Ros敏感聚乙二醇-聚酯共聚物纳米给药系统及其应用
阅读说明：本技术 Ros敏感聚乙二醇-聚酯共聚物纳米给药系统及其应用 (ROS (reactive oxygen species) -sensitive polyethylene glycol-polyester copolymer nano drug delivery system and application thereof ) 是由 蔺晓娜 田红旗 于 2020-04-13 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种ROS敏感聚乙二醇-聚酯纳米给药系统,其特征在于,包括由ROS敏感,所述纳米给药系统中含有聚乙二醇亲水段A和聚酯疏水段B,并由ROS敏感键链接亲疏水段构成A-B,B-A-B共聚物。本发明提供的ROS敏感材料至少具有如下优势之一：本发明提供的高分子材料可用于制备纳米载药材料,通过聚合物自组装进行药物包裹,能够稳定药物分子,在ROS响应敏感释放,并实现口服给药等。(The invention provides an ROS-sensitive polyethylene glycol-polyester nano drug delivery system which is characterized by comprising ROS sensitivity, wherein the nano drug delivery system contains a polyethylene glycol hydrophilic segment A and a polyester hydrophobic segment B, and an ROS sensitive bond is linked with the hydrophilic and hydrophobic segments to form an A-B, B-A-B copolymer. The ROS sensitive material provided by the invention has at least one of the following advantages: the high molecular material provided by the invention can be used for preparing a nano drug-loaded material, drug encapsulation is carried out through polymer self-assembly, drug molecules can be stabilized, ROS response sensitive release is realized, and oral administration is realized.)
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及电离辐射损伤防护方面，具体涉及两亲性聚合物材料、纳米载药系统及其应用。
背景技术
辐射损伤是由电离辐射(ionizing radiation，IR)引起的机体组织损伤，通常出现在核泄漏事故、放射源丢失事故及肿瘤病人放疗过程中。大剂量射线瞬间照射或低剂量射线长时间照射都可引起组织损伤。电离辐射能够在组织与细胞中产生活性氧(reactiveoxygen species，ROS)自由基，干扰DNA、蛋白质等大分子，诱导细胞损伤和细胞功能的异常，最终导致机体多种器官发生功能性紊乱、发生病变甚至引起机体变异或死亡。
到目前为止，大多数旨在减轻辐射损伤的医疗举措仍然处在实验阶段。辐射防护剂的种类主要包括氨巯基类、酚类、多糖类、激素类、细胞因子类、维生素类、天然产物等。氨磷汀是FDA通过的唯一一个具有辐射防护效果的化学药物，但是其有效时间短，不能口服只能注射使用。口服时，效果差(N.P.Praetorius,T.K.Mandal,J.Pharm.Pharmacol.60(2008)809-815)。口服给药能提高患者的依顺性。因此，寻找一种能够口服，且效果理想且对人体无明显副作用的辐射防护剂一直是放射生物学及医学相关领域所关注的重要问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种ROS敏感聚合物材料，该聚合物材料通过自组装形成纳米粒，制备过程简单，且能够有效地稳定药物并且会在遭遇辐射损伤时定时释放。
本发明通过以下技术方案加以实现的，ROS敏感聚乙二醇-聚酯共聚物纳米给药系统，其特征在于该聚合物是由数均分子量为600至10000的亲水性聚乙二醇段A，与数均分子量为250至20000的疏水段聚酯通过ROS敏感键(酮缩硫醇(TK)，二硫键(S-S)，偶氮苯，苯硼酸等)与嵌段A和嵌段B的端基连接，构成A-B或B-A-B共聚物。其中亲疏水比例为(0.5～5)：1。
上述聚乙二醇选自于双羟基聚乙二醇、单羟基聚乙二醇、聚氧乙烯与聚丙烯嵌段共聚物及含有聚乙二醇嵌段的聚合物二元醇和单元醇其中的一种。
上述聚酯是聚己内酯，聚乳酸或聚丙交酯、聚羟基乙酸或乙交酯、聚羟基丁酸或上述聚合物单元混合物的共聚物。
本发明提供居于上述ROS敏感材料的纳米载药系统，制备方法包括：将上述聚合物材料与小分子辐射防护药物通过双乳化(W/O/W)和溶液挥发法制备纳米粒载药系统。
在本发明的一个
具体实施方式
中，所述小分子辐射防护剂选自由氨磷汀、WR-1065或其他胺巯基化合物组成。
在本发明的一个具体实施方式中，所述药物组合物的制备方法包括将小分子辐射防护剂、纳米载药材料加入到有机溶剂中进行包裹。
在本发明的一个具体实施方式中，所述有机溶剂为有机反应中常用的合适溶剂，例如，包括但不限于脂肪族和芳香族的、任选烃或者卤化的烃(例如戊烷、己烷、庚烷、环己烷、石油醚、汽油、挥发油、苯、甲苯、二甲苯、二氯甲烷、二氯乙烷、氯仿、四氯化碳、氯苯和邻二氯苯)、脂肪族和芳香族的、任选的醇类(例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、叔丁醇、乙二醇等)、醚(例如乙醚和二丁醚，乙二醇二甲醚和二甘醇二甲醚、四氢呋喃和二噁烷等)、酯(例如乙酸甲酯或乙酸乙酯等)、腈(例如乙腈或丙腈等)、酮(例如丙酮、丁酮等)、酰胺(例如二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺和N-甲基吡咯烷酮等)、以及二甲基亚砜、四亚甲基砜和六甲基磷酰三胺和N,N-二甲基丙撑脲(DMPU)等。
在本发明的一个具体实施方式中，所述纳米粒载药系统的制备方法具体包括将ROS敏感材料加入到二氯甲烷中，将小分子辐射防护剂加入到水中，超声乳化，旋干溶液，干燥。
在本发明的一个具体实施方式中，所述纳米载药系统还包括一种或多种药剂学上可接受的媒介载体，辅剂，助剂或稀释剂。
在本发明的一个具体实施方式中，所述纳米粒载药系统的剂型包括但不限于注射剂，乳剂，微乳剂，亚微乳剂，纳米颗粒，片剂，胶囊，丸剂，吸入剂，含片，凝胶剂，粉剂，栓剂，悬乳液，乳膏剂，胶冻剂或喷雾剂。
在本发明的一个具体实施方式中，所述纳米载药系统可采取的给药方式包括但不限于：皮下注射，肌肉注射，静脉注射，口服，直肠给药，阴道给药，鼻腔给药，透皮给药，结膜下给药，眼球内给药，眼眶给药，眼球后给药，视网膜给药，脉络膜给药或鞘内注射。
本发明另一方面提供上述所述的ROS敏感聚合物材料，或上述所述的纳米载药系统制备用于治疗和/或预防辐射损伤和/或化疗损伤的药物中的用途。
在本发明的一个具体实施方式中，所述辐射损伤包括电离辐射、非电离辐射或多种类型辐射共同造成的损伤；其中电离辐射包括但不限于α射线，β射线，γ射线，X射线，质子或中子辐射。
在本发明的一个具体实施方式中，所述辐射损伤包括但不限于由于辐射引起的哺乳动物外周血白细胞和/或血小板和/或红细胞减少。
在本发明的一个具体实施方式中，所述药物单独用药或者与已知辐射防护剂联合用药。
本发明提供的ROS敏感聚合物材料至少具有如下优势之一：本发明提供的聚合物材料可用于制备纳米载药系统，通过自组装包裹药物，能够稳定药物分子且会在遭遇辐射损伤时定时释放，而且可实现口服给药等。
附图说明
图1所示为本发明实施例提供的ROS敏感聚合物核磁谱图。证明聚合物制备成功。
图2所示为本发明实施例提供的纳米载药系统纳米粒粒径分布图(A)和TEM图(B)。
图3所示为本发明实施例在H2O2作用下，聚合物核磁图，证明聚合物ROS敏感降解。
图4所示为本发明实施例提供的负载WR-1065纳米载药系统和游离WR-1065在模拟胃液(pH1.2)稳定性结果，可见，纳米系统能够保护药物不被胃液破坏。
图5所示为本发明实施例提供的采用全身照射137Cs方法后，30天内小鼠存活率的实验结果图。
图6所示为本发明实施例提供的负载WR-1065纳米粒对主要脏器辐射防护的结果图。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
具体而言，本文所使用的，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括在内的或开放性的，并且不排除另外的未陈述的元件或方法步骤。术语“包含”在本文中的任何表述，特别是在描述本发明的方法、用途或产品时，应理解为包括基本上由所述组分或元件或步骤组成和由所述组分或元件或步骤组成的那些产品、方法和用途。本文示例性描述的本发明适当地可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制的情况下进行实践。
本文已采用的术语和表述用作描述性而不是限制性术语，并且在此种术语和表述的使用中不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等价物，但应认识到各种修饰在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修饰和变化，并且此类修饰和变化被视为在如由附加权利要求定义的本发明的范围内。
本文所述“辐射损伤”是指电磁波谱中各种射线造成的损害，如微波、红外线、可见光、紫外线、X射线、β射线、γ射线、中子或质子束照射等引起的损伤。
为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制。
实施例1 ROS敏感聚合物制备
将酮缩硫醇TK(1.0g)加入到反应瓶中，并加入3mL乙酸酐溶解，在氮气保护下，室温反应2小时。然后在体系中加入20mL甲苯，减压干燥3次。在反应瓶中加入10mL二氯甲烷，并加入相对分子量2000的聚乙二醇(3.0g)，反应过夜。产品溶液用水洗3次，浓缩油相，并对产品进行干燥。得到TK-PEG-TK。在一个干燥的反应瓶中，加入TK-PEG-TK(1.4g)，EDCI(0.55g)和HoBt(0.38g)溶于20mL二氯甲烷中，反应半小时。然后加入1.4g聚己内酯(PCL2000)。在室温下反应24小时。浓缩反应液，并在蒸馏水中透析24小时，将产品冷冻干燥24小时，获得目标产物PCL-TK-PEG-TK-PCL。(简称I-1)。TK，TK-PEG-TK和I-1的核磁图谱如图1所示。
按照实施例1方法，改变聚乙二醇、聚酯的种类和组成，可以得到多种B-A-B型和A-B型TK键链接的ROS敏感聚合物，具体参数如表1所示。
表1 B-A-B型和A-B型(TK键)的ROS敏感聚乙二醇-聚酯共聚物
共聚物
A/M<sub>PEG</sub>
聚酯B/M<sub>PE</sub>
W<sub>AB</sub>
I-1
PEG/2000
PCL/2000
2.00
I-2
mPEG/2000
PCL/2000
1.00
I-3
PEG/600
PCL/250
0.83
I-4
mPEG/1500
PCL/2000
1.33
I-5
PEG/4000
PCL/1000
0.50
I-6
PEG/1500
PCLA/3000
2.00
I-7
PEG/1000
PCLA/2500
5.00
I-8
PEG/5000
PCLA/10000
4.00
I-9
mPEG/2000
PLA/3000
1.50
I-10
mPEG/1000
PLA/2000
2.00
I-11
PEG/2000
PLAG/2000
2.00
I-12
mPEG/4000
PLAG/5000
1.25
I-13
PEG/1000
PLAG/400
0.80
MPEG：PEG/mPEG的数均相对分子量；MPE：聚酯的数均相对分子量；WAB：疏水段/亲水段的质量比。PCLA：己内酯和丙交酯的共聚物；PLGA：丙交酯与乙交酯的共聚物。
实施例2(II-1)二硫键连接的ROS敏感化合物制备
在一个干燥的反应瓶中，加入胱氨酸(1.0g)，EDCI(0.55g)和HoBt(0.38g)溶于20mL二氯甲烷中，反应半小时。将相对分子量2000的聚乙二醇(1.0g)加入到反应瓶中，并加入3mL乙酸酐溶解，在氮气保护下，室温反应2小时。然后在体系中加入20mL甲苯，减压干燥3次。在反应瓶中加入10mL二氯甲烷，并加入相对分子量2000的端甲基聚乙二醇(3.0g)，反应过夜。产品溶液用水洗3次，浓缩油相，并对产品进行干燥。得到mPEG-TK。在一个干燥的反应瓶中，加入mPEG-TK(1.4g)，
EDCI(0.55g)和HoBt(0.38g)溶于20mL二氯甲烷中，反应半小时。然后加入1.4g聚己内酯(PCL2000)。在室温下反应24小时。浓缩反应液，并在蒸馏水中透析24小时，将产品冷冻干燥24小时，获得目标产物mPEG-TK-PCL。(简称II-1)。
按照实施例2方法，改变聚乙二醇、聚酯的种类和组成，可以得到多种B-A-B型和A-B型二硫键链接的ROS敏感聚合物，具体参数如表2所示。
表2 B-A-B型和A-B型(二硫键键)的ROS敏感聚乙二醇-聚酯共聚物
共聚物
A/M<sub>PEG</sub>
聚酯B/M<sub>PE</sub>
W<sub>AB</sub>
II-1
2000
PCL/2000
1.00
II-2
2000
PCL/1000
0.50
II-3
600
PCL/2500
4.16
II-4
1500
PCL/1000
0.67
II-5
4000
PCL/4000
1.00
II-6
1500
PCLA/1500
1.00
II-7
1000
PCLA/2500
2.50
II-8
5000
PCLA/20000
4.00
II-9
2000
PLA/3000
1.50
II-10
1000
PLA/1000
1.00
II-11
2000
PLAG/2000
1.00
II-12
4000
PLAG/5000
1.25
II-13
250
PLAG/400
1.60
MmPEG：PEG的数均相对分子量；MPE：聚酯的数均相对分子量；WAB：疏水段/亲水段的质量比。PCLA：己内酯和丙交酯的共聚物；PLGA：丙交酯与乙交酯的共聚物。
实施例3载药纳米粒的制备
上述实施例1～2所制备的聚合物可以与多种生物活性分子结合形成负载药物纳米粒，用于辐射防护。以下仅以氨磷汀(Am)和其代谢产物WR-1065予以示例性的说明。
ROS敏感聚合物自组装采用双乳化(W/O/W)法制备。
载药纳米粒1：I-1/WR-1065纳米粒的制备
50mgWR-1065溶解于200mL蒸馏水中，形成内水相(W1)，100mg I-1聚合物溶解于2mL二氯甲烷中形成油相(O)，将W1加入到O中，冰水浴下超声3分钟，形成初乳液(W1/O)。将初乳加入到10mL蒸馏水(W2)中，冰水浴下超声3分钟，形成W1/O/W2双乳液。旋蒸去除二氯甲烷，得到载药纳米粒溶液冷冻干燥24小时。制备的纳米粒粒径分布与形貌分别采用动态光散射和TEM检测，结果如图2所示。载药量如表3所示。
表3载药纳米粒及载药量
按照实施例3方法，通过改变聚合物和药物种类及比例，可以制备多种载药纳米粒。
实施例4 ROS敏感聚合物的降解研究
取空白ROS敏感聚合物冻干粉，分别置于不同浓度的双氧水中，利用核磁考察聚合物降解行为。测试结果如图3所示。说明合成的聚合物具有ROS敏感降解行为。
实施例5载药纳米粒对药物的保护作用研究
以WR-1065为对照，比较负载WR-1065纳米粒在模拟胃液环境中的稳定型。具体过程如下：分别称取10mg WR-1065和含有10mg WR-1065药物的纳米粒溶解于10mL模拟胃液中(pH1.2)，37℃下放置。不同时间间隔分别取出溶液，并使用HPLC检测药物含量变化，结果如图4所示。说明单独WR-1065会在胃液环境中降解，聚合物载体可以保护药物不被胃液降解。
实施例6载药纳米粒的体内辐射保护作用
建立体内小鼠辐射模型，研究I-1/WR-1065的体内辐射保护作用。
采用全身照射137Cs方法，建立小鼠辐射模型，观察ROS敏感辐射防护药物对小鼠存活率及体重的影响。C57BL/6小鼠根据体重随机区组法分组，不照射组有2组：分别为空白组(生理盐水灌胃)和I-1/WR-1065口服灌胃组。照射组分为4组，分别为照射组(8.0Gy)(记为a)：接受8.0Gy全身照射，照前1h生理盐水灌胃；I-1/WR-1065灌胃给药；照射+氨磷汀组(氨磷汀照射腹腔注射组，记为b)：接受8.0Gy全身照射，小鼠照射前1h氨磷汀腹腔注射给药；照射+WR-1065组(WR-1065照射口服组，记为c)：接受8.0Gy全身照射，小鼠照射前1h WR-1065灌胃给药；照射+I-1/WR-1065组(WR-1065纳米粒照射口服组，记为d)：接受8.0Gy全身照射，小鼠照射前1h I-1/WR-1065灌胃给药。照射时小鼠接受一次137Cs源全身照射(TBI)，照射剂量为8.0Gy，剂量率为0.99Gy/min。每日记录小鼠死亡情况和体重，统计小鼠30天存活率，其结果如图5所示。从图5中可以看出，未照射组，I-1/WR-065纳米粒给药组小鼠存活率100％，说明载药纳米粒具有很好的生物相容性，照射组中，I-1/WR-1065比起其它给药组，具有更高的30天存活率，说明具有很好的辐射保护效果。
实施例7载药纳米粒对主要脏器的保护作用
建立体内小鼠辐射模型，研究I-1/WR-1065对主要脏器的保护作用。
采用全身照射137Cs方法，建立小鼠辐射模型，C57BL/6小鼠根据体重随机区组法分组，空白组(记为a)：生理盐水灌胃不照射；照射组(7.2Gy)(记为b)：接受7.2Gy全身照射，照前1h生理盐水灌胃；照射+WR1065组(WR-1065照射口服组，记为c)：接受7.2Gy全身照射，小鼠照射前1h WR1065灌胃给药；照射+I-1/WR-1065组(WR-1065纳米粒照射口服，记为d)：接受7.2Gy全身照射，小鼠照射前1h I-1/WR-1065灌胃给药。照射时小鼠接受一次137Cs源全身照射(TBI)，照射剂量为7.2Gy，剂量率为0.99Gy/min。照射7d后，摘取小鼠主要脏器，对组织切片进行病理分析，其结果如图6所示。从图6中可以看出，能够显著地改善辐射导致的肺纤维化和肠道损伤。
本发明中提供的ROS敏感聚合物纳米载体，通过自组装，稳定小分子辐射防护剂，实现口服给药。由其所制备的ROS敏感纳米系统可作为辐射防护剂，具有延长致死剂量照射后动物的生存期和降低死亡率的作用，而且能够改善由辐射导致的肺纤维化和肠道损伤。药物化合物可以单独作为辐射损伤防护和救治药物，也可以与放疗联合应用，对放疗引起的不良反应具有缓解和防治作用，也可以与已知辐射防护剂，例如与辐射治疗剂联合用药，达到防治兼备的效果，从而增强预防和/或治疗辐射造成的损伤。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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