阅读说明：本技术 一种含抗菌肽的无抗生素饲料添加剂及其制备方法 (Antibiotic-free feed additive containing antibacterial peptide and preparation method thereof ) 是由 张志东 刘培冉 赵学峰 冯艳忠 刘刚 于 2019-03-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及无抗饲料添加剂技术领域,特别涉及一种含抗菌肽的无抗生素饲料添加剂,包括麦芽、玉米秸秆、乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、硫色曲霉菌、吐温-80、梓叶、谷精草。本发明的有益效果：不含抗生素,在起到促进动物生长,提高动物抗病能力,提高日增重,降低料肉比,提高动物饲料利用效率等作用；采用3种复合菌种制备抗菌肽,克服了发酵过程PH改变对产肽的影响；秸秆壳与秸秆芯分离后使用,秸秆壳与秸秆芯分别发挥各自特点,物尽其用,提高了利用率。将梓叶与谷精草的有用物质提取出来,增强了使用效果与便利性。(The invention relates to the technical field of antibiotic-free feed additives, and particularly relates to an antibiotic-free feed additive containing antibacterial peptide, which comprises malt, corn straw, lactobacillus, bacillus subtilis, aspergillus thiochrus, tween-80, catalpa ovata and pipewort. The invention has the beneficial effects that: the feed additive does not contain antibiotics, and has the effects of promoting the growth of animals, improving the disease resistance of the animals, increasing the daily gain, reducing the feed conversion ratio, improving the utilization efficiency of the animal feed and the like; 3 kinds of composite strains are adopted to prepare the antibacterial peptide, so that the influence of pH change in the fermentation process on peptide production is overcome; the straw shells and the straw cores are used after being separated, and the straw shells and the straw cores respectively play their own characteristics, so that the straw shells and the straw cores are fully used, and the utilization rate is improved. The useful substances of catalpa leaves and pipewort are extracted, so that the use effect and convenience are enhanced.)

一种含抗菌肽的无抗生素饲料添加剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及无抗饲料添加剂技术领域，特别涉及一种含抗菌肽的无抗生素饲料添加剂及其制备方法。

背景技术

抗生素的滥用或长期使用抗生素会对整个生态环境造成极大的安全隐患，使动物机体产生依赖性，限制了体内免疫细胞机能发挥，使动物免疫力、抗病力下降；抗生素抑制或杀死动物肠道内有害菌同时，也抑制或杀死了有益微生物，使正常微生物系统失衡；会造成动物体内抗生素残留，对食品安全造成威胁，对人体健康不利。

抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMP)是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分

子多肽，分子量在2000～7000左右，由20～60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有广谱抗菌的特点。与抗生素相比，抗菌肽安全性高，对人和动物正常细胞无害，属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类生物制剂，在无抗饲料中有广阔的应用前景。

现有技术中使用一种菌来生产抗菌肽，每种菌都有最适的PH，发酵过程中需要控制发酵液的PH，但是在发酵过程中发酵液的PH是不断变化的，随着发酵的进行，发酵液PH变小，枯草芽孢杆菌的产肽能力会逐渐变小直至丧失。现有技术中使用玉米秸秆为原料，一般直接粉碎使用，秸秆壳与秸秆芯不能很好得发挥各自特点；关于梓叶与谷精草的应用，中国古代就有文献报道，但是一直是以原植物直接饲喂动物，使用效果较差。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明提供了一种采用3种复合菌种制备抗菌肽、可起到促进动物生长，提高动物抗病能力的含抗菌肽的无抗生素饲料添加剂及其制备方法。

本发明所述技术方案如下：

一种含抗菌肽的无抗生素饲料添加剂，包括麦芽、玉米秸秆、乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、硫色曲霉菌、吐温-80、梓叶、谷精草。

一种含抗菌肽的无抗生素饲料添加剂的制备方法，具体步骤如下：

(1)玉米秸秆壳、芯分离

利用机械技术将玉米秸秆分离开，并分别粉碎，秸秆壳粉碎成粗粉，秸秆芯粉碎成细粉；

(2)麦芽汁糖化

麦芽加水以1：4-1：6的比例制成麦芽匀浆保温45-55℃，步骤(1)中的秸秆壳粗粉蒸制后晾凉至45-55℃，与麦芽匀浆混合均匀，在糖化锅中混合并45-55度保温60-90min，进行蛋白质的分解，然后在55-60℃糖化2-4h，再升温到75-78℃，糖化2-4h，秸秆壳粉与麦芽的质量比为5：1—15：1；

(3)添加菌种发酵

将乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、硫色曲霉菌中两种以上的菌粉按照一定比例加入35-37℃含0.01％(m/m)葡萄糖的的温水中，活化1小时，将活化后的菌液均匀拌入糖化后的秸秆粗粉中，装入发酵桶保持温度35-37℃，持续发酵10h，发酵完成添加0.01％(m/m)的吐温-80并均匀搅拌后压滤，滤液10000—12000r/min离心8-10min，得到发酵液上清液，上清液通过截留分子量为20kDa的超滤膜超滤，收集的滤液再经过截留分子量为1000Da的超滤膜超滤，弃去滤过液，所得即是含抗菌肽的发酵液，抗菌肽活性达6000U/ml，菌粉总重量至少为麦芽重量的1/10；

(4)含抗菌肽的发酵液与玉米芯粉混合

将步骤(3)中所制得的含抗菌肽的发酵液与步骤(1)所制得的秸秆芯粉混合，即得承载抗菌肽的玉米芯粉。

(5)植物提取物的制备

梓叶和谷精草中的一种或两种，置20倍质量体积比的75％的乙醇中回流提取，提取液减压浓缩至干，粉碎过筛，即得植物提取物；

(6)承载抗菌肽的玉米芯粉与植物提取物按照质量比1：1混合均与，即得无抗饲料添加剂。

优选地，步骤(2)中，麦芽加水1：4的制成麦芽匀浆保温50℃，步骤(1)中的秸秆壳粗粉蒸制后晾凉50℃，与麦芽匀浆混合均匀，在糖化锅中混合并50度保温60min，进行蛋白质的分解，然后在58℃糖化3h，再升温到78℃，糖化3h，秸秆壳粉与麦芽的质量比为9：1。

步骤(4)中，所述的发酵液与秸秆芯粉的质量比为1：3。

本发明的有益效果：

(1)不含抗生素，在起到促进动物生长，提高动物抗病能力，提高日增重，降低料肉比，提高动物饲料利用效率等作用的同时没有抗生素的危害。

(2)采用3种复合菌种制备抗菌肽，克服了发酵过程PH改变对产肽的影响。

(3)秸秆壳与秸秆芯分离后使用，秸秆壳与秸秆芯分别发挥各自特点，物尽其用，提高了利用率。

(4)将梓叶与谷精草的有用物质提取出来，增强了使用效果与便利性。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施方式作进一步地详细描述。

实施例1：

利用机械技术将玉米秸秆分离开，并分别粉碎，秸秆壳粉碎成粗粉，秸秆芯粉碎成细粉。

实施例2：

1Kg麦芽加4Kg水制成麦芽匀浆保温45℃，取实施例1中所制秸秆壳粗粉9Kg蒸制后晾凉至45℃，与麦芽匀浆混合均匀，在糖化锅中混合并45℃保温60min，进行蛋白质的分解，然后在55℃糖化2h，再升温到75℃，糖化2h。将乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、硫色曲霉菌的菌粉按照2：2：1的比例混合均匀后取100g加入5000ml35℃含0.01％(m/m)葡萄糖的温水中，活化1小时。将活化后的菌液均匀拌入糖化后的秸秆粗粉中，保持温度35℃，持续发酵10h。发酵完成添加0.01％(m/m)的吐温-80并均匀搅拌后压滤，滤液10000-12000r/min离心8-10min，得到发酵液上清液，上清液通过截留分子量为20kDa的超滤膜超滤，收集的滤液再经过截留分子量为1000Da的超滤膜超滤，弃去滤过液，所得即是含抗菌肽的发酵液。

实施例3：

1Kg麦芽加5Kg水制成麦芽匀浆保温50℃，取实施例1中所制秸秆壳粗粉9Kg蒸制后晾凉至50℃，与麦芽匀浆混合均匀，在糖化锅中混合并50℃保温60min，进行蛋白质的分解，然后在60℃糖化3h，再升温到78℃，糖化3h。将乳酸杆菌、硫色曲霉菌的菌粉按照1：1的比例混合均匀后取100g加入5000ml37℃含0.01％(m/m)葡萄糖的温水中，活化1小时。将活化后的菌液均匀拌入糖化后的秸秆粗粉中，保持温度35℃，持续发酵10h。发酵完成添加0.01％(m/m)的吐温-80并均匀搅拌后压滤，滤液10000-12000r/min离心8-10min，得到发酵液上清液，上清液通过截留分子量为20kDa的超滤膜超滤，收集的滤液再经过截留分子量为1000Da的超滤膜超滤，弃去滤过液，所得即是含抗菌肽的发酵液。

实施例4：

1Kg麦芽加6Kg水制成麦芽匀浆保温55℃，取实施例1中所制秸秆壳粗粉9Kg蒸制后晾凉至55℃，与麦芽匀浆混合均匀，在糖化锅中混合并55℃保温90min，进行蛋白质的分解，然后在60℃糖化4h，再升温到78℃，糖化4h。将枯草芽孢杆菌、硫色曲霉菌的菌粉按照1：1的比例混合均匀后取100g加入5000ml37℃含0.01％(m/m)葡萄糖的温水中，活化1小时。将活化后的菌液均匀拌入糖化后的秸秆粗粉中，保持温度37℃，持续发酵10h。发酵完成添加0.01％(m/m)的吐温-80并均匀搅拌后压滤，滤液10000-12000r/min离心10min，得到发酵液上清液，上清液通过截留分子量为20kDa的超滤膜超滤，收集的滤液再经过截留分子量为1000Da的超滤膜超滤，弃去滤过液，所得即是含抗菌肽的发酵液。

实施例5：

含抗菌肽的发酵液的抑菌活性的检测(K-B琼脂扩散法)：取用MH培养基培养的处于对数生长期的金黄色葡萄球菌，用无菌生理盐水稀释至浓度为0.5麦氏标准浓度单位，取1ml菌液均匀涂布与LB平板。菌液扩散15min后将无菌空白药敏纸片贴于平板表面，各纸片中心之间距离大于24mm，纸片距平板内缘大于15mm。实施例2-3的发酵液分别取30ul加在每一纸片上。保持温度37℃，培养12小时，量取抑菌环直径，结果如下。

实施例6：

梓叶100kg，用2000L75％的乙醇按照4：3：2的比例分3次回流提取，提取时间分别2h、2h、1h，过滤后合并提取液，减压浓缩至干，粉碎过筛，即得植物提取物。

将实施例4中所制得的含抗菌肽的发酵液与实施例1所制得的秸秆芯粉(用量为发酵液质量的3倍)混合，即得承载抗菌肽的玉米芯粉。承载抗菌肽的玉米芯粉与本例所制得的植物提取物1：1混合均与，即得无抗饲料添加剂。

实施例7：

谷精草中100kg，用2000L75％的乙醇按照5：5的比例分2次回流提取，提取时间分别2h、1h，过滤后合并提取液，减压浓缩至干，粉碎过筛，即得植物提取物。将实施例3中所制得的含抗菌肽的发酵液与实施例1所制得的秸秆芯粉(用量为发酵液质量的3倍)混合，即得承载抗菌肽的玉米芯粉。承载抗菌肽的玉米芯粉与本例所制得的植物提取物1：1混合均与，即得无抗饲料添加剂。

实施例8：

梓叶和谷精草按照1：1的比例共计100kg，用2000L75％的乙醇按照4：3：2的比例分3次回流提取，提取时间分别2h、1.5h、0.5h，过滤后合并提取液，减压浓缩至干，粉碎过筛，即得植物提取物。将实施例2中所制得的含抗菌肽的发酵液与实施例1所制得的秸秆芯粉(用量为发酵液质量的3倍)混合，即得承载抗菌肽的玉米芯粉。承载抗菌肽的玉米芯粉与本例所制得的植物提取物1：1混合均与，即得无抗饲料添加剂。

实施例9：

选择体重300kg左右，健康无病、发育正常的杂交公牛20头，对照组10头，实验组10头。对照组喂基础日粮：白酒糟5kg、玉米秸适量、玉米面2.4kg、棉粕0.5kg。实验组在基础日粮中增加0.1kg(占全部饲料重量的0.5—1％)本发明所制得无抗饲料添加剂，共饲喂40天。结果如下(单位：kg)：

实施例10：

选择2月龄断奶、体况健康、体重相近的羔羊32只，随机分成两组：对照组和实验组。对照组为基础日粮：玉米62.8％、棉粕35.2％、食盐2％，实验组在基础日粮中加入0.5％的本发明所制得的无抗饲料添加剂。试验期42天。结果如下(单位：kg)：

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。