阅读说明：本技术 一种具有抗淋巴细胞白血病功效的和厚朴酚-苯丁酸氮芥共前体药物及其制备方法和应用 (Honokiol-chlorambucil co-prodrug with lymphocyte leukemia resisting effect and preparation method and application thereof ) 是由 夏黎 汪小根 张雷红 沈小钟 张树潘 李绍林 于 2020-07-20 设计创作，主要内容包括：本发明属于抗癌药物技术领域,公开了一种具有抗淋巴细胞白血病功效的和厚朴酚-苯丁酸氮芥共前体药物及其制备方法和应用。所述共前体药物具有如式(Ⅰ)所示结构。制备方法包括以下步骤：将苯丁酸氮芥溶解于N,N-二甲基甲酰胺中,再加入N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐,然后在室温下将溶液搅拌10min；然后加入和厚朴酚,并在室温下将反应混合物搅拌过夜；将反应液加入乙酸乙酯,然后用水洗涤,用硫酸钠干燥,过滤并浓缩,经色谱法纯化得到和厚朴酚-苯丁酸氮芥共前体药物。<Image he="522" wi="700" file="DDA0002592845410000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention belongs to the technical field of anti-cancer drugs, and discloses a honokiol-chlorambucil co-prodrug with an anti-lymphocyte leukemia effect, and a preparation method and application thereof. The co-prodrug has a structure shown as a formula (I). The preparation method comprises the following steps: dissolving chlorambucil in N, N-dimethylformamide, adding N-ethyl-N' - (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, and stirring the solution at room temperature for 10 min; then adding honokiol and stirring the reaction mixture at room temperature overnight; the reaction solution was added to ethyl acetate, washed with water, dried over sodium sulfate, and filteredFiltering, concentrating, and purifying by chromatography to obtain honokiol-chlorambucil co-prodrug.)

一种具有抗淋巴细胞白血病功效的和厚朴酚-苯丁酸氮芥共 前体药物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于抗癌药物技术领域，特别涉及一种具有抗淋巴细胞白血病功效的和厚朴酚-苯丁酸氮芥共前体药物及其制备方法和应用。

背景技术

苯丁酸氮芥(Chlorambucil，CBL)是一种DNA烷基化试剂，属于氮芥家族，是一种用于治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)、淋巴瘤等多种实体肿瘤的化疗药物。N，N-双(2-氯乙基)-胺基部分可与蛋白质、核酸和磷脂共价反应，诱导细胞存活的抑制功能，而CBL与DNA的烷基化反应是细胞毒性的主要形式。CBL修饰DNA交联的形式包括单功能碱基对错配和双功能双链DNA断裂，导致DNA持续损伤。由于CBL与许多生物大分子(核酸、蛋白质、磷脂)具有很高的反应性，导致临床治疗效果差，半衰期短，治疗反应所需的CBL剂量较高。然而，剂量增加会增加严重副作用的风险。而且，这些不稳定性和非特异性反应性的复合结果将降低CBL的生物作用率。目前，虽然已经成功地开发出一些新的药物用于临床，但事实上CBL仍然是老年CLL和一些免疫抑制癌症患者的一线治疗方法。因此，开发新的抗肿瘤活性高、毒性稳定的CBL衍生物对正常健康组织具有重要意义。

和厚朴酚(HN，C₁₈H₁₈O₂)是从厚朴中分离得到的一种膳食双酚类天然产物。近十年来，大量研究表明，HN通过抗癌、促凋亡、抗炎、抗氧化、抗血管生成等活性，在体内外对恶性肿瘤(如骨髓瘤、白血病)具有广泛的抑制作用，且无明显的亚毒性。此外，HN能有效地抑制多种途径和靶点对癌细胞产生抗增殖作用，如NF-kB、EGFR、STAT3、环氧合酶和其他细胞凋亡因子等，同时，HN还可以治疗是众所周知的耐药肿瘤。HN被认为是一种与普通化疗药物阿霉素(DOX)相当的抗肿瘤药物。非常重要的是，HN可以通过STAT3靶向癌细胞线粒体，阻止肿瘤的进展和转移，这表明HN可能是肿瘤治疗的新的有效的化学预防或治疗实体。但是目前关于HN的临床研究尚不多见。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种具有抗淋巴细胞白血病功效的和厚朴酚-苯丁酸氮芥共前体药物(HN-CBL)。

本发明的又一目的在于提供一种上述具有抗淋巴细胞白血病功效的和厚朴酚-苯丁酸氮芥共前体药物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述具有抗淋巴细胞白血病功效的和厚朴酚-苯丁酸氮芥共前体药物的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种具有抗淋巴细胞白血病功效的和厚朴酚-苯丁酸氮芥共前体药物，所述共前体药物具有如下式(Ⅰ)所示结构：

上述具有抗淋巴细胞白血病功效的和厚朴酚-苯丁酸氮芥共前体药物的制备方法，包括以下操作步骤：将苯丁酸氮芥溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，再加入N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，然后在室温下将溶液搅拌10min；然后加入和厚朴酚，并在室温下将反应混合物搅拌过夜；将反应液加入乙酸乙酯，然后用水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，经色谱法纯化得到和厚朴酚-苯丁酸氮芥共前体药物。

上述具有抗淋巴细胞白血病功效的和厚朴酚-苯丁酸氮芥共前体药物在制备抗淋巴细胞白血病药物中的用途。

本发明的原理：

基于苯丁酸氮芥(CBL)和和厚朴酚(HN)的分子机理背景，本发明人认为从已获批准的治疗药物或安全的膳食天然产物中开发新的抗肿瘤试剂，而不是其它未知化合物，将促进其在癌症治疗中的转化和应用。本发明设计并合成了和厚朴酚-苯丁酸氮芥(HN-CBL)酯共前体药物，通过碳酸盐酯键结合，HN-CBL的释放反应机制是与HN和CBL偶联的双碳酸酯，在较高的细胞内酯酶催化下(例如癌症)可以简单地水解细胞溶解，并且对肿瘤酸性微环境特别敏感(pH＝5.5vs pH＝7.4)。用体外MTT细胞毒性法评价HN-CBL对一系列癌细胞和正常细胞系的抑制作用时，通过直接增强线粒体活性，HN-CBL比其母体药物HN和CBL具有更好的治疗效果。HN-CBL可选择性增强对淋巴细胞白血病(LL)细胞的杀伤作用，治疗浓度下未观察到红细胞溶血反应。此外，HN-CBL可显著促进LLs细胞凋亡，但对正常PBMCs无损伤。计算对接和western-blotting研究表明，HN-CBL也可以在某些疏水残基上与STAT3蛋白结合并下调STAT3蛋白的磷酸化水平。总之HN-CBL可显著延缓白血病细胞的体内生长，且无明显的生理毒性。这些结果表明，与游离药物相比，HN-CBL可能提供一种新的选择性治疗LLs的前药，副作用小。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

HN-CBL能显著抑制人白血病细胞株CCRF-CEM、Jurkat、U937、MV4-11和K562的增殖能力；此外，HN-CBL还能选择性地抑制淋巴细胞白血病细胞的存活，增强白血病细胞的线粒体活性，诱导LLs细胞凋亡；分子对接和western-blot研究表明，HN-CBL还可以在某些疏水残基上与STAT3蛋白结合，下调STAT3蛋白的磷酸化水平；HN-CBL可显著延缓白血病细胞的体内生长，且无明显的生理毒性。因此，HN-CBL可能为淋巴细胞白血病的靶向治疗提供了一种新的、有效的靶向治疗方法。

附图说明

图1是HN-CBL在肿瘤细胞中的体外靶向释放药代动力学图，其中A为HN-CBL在不同pH值的正常等渗缓冲液PBS中水解率，B为HN-CBL在不同生物介质中的水解率。

图2是HN-CBL的抗增殖特性和原发性淋巴细胞白血病细胞的治疗结果。

图3是HN-CBL对mt′超氧化物水平及其膜电位图，其中A为超氧物浓度增加图示，B为mt'膜电位降低图示。

图4是HN-CBL、HN和CBL诱导淋巴细胞白血病细胞凋亡对比图。

图5是HN、CBL和HN-CBL体内抑制肿瘤生长的对比图。

图6是HN、CBL和HN-CBL体内抑制肿瘤生长的病理对照图。

图7是HN-CBL的溶血实验图。

图8是流式细胞仪测定分析HN-CBL对健康献血者的外周血淋巴细胞和淋巴细胞白血病患者的淋巴细胞的作用结果图。

图9是经过不同处理的老鼠的主要器官病理切片图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

以下实施例中使用到的试剂和仪器：苯丁酸氮芥(CBL，HPLC纯度

>95％)、和厚朴酚(HN，HPLC纯度>95％)、N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、乙酸乙酯和硫酸钠购自中国上海能源化工有限公司。色谱纯度乙腈(ACN)来自赛默飞世尔。MTT(98％)来自MedChemExpress(中国上海)。Annexin V-FITC的细胞凋亡检测试剂盒和其他细胞实验试剂来自美国赛默飞世尔(Grand Island)的Life Gibco Technologies公司。p-STAT3(#9134S)、STAT3(9139S)和肌动蛋白的抗体购自Cell Signaling Technology(马萨诸塞州丹佛市)。在Bruker AM-400核磁共振谱仪上记录了氘代氯仿(CDCl₃)中的1H-NMR谱。与四甲基硅烷(TMS)相比，化学位移以δ(ppm)表示，作为内参。在安捷伦1260型UPLC-Waters Q-TOF微质谱仪上记录了高分辨率质谱(HRMS)。采用安捷伦1260超高效液相色谱C18柱和紫外-可见分光光度计，测定了HN-CBL的释放量随分子离子质量电荷比的变化。

以下实施例中使用的细胞培养和缓冲条件：CCRF-CEM、Jurkat、U937、MV4-11、K562和LO2细胞购自ATCC(美国马里兰州贝塞斯达)或CTCC(中国上海，CAS)，培养于DMEM或RPMI1640培养基(Gibco)，并添加10％(v/v)胎牛血清(FBS，Gibco)和100单位抗生素(Gibco)在5％CO₂环境和37℃环境中的培养箱中。用Ficoll缓冲液纯化LL白血病患者(按FAB分类系统分为亚型)和健康人外周血单个核细胞(PBMCs)。在Ficoll分离健康献血者外周血的过程中，也获得了红细胞。将单个核细胞悬浮在含有20％FBS的RPMI 1640培养基中，浓度约为5-10×10⁵/mL。用不含Ca²⁺、Mg²⁺的Dulbecco磷酸盐缓冲液(DPBS，Invitrogen)洗涤细胞。

以下实施例中使用的临床生物标本收集及溶血测定方法：根据研究伦理委员会批准的方案，健康献血者的外周血淋巴细胞被纯化并命名为PBMCs，淋巴细胞白血病患者的淋巴细胞被命名为LLs。用Ficoll离心法分离外周血单个核细胞。从健康献血者血液中分离出红细胞，用冷却的PBS纯化。在等渗缓冲液中制备CBL、HN和HN-CBL溶液，加入红细胞缓冲液中，在96孔板上进行溶血分析。简单地说，每孔加入2μL红细胞，混合，然后在37℃和5％二氧化碳中孵育1小时。对于100％裂解，向孔中添加50％H₂O，对于阴性对照(0％)，仅使用来自这些孔的细胞(包括PBS缓冲液)。当以1000×g离心10min后，将上清液转移到新试管中，加入PBS并混合，在450nm处读取以测定吸光度。以上细胞是新鲜的。

以下实施例中使用MTT法测定细胞毒性：A549、HepG2、NIH3T3和LO2细胞以4-6×10³细胞/孔的密度接种在96孔板中。白血病细胞系(CCRF-CEM、Jurkat、U937、MV4-11和K562)以10-20×10³细胞/孔的密度接种在96孔平板上。使用GraphPad Prism 5.01(GraphPad软件)进行IC50值和统计分析。

以下实施例中使用的线粒体中超氧化物的测定方法：按照超氧试剂盒说明书(Invitrogen)，我们将4×10⁴个白血病细胞置于12孔板中，用于验证CBL、HN或HN-CBL对白血病细胞线粒体中超氧化物的影响。当细胞和药物的混合物孵育1.5小时后，我们首先去除培养基，然后完成胰蛋白酶消化和离心过程，所得细胞用MitoSOX染色，并用BD-FACSVerseTM流式细胞仪(BD Biosciences，密歇根州安娜堡)。

以下实施例中细胞凋亡分析具体为：在BD-FACSVerseTM流式细胞仪(BD-Biosciences，CA)的帮助下，分别在加或不加HN、CBL和HN-CBL处理24小时后检测PBMCs和LLs细胞的凋亡。以PBS为靶细胞，参照Beyotime(中国)Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒说明书，比较未处理与HN、CBL或HN-CBL治疗的差异。

以下实施例中HN-CBL共前药与HN的分子对接研究采用的方法：分子配体对接研究是用Sybyl-x2.1.1软件进行的，该软件使用默认参数将能量最小化。从蛋白质数据库中获得了STAT3(PDB代码：3CWG)的X射线晶体结构。对接是在对接盒尺寸足够大以包括绑定位置的情况下执行的。

以下实施例中采用的免疫印迹法具体按照以下步骤：淋巴细胞白血病细胞用10μMHN或HN-CBL 12小时，收集的细胞在200μL的WB和IP溶解缓冲液(1％Triton X-100)，包括1mM PMSF(Beyotime，中国)。将蛋白质提取物(50μg)装载到含有SDS的8-15％聚丙烯酰胺凝胶上，电泳并转移到0.22μm硝化纤维素膜(PALL，美国)。在含有0.1％吐温20(TBST)的Tris缓冲盐水中用5％脱脂奶粉封闭膜，并在4℃下与一级抗体一起孵育过夜。用TBST洗涤三次，室温下用HRP结合二级抗体检测2h。免疫复合物用Photope-HRP Western-Blot检测系统(皮尔斯，美国)可视化。肌动蛋白用于确保整个细胞蛋白质的等效负荷。所有数据都经过三个单独的实验证实。

以下实施例中采用的体内异种移植模型具体按照以下步骤：雌性BALB/c裸体(4-6周龄)取自湖南省实验动物中心(长沙)。所有动物研究均按照湖南省中医院动物护理与使用委员会(IACUC)批准的方案进行。在小鼠适应新环境5天后，将CCRF-CEM细胞(1.2×10⁷/0.2ml/只)皮下注射到小鼠侧腹(第0天)。当肿瘤体积达到100mm³左右时，将小鼠随机分为4组，每两天静脉注射HN(3.5mg/kg)、CBL(8mg/kg)和HN-CBL共前药(11mg/kg，相当于HN剂量3.5mg/kg或8mg/kg CBL)。每三天记录一次肿瘤体积(V)和小鼠体重，采用公式V＝(a×b²)/2计算，其中“a”和“b”分别代表肿瘤直径的长度和宽度。实验结束后，第24天处死小鼠，取肿瘤和主要器官，固定于甲醛中，进行石蜡包埋。

以下实施例中肿瘤组织TUNEL凋亡检测、Ki67增殖分析及主要器官H&E染色具体采用以下方法：用TUNEL检测试剂盒(Roche)检测肿瘤组织凋亡。简单地说，石蜡包埋标本的肿瘤组织在二甲苯中脱蜡，并用降低浓度的乙醇进行再水化。用标记的链霉亲和素-生物素免疫组化法检测肿瘤组织中细胞增殖情况。苏木精-伊红染色观察主要脏器的形态。

以下实施例中所述统计分析具体按照：对于数据分析，独立实验的值以平均值±SEM表示。统计学差异采用non-paired Student’s two-tailed t test，p<0.05被认为具有统计学意义。

实施例1

将溶解于5ml DMF中的约180mg CBL(0.59mmol)加入EDCI(～135mg，0.70mmol)，然后在室温下将溶液搅拌10min；然后加入HN(75mg，0.28mmol)，并在室温下将反应混合物搅拌过夜；将反应液加入50ml乙酸乙酯，然后用50ml水洗涤一次，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩；用色谱法纯化黄色固体，即为和厚朴酚-苯丁酸氮芥共前体药物(HN-CBL)，收率10％。1H-NMR(400MHz，CDL3)：δ1.85-1.86(m，1H)，2.09-2.12(m，2H)，2.18-2.19(m，1H)，2.40-2.42(m，2H)，2.49-250(m，1H)，2.64-2.66(m，2H)，2.71-2.73(m，2H)，2.73-2.85(m，1H)，3.37-3.45(m，4H)，3.68-3.70(m，8H)，3.73-3.76(m，8H)，5.09-5.71(m，2H)，6.65-6.71(m，4h)，6.96-7.00(m，1H)，7.02-7.08(m，2H)，7.12-7.22(m，7H)，7.30-7.31(m，2H)，7.37-7.39(m，2H)。MS(ESI)：839.7(C₄₆H₅₂Cl₄N₂O₄)[M+H]⁺，M/z计算值为838.6。结构表征数据证明所得HN-CBL具有如下式(Ⅰ)所示结构：

实施例2：HN-CBL在肿瘤细胞中的体外靶向释放药代动力学

根据前药HN-CBL与碳酸盐酯在细胞内酯酶催化下裂解的特点，然后在PBS和血浆等生物介质中释放CBL和HN，特别是在酯酶含量较高、pH值较低的肿瘤组织或癌细胞中释放。为了验证上述关于前药HN-CBL的直观假设，采用HPLC-MS方法对HN或CBL在不同介质中的释放进行了评价。在不同的生物介质(如PBS)中，测定了前药HN-CBL在37℃下的水解释放(pH＝7.4或5.5，10％新鲜血浆和10％癌细胞裂解)。采用高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)技术测定了HN-CBL的降解和HN或CBL的产生。从图1的结果可以看出，HN-CBL在pH＝7.4的正常等渗缓冲液PBS中水解率<10％，但在pH＝5.5的PBS中释放出25％以上的游离药物，证明了共前药HN-CBL具有肿瘤酸微环境敏感性反应特征。同时，当HN-CBL与含PBS的10％新鲜小鼠血浆(pH＝7.4)共孵育时，HN-CBL有约40％的HN或CBL释放，但在37℃pH＝7.4的10％CCRF-CEM癌细胞裂解液中释放70％以上的产物，这种水解差异可能是由于癌细胞中酯酶的高表达所致。另外，用10％的正常小鼠肝组织来验证上述假设，我们发现HN-CBL比CCRF-CEM细胞裂解物具有更高的生物稳定性(约50％vs70％)。因此，这些结果表明，HN-CBL共前体药物可以很好地释放自由药物HN和CBL，发挥协同作用，从而提高CBL对癌细胞的特异性，从而降低副作用的风险。

实施例3：HN-CBL选择性抑制白血病细胞增殖

本实施例采用MTT比色法研究了前药HN-CBL对7种肿瘤细胞株的抗癌作用。我们的数据显示HN-CBL能有效降低7种供试癌细胞系的存活率，分别为淋巴细胞癌CCRF-CEM(IC50＝1.09μM)、Jurkat(IC50＝1.15μM)，U937(IC50＝1.29μM)、MV4-11(IC50＝2.78μM)、K562(IC50＝4.86μM)、肺癌A549(IC50＝25.10μM)、人肝癌HepG2(IC50＝24.50μM)，对两个正常细胞LO2和NIH3T3均无明显细胞毒性。这些结果表明HN-CBL具有较宽的抗肿瘤谱，特别是对白血病细胞有选择性。在所测的7种人癌细胞系中，HN-CBL的IC50值均低于CBL和HN，说明HN-CBL的协同抗肿瘤活性强于HN和CBL(表1)。

表1 HN、CBL和HN-CBL对肿瘤细胞株的IC50

实施例4：HN-CBL选择性抑制人原发性淋巴细胞白血病细胞存活

共前体药物HN-CBL能有效降低癌细胞CCRF-CEM、U937、MV4-11、Jurkat和K562的细胞存活率(IC50＝1.09-4.86μM)。由于共前药HN-CBL更有效地降低白血病细胞的存活率，我们继续研究前药HN-CBL的抗增殖特性和原发性淋巴细胞白血病细胞(LLs)的治疗窗(图2)。为了比较HN-CBL对健康细胞的毒性，采用MTT比色法对3种供者细胞进行毒性测定(包括健康红细胞、健康PBMCs和LLs患者分离的B细胞)。与游离药物HN或CBL相比，HN-CBL在试验浓度下没有产生红细胞溶血反应(图7)，说明HN-CBL能够以较低的副作用消融白血病细胞。与健康供者相比，HN-CBL比CBL更具有靶向性杀伤LL患者白血病细胞，这与HN-CBL释放药代动力学结果一致，表明HN-CBL由于癌细胞中酯酶活性较高，pH值较低，具有癌细胞特异性。

实施例5：HN-CBL增强白血病细胞线粒体活性

抗癌药物CBL具有很高的烷基化功能，其抗白血病活性主要集中在癌细胞的细胞核基因组上。在本实施例中，天然产物HN被用于共传递CBL，它可以通过STAT3靶向癌细胞线粒体(mt)，从而阻止癌症的进展和转移。mt-DNA损伤会增加ROS水平，改变mt膜电位。因此，为了证实HN-CBL诱导细胞死亡与线粒体的关系，用流式细胞仪检测了两种mt'生物标志物、ROS水平和mt'膜电位。当用HN-CBL治疗白血病细胞时，我们观察到超氧物浓度增加，mt'膜电位降低(图3的A和B)。然而，核基因组交联剂CBL对mt′超氧化物水平及其膜电位无明显影响。这些数据支持HN-CBL选择性破坏线粒体细胞器的概念。

实施例6：HN-CBL诱导淋巴细胞白血病细胞凋亡，但对正常PBMCs无损伤

细胞凋亡是一种程序化的诱导细胞死亡的方式，已经证实线粒体通过不同的机制参与细胞凋亡。此外，我们的研究结果表明，HN-CBL可通过线粒体的活性诱导癌细胞死亡。因此，采用annexinv-FITC/PI染色的细胞凋亡实验来研究HN-CBL对白血病细胞的抑制作用。将PBMCs和LL细胞与HN、CBL和HN-CBL共孵育24h，细胞凋亡率与未处理细胞相比差异无统计学意义(分别为7.5％和4.8％)，CBL可显著诱导CLLs细胞凋亡约25％，HN-CBL治疗组与CBL组相比，LLs细胞死亡反应显著(分别为40％和25％)。但是，没有观察到PBMC上的损伤(图8)。这些结果表明，细胞凋亡信号可能是前药HN-CBL比CBL和HN对白血病细胞具有更高生物活性的主要机制(图4)。结果表明，HN与CBL结合可提高CBL和HN的抗癌活性，有望成为一种新的化疗药物。

实施例7：HN和HN-CBL与STAT3相互作用的分子对接

在以前的报道中，HN被证明通过STAT3靶向癌细胞线粒体(mt)来阻止癌症的进展和转移。为了探讨HN-CBL的靶向给药机制，我们进一步测定了电脑模拟HN或HN-CBL与STAT3在的相互作用。采用Sybyl-x2.1.1软件对HN或HN-CBL与STAT3(PDB编码：3CWG)的晶体结构进行了分子对接实验，遵循能量越低对接方向越好的原则。HN通过烷基和pi烷基与来自每个结构域的疏水残基簇的相互作用与STAT3结合：ILE-467、HIS-332、PRO-471、MET-470，这与所报告的STAT3抑制剂CuB一致。在STAT3中，HN的氢或氧原子可以与LYS-573、ASP570、ARG-335和ASP-566的氨基酸上的氧或氢原子形成氢键。氢键的形成增强了HN靶向结合STAT3蛋白。非常有趣的是，前药HN-CBL也通过HN与STAT3结合烷基和pi烷基与来自每个结构域的疏水残基簇的相互作用：ILE-467、HIS-332、PRO-471、MET-470、PRO-330、MET-331，这表明HN-CBL最大限度地保持与STAT3的结合活性。HN-CBL的氢或氧原子可与LYS-573和HIS-332氨基酸上的氧或氢原子形成氢键，HN-CBL的氢原子可与ASN-567氨基酸上的碳原子形成氢键。分子对接分析表明，HN-CBL能以HN的形式结合STAT3蛋白。western印迹显示，HN-CBL能显著抑制STAT3(p-STAT3)的磷酸化表达。这些结果证明，HN-CBL与HN一样，部分通过STAT3相互作用产生对白血病的靶向杀伤作用。

实施例8：HN-CBL体内抗淋巴细胞白血病作用

为进一步证明HN-CBL体内抗慢性淋巴细胞白血病的疗效，本实施例采用BALB/c小鼠CEM异种移植模型。等摩尔量HN(3.5mg/kg)、CBL(8mg/kg)、HN-CBL(11mg/kg)和溶剂对照，每两天注射一次。每隔4天追踪皮下肿瘤体积(V)和裸鼠体重(M)。从图5可以看出，HN、CBL和HN-CBL均比对照组能有效地抑制肿瘤生长，第13天HN-CBL组比HN或CBL组能显著抑制肿瘤体积(图5中的B)。图5中的A和C对获得的肿瘤组织进行拍照和称重，照片大小和固有肿瘤重量表明，HN-CBL可通过减少癌细胞生长，极大地抑制白血病细胞的增殖。图5中的D显示，CBL引起体重下降，反映了小鼠严重的生理毒性。非常有趣的是，HN-CBL治疗组在治疗时间内可以保持小鼠体重稳定，与溶剂对照组和HN组相似。这些有趣的结果表明，HN-CBL可以降低CBL对小鼠的生理毒性。可能是因为CBL与许多生物大分子反应性高，临床上治疗效果差，半衰期短，意味着高剂量CBL会增加严重副作用的风险。第24天取不同处理组的主要器官进行H&E染色(图6)病理分析。与对照组相比，HN-CBL组的主要器官未出现组织损伤，而CBL治疗导致肝损伤(图9)。用免疫组化Ki-67染色和TUNEL荧光进一步检测肿瘤组织的增殖和凋亡。如图6所示，与溶剂组相比，两种药物治疗组的增殖细胞率均较低。HN-CBL治疗组Ki-67阳性细胞减少多于HN或CBL的减少。而在TUNEL荧光中，HN-CBL处理组观察到更多凋亡细胞(图6)。考虑到抗白血病的疗效(图5)和主要器官的相关生理损伤(图9)，HN-CBL共前体药物可能是一种新型的白血病化疗药物，具有良好的抗肿瘤效果和较低的副作用。

由于酯类前药的设计可以通过提高生物膜透性和降低非特异性毒性来提高药物的生物利用度和效率。本发明将广谱DNA烷基化疗法苯丁酸氮芥与安全的天然膳食产品和厚朴酚相结合，设计并合成了一种新的和厚朴酚-苯丁酸氮芥偶联前体药物。生物学评价结果表明，共前体药物HN-CBL能显著抑制多种肿瘤细胞系的增殖，尤其是淋巴细胞白血病细胞系。与健康人外周血单个核细胞毒性相比，HN-CBL可选择性杀伤LL患者的淋巴细胞白血病细胞。此外，HN-CBL能增强白血病细胞线粒体活性，诱导白血病细胞凋亡。分子对接和western-blot研究表明，HN-CBL还可以在某些疏水残基上与STAT3蛋白结合，下调STAT3蛋白的磷酸化水平。在体异种移植中，HN-CLB能显著降低淋巴细胞白血病肿瘤的生长。值得注意的是，HN-CBL组未见明显的生理毒性，但CBL治疗组肝组织损伤明显。这些结果表明，前药HN-CBL可能是一种有前途的抗淋巴细胞白血病药物，副作用比CBL小，而线粒体功能障碍和细胞凋亡可能是其主要的抗增殖机制。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。