规模生产，具有较强的实用性和推广价值。

一种季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)在制备赛门苷I中作为催化剂的应用。

所述的应用通过季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)的分泌的胞外蛋白实现催化功能。

季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)在生产赛门苷I的应用，其特征在于，所述的应用按如下步骤实现：

步骤1：将季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)划线接种于新鲜的斜面培养基上，于25℃培养48h，得到活化的斜面菌种；

步骤2：将步骤1得到的活化的斜面菌种，用接种环挑取1环接种于装有20mL种子培养基的100mL三角瓶中，于25℃、200rpm摇床培养48h，即得种子液；然后按照体积百分比2％-10％的接种量，将种子液接种于装有200mL液体发酵培养基的500mL三角瓶中，25℃、200rpm摇床培养48h，得到发酵液；

步骤3：将步骤2得到的发酵液进行离心，收集菌体沉淀及上清液，对上清液纯化、浓缩即得到胞外蛋白。

步骤4：利用步骤3得到的季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)的胞外蛋白作为催化剂制备赛门苷I。反应式如下：

所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述斜面培养基

包括可溶性淀粉10g、葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母浸膏5g、琼脂20g和水1000mL，pH值自然。

所述的应用，其特征在于，所述的步骤(2)中，所述液体发酵培养基包括葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸膏10g、K₂HPO₄ 0.2g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、Na₂CO₃ 0.5g和水1000mL，pH值自然。

所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，所述上清液纯化、浓缩方法为：在上清溶液中，于4℃冷藏5h，加入硫酸铵将饱和度调为65％，4000rpm离心15min；得沉淀，沉淀物为胞外蛋白。

一种利用季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)所产胞外蛋白制备赛门苷I的方法，其特征在于，将获得胞外蛋白0.01-10g/L，罗汉果苷V0.1–100g/L，pH7.2的磷酸盐缓冲液0.2M混合，25℃，200rpm搅拌下，反应5-72h。

所述的方法，其特征在于所述的胞外蛋白将罗汉果苷V转化为赛门苷I。

所述的季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)，具有以下特性：

(1)个体形态：菌体呈椭圆形状。

(2)在固体培养基平板上的菌落性状：菌落呈圆形、中间皱起，呈乳白色。

(3)生长适温25-30℃，pH值6.0-7.0，好氧。

上述固体培养基由可溶性淀粉10g、葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母浸膏5g、琼脂20g和水1000mL组成，pH值自然。

上述固体培养基在使用前，先于0.1MPa下121℃灭菌15min。

该菌株经过综合菌落形态、菌体形态特征观察、分子生物学测序结果，确定季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)。

有益效果

1、本发明首次发现罗汉果共生菌为季也蒙毕赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)，并且首次发现其培养物可以将罗汉果V转变为赛门苷I。进一步来说，所述的季也蒙毕赤酵母经培养后获得胞外蛋白，且该胞外蛋白具有较强的催化活性，其将可以把罗汉果苷V特异催化为赛门苷I，具有催化效率高，反应条件温和，专属性好等特点，有望为高效合成赛门苷I的理想催化剂，拓宽赛门苷I的来源。

2、发明人测试了人参皂苷Rb1、西红花苷I，木蝴蝶苷B，上述的化合物葡萄糖与罗汉果苷V都是1-6连接，并还有测试了罗汉果I、罗汉果IV，罗汉果ⅡE、罗汉果苷ⅢE和罗汉果苷A，但实验结果发现：只有罗汉果苷V能被催化为赛门苷I，其他无效。

附图说明

图1为本发明的季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)的菌落图；

图2实施例4的季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)所产胞外蛋白催化生产赛

门苷I结果；

图3不同罗汉果提取物HPLC出峰时间图；

图4为季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)的鉴定报告；

图5为赛门苷I的碳谱图；

图6为赛门苷I的氢谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)先期从罗汉果共生菌分离得到，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，验证两者一致。

实施例1季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)所产胞外蛋白制备赛门苷I

步骤1：季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)划线接种于新鲜的斜面培养基上，于25℃培养48h，得到活化的斜面菌种；

步骤2：将步骤1得到的活化的斜面菌种，接种于装有20mL种子培养基的100mL三角瓶中，于25℃、200rpm摇床培养48h，即得种子液；然后按照2％(v/v)-10％(v/v)的接种量，将种子液接种于装有200mL液体发酵培养基的500mL三角瓶中，25℃、200rpm摇床培养48h，得到发酵液；

步骤3：将步骤2得到的发酵液进行离心，收集菌体沉淀及上清液，对上清液浓缩即得到胞外蛋白；

其中步骤1中，所述斜面培养基由可溶性淀粉10g、葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母浸膏5g、琼脂20g和水1000mL组成，pH值自然；

其中步骤1中，2中，所述种子培养基和液体发酵培养基均由葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母浸膏10g、K₂HPO₄ 0.2g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、Na₂CO₃ 0.5g和水1000mL组成，pH值自然。

其中步骤3中季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)所产胞外蛋白浓缩方法为：在上清溶液中，于4℃冷藏5h，加入硫酸铵将饱和度调为65％，4000rpm离心15min；得沉淀，沉淀物为粗LHGNSJ-VS01胞外蛋白。

实施例2利用罗汉果内生菌LHGNSJ-VS01胞外蛋白制备赛门苷I

5g/L粗LHGNSJ-VS01胞外蛋白，10g/L罗汉果苷V，0.2M磷酸盐缓冲液pH＝7.2混合，25℃，200rpm搅拌，反应24h，底物转化率达31％，赛门苷I纯度为98.5％，如图2所示。赛门苷I波谱数据见图5和图6。

实施例3利用罗汉果内生菌LHGNSJ-VS01胞外蛋白制备赛门苷I

1g/L粗LHGNSJ-VS01胞外蛋白，5g/L罗汉果苷V，0.2M磷酸盐缓冲液pH＝7.2，25℃，200rpm，反应24h。底物转化率达31％，赛门苷I纯度为98.5％，如图4所示。

上述实施例2或3中罗汉果提取物含量的测定方法：

以高效液相色谱法(HPLC)测定赛门苷I和其他罗汉果提取物含量。

样品处理：反应液加入与反应液同体积的乙醇，沉淀蛋白，并溶解底物(罗汉果苷V)和产

物(赛门苷I)，10000r/min离心6min，0.45μm滤膜过滤，待测。

色谱柱：Ultimate○RXB-C18柱(150mm×4.6mm×3μm，)；

流动相：A相(0.1％v/v磷酸-水溶液)和B相(甲醇)，

梯度变化(B相)：0-20min 10-30％，20-25min 30-90％,25-26min 90-10％，26-30min 10％。

流速：1mL/min，

波长：205nm处紫外检测，

进样量20μL。其中罗汉果苷V和赛门苷I的出峰时间分别为19.9min和20.9min左右(如图3所示)。

实施例4

参照实施例2利用罗汉果内生菌LHGNSJ-VS01胞外蛋白酶解脱糖，实验分别测试了人参皂苷Rb1、西红花苷I，木蝴蝶苷B，上述的化合物葡萄糖与罗汉果苷V都是1-6连接，并还有测试了罗汉果I、罗汉果IV，罗汉果ⅡE、罗汉果苷ⅢE和罗汉果苷A，但实验结果发现：只有罗汉果苷V能被催化为赛门苷I，其他无效。

实验结果证明，本发明罗汉果内生菌LHGNSJ-VS01胞外蛋白催化作用具有结构特异性，只有罗汉果苷V能被催化为赛门苷I。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。