阅读说明：本技术 一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法 (Preparation method of lipopeptide biosurfactant ) 是由 石俊峰 于 2020-05-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法,所述的脂肽类生物表面活性剂是采用枯草芽孢杆菌菌株进行发酵培养得到脂肽类生物表面活性剂产品,所述的制备方法包括：(1)产脂肽枯草芽孢杆菌菌种的构建；(2)初级发酵培养；(3)次级发酵培养；(4)分离提纯。本发明的制备方法简单,周期短。所制备得到的脂肽类生物表面活性剂对温度和矿化度具有良好的耐受性,生物活性强。(The invention discloses a preparation method of a lipopeptide biosurfactant, wherein the lipopeptide biosurfactant is a lipopeptide biosurfactant product obtained by fermenting and culturing bacillus subtilis strains, and the preparation method comprises the following steps: (1) constructing a lipopeptide-producing bacillus subtilis strain; (2) primary fermentation culture; (3) secondary fermentation culture; (4) and (5) separating and purifying. The preparation method is simple and has short period. The prepared lipopeptide biosurfactant has good tolerance to temperature and mineralization degree and strong bioactivity.)

一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物表面活性剂的制备工艺，具体涉及一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法。

背景技术

表面活性剂是一种能显著改变液体表面张力或两相之间的界面张力的物质，由于其具有良好的乳化、发泡、消泡、增溶、分散等作用，因而被广泛应用于国民经济的各个领域，几乎覆盖所有的精细化工领域。随着这些产品需求增加，全球表面活性剂市场处于稳步发展状态。合成表面活性剂通常利用石油基质生产，其应用也十分广泛，它在食品、农作物保护、肥皂和洗涤剂、清洁剂、油田化学品、个人护理用品、塑料、制药、橡胶、纺织、造纸、油墨和印刷行业都普遍使用。目前合成表面活性剂的需求和消费量都比较稳定，市场分析认为，这部分产品的需求增加主要原因为成本较低和易于制取，此外，大量的海上钻井活动和页岩气开采增多都给合成表面活性剂生产提供了丰富的原材料，进一步推动了这个市场的发展。

出于对环境可持续问题的考虑，以及全球环境形势的日益严峻，各国都在不断加强对环境问题的管控和治理，纷纷出台了严格的环境相关法律法规，并列入长期发展计划。未来几年合成表面活性剂的需求将受到严重影响，随着对合成表面活性剂使用情况的关注增多，市场上出现了许多环境友好且可生物降解的产品。合成表面活性剂可能造成的环境和健康风险，使得多国政府和行业人士重新开始考虑表面活性剂的可生物降解性，由此引发了全球对生物表面活性剂的研究热潮和商业机遇。

欧盟已经建立起生物表面活性剂市场，并且在消费量和生产量方面都处于全球领先地位，因此欧盟也提出许多评估和控制不同领域表面活性剂使用的规章制度，比如REACH（化学品注册、评估、许可和限制）就用于确保所有市售的洗涤剂、肥皂和保养产品对于终端用户和环境均无害。根据REACH规定，表面活性剂生产商需要对传统的合成表面活性剂进行风险评估，并要求他们生产环境友好型可生物降解的表面活性剂，这些都显著推动了生物表面活性剂市场的发展。除了新制定的规章制度对生物表面活性剂市场有推动作用，许多其他因素也在促进生物表面活性剂市场发展，如消费者对生物产品的认识更加清晰，需求也逐步增多；原油价格波动；经济情况复苏和消费者对日用品的支出增加。

在过去三年中，欧洲生物表面活性剂市场占全球市场50%的市场份额。目前市场基本保持6%的年平均增长率。2015年，全球生物表面活性剂市场总价值为19.5亿美元，销售量达到35.7万吨，而2015年，全球表面活性剂市场总价值为340亿美元，销售量达到1480万吨。目前生物表面活性剂市场占表面活性剂市场份额不到6%，随着环保趋势的严峻，传统化石能源的枯竭，人们绿色观念的牢固，生物表面活性剂替代传统石油基表面活性剂的趋势是显而易见的，整个生物表面活性剂的市场是不断放大、持续增长的，行业正处于蓄势待发的喷薄之势。

然而，生物表面活性剂市场在充满机遇的同时也面临许多挑战。生物表面活性剂的使用受到了一定的限制，比如其生产周期长，成本高，工艺复杂，供应商较少等。但是，未来生物表面活性剂能够创造的经济价值和社会价值能够帮助该市场克服这些挑战。

生物表面活性剂除了在石油工业和环境工程等一些特殊领域受到重视外，随着生物技术和相关技术手段的快速发展，它不仅在一些领域逐步代替化学合成的表面活性剂，而且突破了传统的表面活性剂的应用领域，生物表面活性剂的研究在我国处于起步阶段，在发达国家也是新兴领域，其工业化水平较低，技术不成熟，但有很大的发展潜力。与动植物生长速率相比，微生物具有更短的代时，因此通过微生物来生产生物表面活性剂更容易。所以用微生物发酵生产作为表面活性剂家族的后起之秀的生物表面活性剂，来代替化学合成表面活性剂或作为其升级换代产品，有着巨大的社会效益、经济效益和生态效益。

发明内容

本发明的主要目的在于，克服现有的生物表面活性剂制备工艺组中存在的成本高、工艺复杂的缺陷，提供一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法。本发明的脂肽类生物表面活性剂的制备工艺利用复合诱变技术进行高产菌株的选育，筛选出高效菌种以及建立快速检测生物表面活性剂高产菌株并评价其潜力的方法，为脂肽生物表面活性剂的生产和研究提供条件。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提供了一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法，所述的脂肽类生物表面活性剂是采用枯草芽孢杆菌菌株进行发酵培养得到脂肽类生物表面活性剂产品，所述的制备方法包括以下步骤：

（1）产脂肽枯草芽孢杆菌菌种的构建：获取枯草芽孢杆菌产脂肽的基因序列，进行PCR扩增，构建包含该基因的质粒，再导入宿主枯草芽孢杆菌细胞中，完成产脂肽枯草芽孢杆菌菌种的构建；

（2）初级发酵培养：将上述构建的枯草芽孢杆菌菌种接入摇瓶培养，摇瓶中每500ml培养基接入1环菌种，在一定条件下发酵，得到初级摇瓶菌种；

（3）次级发酵培养：将上述步骤制得的摇瓶菌种转接入装有培养基的发酵罐中，摇瓶菌种与培养基的体积比为1:20，在一定条件下发酵培养，得到次级发酵菌种；

（4）分离提纯：将上述步骤中得到的发酵液经离心去除菌体，上清液加入等体积的氯仿/甲醇(1~2/1~3,V/V)，萃取，取萃取液的下层液，50~70℃减压蒸干得生物表面活性剂粗品，氯仿再次洗涤50~70℃蒸干得较纯的脂肽生物表面活性剂。

在本发明的一些优选的实施方案中，按照重量比计，所述步骤（2）中所述摇瓶培养基的配方是：米糠油3～4%、NH₄NO 0.4～1.5%、葡萄糖20～30%、NaCl 0.05～1.0%、KH₂PO₄0.05～1.0%、K₂HPO₄ 0.05～1.0%、酵母膏0.005～0.1%、复合微量元素0.005～0.01%，余量为水，pH为6.0 ~7.5。

在本发明的一些优选的实施方案中，所述复合微量元素主要由氧化锌1.0g/L、氧化锡1.5g/L、硫酸锰1.2g/L、氯化铜1.1g/L、氧化钴0.9g/L及水复配而成。

在本发明的一些优选的实施方案中，所述步骤（2）中所述发酵条件为：温度40~50℃，pH 7.0~7.5，搅拌速度为120r/min，发酵时间为72~96h。

在本发明的一些优选的实施方案中，所述步骤（3）中所述发酵条件为：温度40~50℃，pH 7.0~7.5，搅拌速度为90r/min，发酵时间为10~12h。

在本发明的一些优选的实施方案中，所述步骤（3）中所述发酵罐的培养基配方包括：碳源、氮源、无机盐及营养元素。

在本发明的一些优选的实施方案中，所述碳源选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、麦芽糖、大豆糖蜜、甘油、蔗糖糖蜜中的一种或多种的混合。

在本发明的一些优选的实施方案中，所述氮源选自豆饼粉、蛋白胨、牛肉粉、玉米浆、酵母粉、硝酸铵、硫酸铵、尿素中的一种或多种的混合。

在本发明的一些优选的实施方案中，所述无机盐及营养元素选自K₂HPO₄、NaH₂PO₄、MgSO₄、FeSO₄、CaCO₃、CaCl₂、KCl、NaCl中的一种或多种的混合。

在本发明的一些优选的实施方案中，所述步骤（4）中离心条件为；转速8000~10000r/min，时间10~20min。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点：本发明是对现有技术的改进，本发明的脂肽类生物表面活性剂是采用枯草芽孢杆菌菌株进行发酵培养得到脂肽类生物表面活性剂产品。本发明提供的脂肽类生物表面活性剂的制备方法简单，条件温和，培养周期短。所得到的脂肽类的生物表面活性剂纯度高，活性强，对温度和盐均具有良好的耐受性，具有广泛的应用前景。

综上所述，本发明特殊的脂肽类生物表面活性剂的制备方法能够有效提高产物的产量，缩短培养周期。其具有上述诸多的优点及实用价值，并在同类方法中未见有类似的设计公开发表或使用而确属创新，其不论在方法上或功能上皆有较大的改进，在技术上有较大的进步，并产生了好用及实用的效果，且较现有的方法具有增进的多项功效，从而更加适于实用，而具有产业的广泛利用价值，诚为一新颖、进步、实用的新设计。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并结合附图详细说明如后。

附图说明

图1为脂肽生物表面活性剂的临界胶束浓度CMC值；

图2为脂肽生物表面活性剂的热稳定性；

图3为矿化度对脂肽水溶液界面张力的影响。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

从数据库中获取枯草芽孢杆菌产脂肽的基因序列，进行PCR扩增，构建包含该基因的质粒，再导入宿主枯草芽孢杆菌细胞中，完成产脂肽枯草芽孢杆菌菌种的构建。然后以构建的产脂肽枯草芽孢杆菌为菌种进行培养，培养过程总共分为初级发酵培养和次级发酵培养。初级发酵培养过程包括将上述构建的枯草芽孢杆菌菌种接入摇瓶培养，摇瓶培养基的配方是：米糠油3%、NH₄NO 1.5%、葡萄糖30%、NaCl 0.05%、KH₂PO₄ 1.0%、K₂HPO₄ 0.05%、酵母膏0.005%、复合微量元素（氧化锌1.0g/L、氧化锡1.5g/L、硫酸锰1.2g/L、氯化铜1.1g/L、氧化钴0.9g/L及水复配而成）0.01%，余量为水，pH为6.0~7.5。摇瓶中每500ml培养基接入1环菌种，在温度50℃，pH 7.0~7.5，搅拌速度为120r/min的条件下发酵96h，得到初级摇瓶菌种。次级发酵培养：将上述步骤制得的摇瓶菌种转接入装有培养基的发酵罐中，发酵罐培养基配方包括：葡萄糖50%，蛋白胨7%，K₂HPO₄ 2%、NaH₂PO₄ 3%、MgSO₄ 1.5%、FeSO₄ 1.2%，其余为水。摇瓶菌种与培养基的体积比为1:20，在温度40℃，pH 7.0~7.5，搅拌速度为90r/min条件下发酵培养10h，得到次级发酵菌种。将得到的发酵液10000r/min下离心10min去除菌体，上清液加入等体积的氯仿/甲醇(1~2/1~3,V/V)，萃取，取萃取液的下层液，60℃减压蒸干得生物表面活性剂粗品，氯仿再次洗涤60℃蒸干得较纯的脂肽生物表面活性剂。

实施例2

从数据库中获取枯草芽孢杆菌产脂肽的基因序列，进行PCR扩增，构建包含该基因的质粒，再导入宿主枯草芽孢杆菌细胞中，完成产脂肽枯草芽孢杆菌菌种的构建。然后以构建的产脂肽枯草芽孢杆菌为菌种进行培养，培养过程总共分为初级发酵培养和次级发酵培养。初级发酵培养过程包括将上述构建的枯草芽孢杆菌菌种接入摇瓶培养，摇瓶培养基的配方是：米糠油4%、NH₄NO 1.0%、葡萄糖25%、NaCl 0.08%、KH₂PO₄ 1.0%、K₂HPO₄ 1.0%、酵母膏0.1%、复合微量元素（氧化锌1.0g/L、氧化锡1.5g/L、硫酸锰1.2g/L、氯化铜1.1g/L、氧化钴0.9g/L及水复配而成）0.005%，余量为水，pH为6.0~7.5。摇瓶中每500ml培养基接入1环菌种，在温度45℃，pH 7.0~7.5，搅拌速度为120r/min的条件下发酵72h，得到初级摇瓶菌种。次级发酵培养：将上述步骤制得的摇瓶菌种转接入装有培养基的发酵罐中，发酵罐培养基配方包括：葡萄糖50%，蛋白胨7%，K₂HPO₄ 2%、NaH₂PO₄ 3%、MgSO₄ 1.5%、FeSO₄ 1.2%，其余为水。摇瓶菌种与培养基的体积比为1:20，在温度50℃，pH 7.0~7.5，搅拌速度为90r/min条件下发酵培养12h，得到次级发酵菌种。将得到的发酵液10000r/min下离心20min去除菌体，上清液加入等体积的氯仿/甲醇(1~2/1~3,V/V)，萃取，取萃取液的下层液，60℃减压蒸干得生物表面活性剂粗品，氯仿再次洗涤60℃蒸干得较纯的脂肽生物表面活性剂。

实施例3

从数据库中获取枯草芽孢杆菌产脂肽的基因序列，进行PCR扩增，构建包含该基因的质粒，再导入宿主枯草芽孢杆菌细胞中，完成产脂肽枯草芽孢杆菌菌种的构建。然后以构建的产脂肽枯草芽孢杆菌为菌种进行培养，培养过程总共分为初级发酵培养和次级发酵培养。初级发酵培养过程包括将上述构建的枯草芽孢杆菌菌种接入摇瓶培养，摇瓶培养基的配方是：米糠油4%、NH₄NO 1.0%、葡萄糖25%、NaCl 0.08%、KH₂PO₄ 1.0%、K₂HPO₄ 1.0%、酵母膏0.1%、复合微量元素（氧化锌1.0g/L、氧化锡1.5g/L、硫酸锰1.2g/L、氯化铜1.1g/L、氧化钴0.9g/L及水复配而成）0.005%，余量为水，pH为6.0~7.5。摇瓶中每500ml培养基接入1环菌种，在温度40℃，pH 7.0~7.5，搅拌速度为120r/min的条件下发酵84h，得到初级摇瓶菌种。次级发酵培养：将上述步骤制得的摇瓶菌种转接入装有培养基的发酵罐中，发酵罐培养基配方包括：葡萄糖40%，蛋白胨12%，K₂HPO₄ 3%、NaH₂PO₄ 4%、MgSO₄ 1.5%、FeSO₄ 1.2%，其余为水。摇瓶菌种与培养基的体积比为1:20，在温度45℃，pH 7.0~7.5，搅拌速度为90r/min条件下发酵培养12h，得到次级发酵菌种。将得到的发酵液8000r/min下离心20min去除菌体，上清液加入等体积的氯仿/甲醇(1~2/1~3,V/V)，萃取，取萃取液的下层液，60℃减压蒸干得生物表面活性剂粗品，氯仿再次洗涤60℃蒸干得较纯的脂肽生物表面活性剂。

实施例4

从数据库中获取枯草芽孢杆菌产脂肽的基因序列，进行PCR扩增，构建包含该基因的质粒，再导入宿主枯草芽孢杆菌细胞中，完成产脂肽枯草芽孢杆菌菌种的构建。然后以构建的产脂肽枯草芽孢杆菌为菌种进行培养，培养过程总共分为初级发酵培养和次级发酵培养。初级发酵培养过程包括将上述构建的枯草芽孢杆菌菌种接入摇瓶培养，摇瓶培养基的配方是：米糠油4%、NH₄NO 1.0%、葡萄糖20%、NaCl 1.0%、KH₂PO₄ 0.05%、K₂HPO₄ 1.0%、酵母膏0.1%、复合微量元素（氧化锌1.0g/L、氧化锡1.5g/L、硫酸锰1.2g/L、氯化铜1.1g/L、氧化钴0.9g/L及水复配而成）0.005%，余量为水，pH为6.0~7.5。摇瓶中每500ml培养基接入1环菌种，在温度40℃，pH 7.0~7.5，搅拌速度为120r/min的条件下发酵96h，得到初级摇瓶菌种。次级发酵培养：将上述步骤制得的摇瓶菌种转接入装有培养基的发酵罐中，发酵罐培养基配方包括：葡萄糖40%，蛋白胨12%，K₂HPO₄ 3%、NaH₂PO₄ 4%、MgSO₄ 1.5%、FeSO₄ 1.2%，其余为水。摇瓶菌种与培养基的体积比为1:20，在温度50℃，pH 7.0~7.5，搅拌速度为90r/min条件下发酵培养10h，得到次级发酵菌种。将得到的发酵液8000r/min下离心10min去除菌体，上清液加入等体积的氯仿/甲醇(1~2/1~3,V/V)，萃取，取萃取液的下层液，60℃减压蒸干得生物表面活性剂粗品，氯仿再次洗涤60℃蒸干得较纯的脂肽生物表面活性剂。

试验例1 脂肽类生物表面活性剂性能评价

试验产品：实施例1制得的脂肽生物表面活性剂

1、脂肽表面活性剂临界胶束浓度(CMC)的测定

临界胶束浓度测定：将实施例1得到的纯化样品用水等倍稀释，当溶液浓度低于0.035mg/mL时，随着浓度增加，水的表面张力相应降低，当样品浓度高于0.035mg/mL时，增加样品浓度不能使水的表面张力进一步降低，表明样品的临界胶束浓度约为 0.035mg/mL，结果见图1。

2、温度和矿化度对脂肽生物表面活性剂的影响

(1)温度

用pH7.0的蒸馏水制备CMC(临界胶束浓度，35mg·L^-1)浓度的脂肽水溶液，用于测定温度对脂肽生物表面活性剂的表面活性的影响。在不同温度处理不同时间(1或2h)，冷却至室温后测定其界面张力值。结果显示，温度在50～120℃对脂肽处理1～2h，对其界面张力没有影响，该脂肽生物表面活性剂在经受120℃两小时的热处理后，其界面张力仍不降低，说明该脂肽生物表面活性剂对温度变化具有较强的耐受性，结果见图2。

(2)矿化度

在CMC(临界胶束浓度，35mg·L^-1)浓度的脂肽水溶液中加入NaCl，使其浓度为0.0wt％、2.0wt％、4.0wt％、6.0wt％、8.0wt％、10.0wt％、12.0wt％、14.0wt％、16.0wt％、20.0wt％，在45℃下分别测定不同NaCl浓度的脂肽溶液的界面张力值。结果显示在浓度达到14.0％以前，NaCl对其表面张力没有实质的影响。但再提高NaCl 的浓度表面活性就逐渐被抑制，界面张力值逐渐增大。以上结果表明，该脂肽生物表面活性剂对盐有极高的耐受性，浓度高达14.0 wt％的盐对发酵液的表面张力基本没有影响，结果见图3。

综上所述，本发明的脂肽生物表面活性剂具有良好的耐受性和矿化度。本发明的脂肽类生物表面活性剂是采用枯草芽孢杆菌菌株进行发酵培养得到脂肽类生物表面活性剂产品。本发明提供的脂肽类生物表面活性剂的制备方法简单，条件温和，培养周期短。所得到的脂肽类的生物表面活性剂纯度高，对温度和盐均具有良好的耐受性，具有广泛的应用前景。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。