阅读说明：本技术 苯并派洛宁类近红外荧光染料及其制备方法与应用 (Benzoproline near-infrared fluorescent dye and preparation method and application thereof ) 是由 刘卫敏 王秀萍 汪鹏飞 吴加胜 任昊慧 于 2019-03-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一类苯并派洛宁类近红外的荧光染料,具有如下结构式I：<Image he="404" wi="647" file="DDA0002004395520000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>本发明还公开了该类染料的制备方法。这类染料有良好的生物相容性和光稳定性、近红外荧光发射和较高的荧光量子产率,用于荧光探针的荧光团以及生物大分子的共价或者非共价荧光标记。(The invention discloses a benzo pyronine near-infrared fluorescent dye, which has the following structural formula I: the invention also discloses a preparation method of the dye. The dye has good biocompatibility and light stabilityQualitative, near infrared fluorescence emission and high fluorescence quantum yield, fluorophores for fluorescent probes and covalent or non-covalent fluorescent labeling of biological macromolecules.)

苯并派洛宁类近红外荧光染料及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一类近红外荧光染料及其制备方法与应用，尤其是涉及一类基于苯并派洛宁的近红外荧光染料及其制备方法与应用。

背景技术

近年来，由于选择性好、高时空分辨率、非破坏性和快速操作等优点，荧光成像在实时监测体内重要的生物分子以及跟踪细胞内多种生理过程等方面引起了越来越多的研究兴趣。而荧光染料在荧光成像技术中起着至关重要的作用，因此研究并开发出具有优良的光学性能、高检测灵敏度、高稳定性以及生物和环境友好的新型荧光染料，对推动荧光技术实用化发展具有重要的意义。近红外荧光成像由于其深的组织穿透力、对生物样品的光损伤小、弱散射光以及弱的背景荧光干扰等优点，特别适用于生物体系中荧光成像。

目前，氧杂蒽染料依然是构筑荧光探针和成像试剂的最广泛研究的发光团之一。但是，氧杂蒽染料在研究和发展的过程中仍然存在着一些问题：氧杂蒽染料的Stokes位移一般比较小，导致严重的荧光自淬灭和由于瑞利散射而引起的检测误差。

派洛宁类染料，是氧杂蒽染料的一种，易与RNA结合，使RNA显示红色。甲基绿—派洛宁又叫unna试剂，它们分别能与细胞内的DNA、RNA结合呈现不同颜色，甲基绿与染色质中DNA选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择性结合显示红色。其原因可能是两种染料的混合染液中有竞争作用，RNA对派洛宁亲和力大，而DNA对甲基绿亲和力大。然而由于派洛宁同样存在发射波长短、Stokes位移小等缺点，限制了其在荧光成像领域的应用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供式I所示的化合物，

R₁、R₂、R₃、R₄相同或不同，彼此独立地选自为氢、C_1-16烷基、C_2-16烯基、C_3-20环烷基、C_6-20芳基、-C_1-16烷基-Y、-COC_1-16烷基、-COOC_1-16烷基、-CO-C_6-20芳基、-COO-C_6-20芳基；

或者，所述R₁和/或R₂与苯环上1位和/或9位形成6元环状结构；

或者，所述R₃和/或R₄与苯环上6位和/或7位形成6元环状结构；

Y相同或不同，彼此独立地选自卤素、-OH、-SO₃H、-NH₂、-SH、-COOH、-CN、-CO-卤素、-SO₃-卤素、叠氮基、C_2-16炔基、-COC_1-16烷基、-COC_1-16烷基-C_6-20芳基、-COOC_1-16烷基、-COOC_1-16烷基-C_6-20芳基、-CONH₂、-CON(C_1-16烷基)₂、-CONHC_1-16烷基、-SO₃C_1-16烷基、杂环基、-COO-杂环基、-(O-C_1-16烷基)_m-O-C_1-16烷基、-(O-C_1-16烷基)_m-OH、-(O-C_1-16烷基)_m-C_1-16烷基；

所述C_1-16烷基、C_6-20芳基可以任选地被一个或多个如下基团取代：卤素、C_1-16烷基、-O-C_1-16烷基、-OH、-NH₂、-SH。

m相同或不同，彼此独立地选自0-7的整数；

为有机或者无机阴离子。

在一个实施方式中，所述杂环基优选为：

在一个实施方式中，所述R₁、R₂与苯环上1位和/或9位可以独立成环为以下结构：

在一个实施方式中，所述R₃、R₄与苯环上6位和/或7位可以独立成环成以下结构：

根据本发明的实施方案，R₁、R₂、R₃、R₄相同或不同，彼此独立地选自氢、C_1-8烷基、C_3-10环烷基、C_6-12芳基、C_1-8烷基-Y、-COC_1-8烷基、-COOC_1-8烷基；

在一个实施方式中，

为氯离子、溴离子、碘离子、乙酸根、硫酸根、硝酸根、碳酸根、磷酸根、高氯酸根氯酸根；

在一个实施方式中，m相同或不同，彼此独立地选自为0-4的整数；

在一个实施方式中，Y基团相同或不同，彼此独立地选自卤素、-OH、-SO₃H、-NH₂、-SH、-COOH、-CN、-CO-卤素、-SO₃-卤素、叠氮基、乙炔基、-COC_1-8烷基、-COC_1-8烷基-C_6-12芳基、-COOC_1-8烷基、-COOC_1-8烷基-C_6-12芳基、-CONH₂、-CON(C_1-8烷基)₂、-CONHC_1-8烷基、-SO₃C_1-8烷基、-(O-C_1-8烷基)_m-O-C_1-8烷基、-(O-C_1-8烷基)_m-OH、-(O-C_1-8烷基)_m-C_1-8烷基、

在一个实施方式中，R₁、R₂、R₃、R₄相同或不同，彼此独立地选自为氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、烯丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、己基、2-甲基戊基、环己基、庚基、2-甲基己基、辛基或2-甲基庚基、-CH₂CH₂OCH₂CH₃、-CH₂CH₂OCH₂CH₂OH、-CH₂CH₂(OCH₂CH₂)₂CH₂CH₃、-CH₂CH₂(OCH₂CH₂)₂CH₂CH₂OH、-CH₂CH₂(OCH₂CH₂)₃CH₂CH₃、-CH₂CH₂(OCH₂CH₂)₃CH₂CH₂OH、-CH₂CH₂(OCH₂CH₂)₄CH₂CH₃、-CH₂CH₂(OCH₂CH₂)₄CH₂CH₂OH、-CH₂CH₂SO₃H、-CH₂CH₂CH₂SO₃H、-COCH₃、-CH₂CH₂COOH或-CH₂CH₂CH₂NH₂；

在一个实施方式中，为高氯酸根

氯离子、乙酸根。

作为实例，所述式I化合物选自如下化合物：

本发明还提供如上所述式I化合物的制备方法，包括如下步骤：

化合物II与化合物III在酸的存在下反应，之后再加入HX反应得到化合物I；

其中R为氢、甲氧基、乙氧基、苄氧基、对甲苯磺酸酯基、氟、氯、溴、碘；R₁、R₂、R₃、R₄、

具有上文所述定义。

根据本发明的实施方案，所述反应在溶剂中进行，所述的溶剂选自醇类溶剂或有机酸，例如选自甲醇、乙醇或者乙酸。

根据本发明的实施方案，所述酸选自有机酸或浓的无机酸，例如选自浓硫酸、浓盐酸、乙酸或者质量百分浓度为70％的高氯酸。

根据本发明的实施方案，所述反应在加热的条件下进行，加热的温度为60-150℃。

根据本发明的实施方案，化合物II与化合物III的摩尔比为1：(1～5)。

作为实例，采用下述方法制备化合物I：

将1毫摩尔化合物II与1-5倍摩尔量化合物III混合，在5-20毫升溶剂中形成混合溶液，加入体积占混合溶液0.5-1的浓无机酸，在加热条件下反应1-8小时，冷却后再加入占混合溶液0.5-1倍体积的质量百分浓度为70％的高氯酸，然后慢慢滴加蒸馏水，析出固体，过滤、真空干燥，柱层析分离得化合物I。

本发明还提供式I所示化合物作为荧光染料的应用，所述荧光染料用于生物大分子的荧光标记；优选地，所述生物大分子为核酸或蛋白质。本发明所述荧光染料可以通过非共价键与生物大分子如RNA结合，一些具有羧基、氨基等官能团的本发明所述荧光染料还可以通过共价键与蛋白结合。

本发明还提供式I所示化合物作为荧光染料的应用，所述荧光染料应用于细胞器荧光成像；优选地，所述细胞器包括核仁、线粒体或者溶酶体。

本发明的有益效果如下：

本发明所述化合物是新型苯并派洛宁类近红外荧光染料，具有不对称、非直线型的共轭结构，与派洛宁染料相比，具有更长的吸收波长、近红外发射和更高的荧光量子产率(图1和图2)，同时也具有良好的生物相容性和低毒性。特别是细胞实验表明，其非直线型结构可以快速地进入细胞内部(例如细胞核)，更好地对细胞器如核仁、线粒体进行荧光标记，降低了染料孵育浓度，避免了高浓度染料对细胞正常生理功能的干扰，并且染色速度更快，对于研究细胞器相关的生理学过程有着重要的作用。此外高的荧光量子产率和近红外发射也使得该类染料可以作为共价标记生物大分子的优异染料，用于生物大分子相互作用研究。

本发明的苯并派洛宁类荧光染料发射波长在650nm以上，同时具有较高的荧光量子产率和较大的Stokes位移，细胞实验表明该类化合物具有良好的生物相容性和低毒性。

术语与定义

除非另有说明，本申请说明书和权利要求书中记载的基团和术语定义，包括其作为实例的定义、示例性的定义、优选的定义、表格中记载的定义、实施例中具体化合物的定义等，可以彼此之间任意组合和结合。这样的组合和结合后的基团定义及化合物结构，应当属于本申请说明书记载的范围内。

本说明书和权利要求书记载的数值范围，当该数值范围被定义为“数”时，应当理解为记载了该范围的两个端点、该范围内的每一个整数。例如，“0～7的数”应当理解为不仅记载了1、2、3、4、5、6、7的每一个整数。

术语“C_1-16烷基”应理解为表示具有1～16个碳原子的直链或支链饱和一价烃基。例如，“C_1-8烷基”表示具有1、2、3、4、5、6、7或8个碳原子的直链和支链烷基。所述烷基是例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基或1,2-二甲基丁基等或它们的异构体。

术语“C_2-16烯基”应理解为表示直链或支链的一价烃基，其包含一个或多个双键并且具有2～16个碳原子，优选“C_2-6烯基”。“C_2-6烯基”应理解为优选表示直链或支链的一价烃基，其包含一个或多个双键并且具有2、3、4、5或6个碳原子，特别是2或3个碳原子(“C_2-3烯基”)，应理解，在所述烯基包含多于一个双键的情况下，所述双键可相互分离或者共轭。所述烯基是例如乙烯基、烯丙基、(E)-2-甲基乙烯基、(Z)-2-甲基乙烯基、(E)-丁-2-烯基、(Z)-丁-2-烯基、(E)-丁-1-烯基、(Z)-丁-1-烯基、戊-4-烯基、(E)-戊-3-烯基、(Z)-戊-3-烯基、(E)-戊-2-烯基、(Z)-戊-2-烯基、(E)-戊-1-烯基、(Z)-戊-1-烯基、己-5-烯基、(E)-己-4-烯基、(Z)-己-4-烯基、(E)-己-3-烯基、(Z)-己-3-烯基、(E)-己-2-烯基、(Z)-己-2-烯基、(E)-己-1-烯基、(Z)-己-1-烯基、异丙烯基、2-甲基丙-2-烯基、1-甲基丙-2-烯基、2-甲基丙-1-烯基、(E)-1-甲基丙-1-烯基、(Z)-1-甲基丙-1-烯基、3-甲基丁-3-烯基、2-甲基丁-3-烯基、1-甲基丁-3-烯基、3-甲基丁-2-烯基、(E)-2-甲基丁-2-烯基、(Z)-2-甲基丁-2-烯基、(E)-1-甲基丁-2-烯基、(Z)-1-甲基丁-2-烯基、(E)-3-甲基丁-1-烯基、(Z)-3-甲基丁-1-烯基、(E)-2-甲基丁-1-烯基、(Z)-2-甲基丁-1-烯基、(E)-1-甲基丁-1-烯基、(Z)-1-甲基丁-1-烯基、1,1-二甲基丙-2-烯基、1-乙基丙-1-烯基、1-丙基乙烯基、1-异丙基乙烯基。

术语“C_2-16炔基”应理解为表示直链或支链的一价烃基，其包含一个或多个三键并且具有2～16个碳原子，优选“C₂-C₁₀炔基”。术语“C₂-C₁₀炔基”应理解为表示直链或支链的一价烃基，其包含一个或多个三键并且具有2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子，特别是2或3个碳原子(“C₂-C₃-炔基”)。所述炔基是例如乙炔基、丙-1-炔基、丙-2-炔基、丁-1-炔基、丁-2-炔基、丁-3-炔基、戊-1-炔基、戊-2-炔基、戊-3-炔基、戊-4-炔基、己-1-炔基、己-2-炔基、己-3-炔基、己-4-炔基、己-5-炔基、1-甲基丙-2-炔基、2-甲基丁-3-炔基、1-甲基丁-3-炔基、1-甲基丁-2-炔基、3-甲基丁-1-炔基、1-乙基丙-2-炔基、3-甲基戊-4-炔基、2-甲基戊-4-炔基、1-甲基戊-4-炔基、2-甲基戊-3-炔基、1-甲基戊-3-炔基、4-甲基戊-2-炔基、1-甲基戊-2-炔基、4-甲基戊-1-炔基、3-甲基戊-1-炔基、2-乙基丁-3-炔基、1-乙基丁-3-炔基、1-乙基丁-2-炔基、1-丙基丙-2-炔基、1-异丙基丙-2-炔基、2,2-二甲基丁-3-炔基、1,1-二甲基丁-3-炔基、1,1-二甲基丁-2-炔基或3,3-二甲基丁-1-炔基。特别地，所述炔基是乙炔基、丙-1-炔基或丙-2-炔基。

术语“C_1-16烷基”的定义也适用于其它含C_1-16烷基的基团，例如C_1-16烷基-Y、-COC_1-16烷基、COOC_1-16烷基、CONH₂、CON(C_1-16)₂、CONHC_1-16、SO₃C_1-16、-(O-C_1-16烷基)_m-O-C_1-16烷基、-(O-C_1-16烷基)_m-OH、-(O-C_1-16烷基)_m-C_1-16烷基等。

术语“C_3-20环烷基”应理解为表示饱和的一价单环、双环烃环或桥环烷烃，其具有3～20个碳原子，优选“C_3-10环烷基”。术语“C_3-10环烷基”应理解为表示饱和的一价单环、双环烃环或桥环烷烃，其具有3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子。所述C_3-10环烷基可以是单环烃基，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基或环癸基，或者是双环烃基如十氢化萘环。

术语“C_6-20芳基”应理解为表示具有6～20个碳原子的一价芳香性或部分芳香性的单环、双环或三环烃环，优选“C_6-14芳基”。术语“C_6-14芳基”应理解为优选表示具有6、7、8、9、10、11、12、13或14个碳原子的一价芳香性或部分芳香性的单环、双环或三环烃环(“C_6-14芳基”)，特别是具有6个碳原子的环(“C₆芳基”)，例如苯基；或联苯基，或者是具有9个碳原子的环(“C₉芳基”)，例如茚满基或茚基，或者是具有10个碳原子的环(“C₁₀芳基”)，例如四氢化萘基、二氢萘基或萘基，或者是具有13个碳原子的环(“C₁₃芳基”)，例如芴基，或者是具有14个碳原子的环(“C₁₄芳基”)，例如蒽基。当所述C_6-20芳基被取代时，其可以为单取代或者多取代。并且，对其取代位点没有限制，例如可以为邻位、对位或间位取代。

术语“C_6-20芳基”的定义也适用于其它含C_6-20芳基的基团，例如-CO-C_6-20芳基、-COO-C_6-20芳基等。

术语“杂环基”指包含3至20个原子的饱和、不饱和或部分饱和的单环、二环或三环，其中1、2、3、4或5个环原子选自氮、硫或氧，除非另有说明，其可通过碳或氮来连接，其中-CH₂-基团任选被-C(O)-代替；其中除非另有相反说明，环氮原子或环硫原子任选被氧化以形成N-氧化物或S-氧化物或环氮原子任选被季铵化；其中环中的-NH任选被乙酰基、甲酰基、甲基或甲磺酰基取代；及环任选被一个或多个卤素取代。应该理解的是，当杂环基中S原子和O原子的总数超过1时，这些杂原子不彼此相邻。若所述杂环基为二环或三环，则至少一个环可任选为杂芳族环或芳族环，条件是至少一个环是非杂芳族的。若所述杂环基为单环，则其一定不是芳族的。杂环基的实例包括但不限于哌啶基、N-乙酰基哌啶基、N-甲基哌啶基、N-甲酰基哌嗪基、N-甲磺酰基哌嗪基、高哌嗪基、哌嗪基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、吗啉基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、二氢吲哚基、四氢吡喃基、二氢-2H-吡喃基、四氢呋喃基、四氢噻喃基、四氢噻喃-1-氧化物、四氢噻喃-1,1-二氧化物、1H-吡啶-2-酮和2,5-二氧代咪唑烷基、琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基。

附图说明

图1示出本发明实施例1中荧光染料I-1与派洛宁的吸收对比图。

图2示出本发明实施例1中荧光染料I-1与派洛宁的荧光对比图。

图3示出本发明实施例1中荧光染料I-1将A549细胞染色后的图。

图4示出本发明实施例4中荧光染料I-4将A549细胞染色后的图。

图5示出本发明实施例7中荧光染料I-7将A549细胞染色后的图。

图6示出本发明实施例9中荧光染料I-10将A549细胞染色后的图。

图7示出本发明实施例1中荧光染料I-1加DNA酶和RNA酶消化后并与市售DNA染料(Hoechst 33342)、RNA染料([email protected]^TM)对比图。

图8示出本发明实施例1中荧光染料I-1与商用线粒体染料共染后的图。

图9示出本发明实施例3中荧光染料I-3与商用线粒体染料共染后的图。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

以下实施例中荧光检测结果除非另有说明，否则均是指在二氯甲烷中进行。

实施例1：

化合物II-1根据文献(影像科学与光化学,2015,33(2),154–160)由间N，N-二乙基-氨基苯酚制备，总产率40％。

将0.26g(0.001mol)的化合物II-1和0.27g(0.002mol)的化合物III-1溶于5毫升的乙酸中，加入0.1毫升高氯酸(质量百分浓度为70％)，加热至150℃，反应2h。冷却后加入1毫升高氯酸(质量百分浓度为70％)，然后慢慢滴加蒸馏水，析出固体，过滤、真空干燥，柱层析纯化分离得到0.13g化合物I-1，产率29.3％。ESI MS：m/z,346.2(M+H)。λ^ab. _max/nm＝624nm,λ^em _max/nm＝688nm,Ф_f＝0.66。化合物I-1在二氯甲烷中，相对于派洛宁B，吸收红移了68nm，荧光红移了92nm，Stokes位移增加了1倍，荧光量子产率增加了1.5倍。

实施例2

将0.26g(0.001mol)的化合物II-1和0.16g(0.001mol)的化合物Ⅲ-2溶于10毫升的乙醇中，加入2毫升浓硫酸，加热至80℃，反应3h。冷却后加入0.5毫升高氯酸(质量百分浓度为70％)，慢慢滴加蒸馏水，析出固体，过滤、真空干燥，柱层析纯化分离得到0.16g化合物I-2，产率34.0％。ESI MS：m/z,371.2。λ^ab. _max/nm＝625nm,λ^em _max/nm＝686nm,Ф_f＝0.65。

实施例3

将0.23g(0.001mol)的化合物II-2和0.19g(0.001mol)的化合物III-3溶于5毫升的乙酸中，加入1毫升浓硫酸，加热至100℃，反应2h。冷却后加入2毫升高氯酸(质量百分浓度为70％)，然后慢慢滴加蒸馏水，析出固体，过滤、真空干燥，柱层析纯化分离得到0.13g化合物I-3，产率27.7％。ESI MS：m/z,369.2。λ^ab. _max/nm＝625nm,λ^em _max/nm＝689nm,Ф_f＝0.68。

实施例4

将0.61g(0.001mol)的化合物II-3和0.69g(0.005mol)的化合物III-1溶于10毫升的乙酸中，加入5毫升浓盐酸，加热至100℃，反应1h。冷却后加入2毫升高氯酸(质量百分浓度为70％)，然后慢慢滴加蒸馏水，析出固体，过滤、真空干燥，柱层析纯化分离得到0.17g化合物I-4，产率31.5％。ESI MS：m/z,441.2。λ^ab. _max/nm＝630nm,λ^em _max/nm＝695nm,Ф_f＝0.61。

实施例5

将0.24g(0.001mol)的化合物II-4和0.41g(0.002mol)的化合物III-4溶于20毫升的甲醇中，加入0.5毫升高氯酸(质量百分浓度为70％)，加热至60℃，反应1h。冷却后，慢慢滴加蒸馏水，析出固体，过滤、真空干燥，柱层析纯化分离得到0.19g化合物I-5，产率36.5％。ESI MS：m/z,425.2。λ^ab. _max/nm＝626nm,λ^em _max/nm＝685nm,Ф_f＝0.59。

实施例6

将0.26g(0.001mol)的化合物II-5和0.31g(0.001mol)的化合物III-5溶于8毫升的乙酸中，加入1毫升高氯酸(质量百分浓度为70％)，加热至80℃，反应8h。冷却后加入1毫升高氯酸(质量百分浓度为70％)，慢慢滴加蒸馏水，析出固体，过滤、真空干燥，柱层析纯化分离得到0.13g化合物I-6，产率21.3％。ESI MS：m/z,513.4。λ^ab. _max/nm＝627nm,λ^em _max/nm＝690nm,Ф_f＝0.41。

实施例7

将0.26g(0.001mol)的化合物II-1和0.57g(0.002mol)的化合物III-6溶于20毫升的乙醇中，加入2毫升浓硫酸，加热至80℃，反应3h。冷却后加入1毫升高氯酸(质量百分浓度为70％)，慢慢滴加蒸馏水，析出固体，过滤、真空干燥，柱层析纯化分离得到0.11g化合物I-7，产率12.0％。ESI MS：m/z,493.3。λ^ab. _max/nm＝626nm,λ^em _max/nm＝690nm,Ф_f＝0.39。

实施例8

将0.23g(0.001mol)的化合物II-2和0.22g(0.001mol)的化合物III-7溶于10毫升的乙酸中，加入0.1毫升浓高氯酸(70％)，加热至100℃，反应3h。冷却后加入2毫升高氯酸(质量百分浓度为70％)，然后慢慢滴加蒸馏水，析出固体，过滤、真空干燥，柱层析纯化分离得到0.11g化合物I-8，产率22.0％。ESI MS：m/z,401.4。λ^ab. _max/nm＝625nm,λ^em _max/nm＝686nm,Ф_f＝0.45。

将0.1g(0.2mmol)化合物I-8、0.046g(0.4mmol)N-羟基丁二酰亚胺、0.041g(0.2mmol)二环己基碳二亚胺溶于5毫升干燥的DMF，氮气保护下80℃反应2小时，冷却、过滤，滤液蒸干溶剂柱层析分离得到0.05g化合物I-9，产率41.7％。ESI MS：m/z,498.2。λ^ab. _max/nm＝625nm,λ^em _max/nm＝685nm,Ф_f＝0.46。

实施例9

将0.23g(0.001mol)的化合物II-2和0.27g(0.001mol)的化合物III-8溶于5毫升的乙酸中，加入0.1毫升浓高氯酸(质量百分浓度为70％)，加热至100℃，反应5h。冷却后加入5毫升高氯酸(质量百分浓度为70％)，然后慢慢滴加蒸馏水，析出固体，过滤、真空干燥，柱层析纯化分离得到0.15g化合物I-10，产率27.2％。ESI MS：m/z,451.2。λ^ab. _max/nm＝624nm,λ^em _max/nm＝688nm,Ф_f＝0.48。

实施例10

将0.23g(0.001mol)的化合物II-6和0.21g(0.001mol)的化合物III-9溶于5毫升的乙酸中，加入0.2毫升浓高氯酸(质量百分浓度为70％)，加热至80℃，反应1h。冷却后加入2毫升高氯酸(质量百分浓度为70％)，然后慢慢滴加蒸馏水，析出固体，过滤、真空干燥，柱层析纯化分离得到0.18g化合物I-11，产率37.5％。ESI MS：m/z,386.2。λ^ab. _max/nm＝625nm,λ^em _max/nm＝688nm,Ф_f＝0.38。

将化合物I-11与5倍量顺丁烯二酸酐反应在DMSO中反应24小时，即可得到化合物I-12，产率52.6％。ESI MS：m/z,466.2。λ^ab. _max/nm＝625nm,λ^em _max/nm＝687nm,Ф_f＝0.40。

实施例11

将0.23g(0.001mol)的化合物II-2和0.15g(0.001mol)的化合物III-10溶于5毫升的乙酸中，加热至60℃，反应5h。冷却后加入3毫升高氯酸(质量百分浓度为70％)，然后慢慢滴加蒸馏水，析出固体，过滤、真空干燥，柱层析纯化分离得到0.150g化合物I-13，产率23.2％。ESI MS：m/z,331.1。λ^ab. _max/nm＝620nm,λ^em _max/nm＝680nm,Ф_f＝0.22。

实施例12

化合物I-9与核苷酸氨基烯丙基-dUTP偶联：

将0.30g(0.0002mol)化合物I-9的DMF溶液加入到0.10g(0.0002mol)烯丙基-dUTP的缓冲溶液中(pH＝8)，室温下搅拌20小时，浓缩后柱层析纯化分离得到0.25g化合物A-1，产率25.0％。ESI MS：m/z,899.2。

实施例13

化合物I-12与带巯基氨基酸偶联：

将0.56g(0.001mol)化合物I-12与0.12g(0.001mol)半胱氨酸溶于10毫升乙醇中，室温下搅拌1小时，浓缩后柱层析纯化分离得到0.21g化合物A-2，产率30.6％。ESI MS：m/z,587.2。

实施例14

A549细胞染色实验：细胞接种于共聚焦皿，在37℃，5％CO₂条件下培养24小时后，加入化合物I-1、I-4、I-7、I-10孵育后，样品不需洗涤，在活细胞工作站中保持37℃、5％CO₂、饱和湿度，用激光共聚焦显微镜，选用637nm的激光激发进行拍摄成像。其成像图片如图3、4、5、6所示。由图3、4、5、6可知上述实施例制备的带有不同取代基的染料均能很好的透过细胞膜和核膜，对细胞器进行非共价标记。

实施例15

DNA酶和RNA酶消化实验：将一定密度的A549细胞接种于共聚焦皿中，培养24h后，细胞用-20℃的冰甲醇固定1min，接着用1％的Triton-100PBS溶液(磷酸缓冲盐溶液)室温下进行细胞打孔(1min)，PBS洗涤两次，1mL含20μ/mL DNase(Takara)(DNA酶)，或是25μg/mLDNase-Free RNase(Takara)(RNA酶)的PBS加入共聚焦皿中，37℃，5％CO₂下孵育2h。PBS洗涤两次后加入1mL含化合物I-1的PBS溶液(化合物I-1:1μM,DNA染料Hoechst 33342:1μg/mL,RNA染料[email protected]^TM:0.5μM)孵育10min，PBS洗涤两次共聚焦成像。未经酶消化的固定打孔后的样品经探针染色后作为对照样，成像时采用相同的曝光时间。各探针激发波长及图像采集通道为：化合物I-1：637nm，Cy5，DAPI：405nm，DAPI，[email protected]^TM：488nm，FITC。其成像结果如图7所示，RNA酶消化后，染料I-1细胞核内核仁的染色区域的红色荧光几乎消失，且有转向细胞核染色的趋势，但是DNA酶消化后，核仁染色荧光强度变化不明显；该现象与DNA染料Hoechst 33342变化相反，与[email protected]^TM变化相同。表明化合物I-1能够进入细胞核，与核仁中RNA结合成像。

实施例16

共染实验：往接种有A549细胞的共聚焦皿里分别加入1mL含相应浓度的化合物I-1、或化合物I-3的培养液，37℃、5％CO₂下孵育30min，移去培养液，加入1mL含商用线粒体染料Green^FM(Yeasen公司)的培养液，孵育30min，PBS洗涤两次后共聚焦成像。其中化合物I-1、或化合物I-3为5μM，MitoTracker Green为50nM。其结果如图8、图9所示，染料I-1、I-3的细胞质内染色区域与商用线粒体的染色区域几乎重合，表明该类化合物在细胞质中能够很好地定位线粒体。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。