一种含蓝萼甲素的骨靶向纳米试剂的制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种含蓝萼甲素的骨靶向纳米试剂的制备方法及其应用 (Preparation method and application of bone targeting nano-reagent containing glaucocalyxin A ) 是由 张琪 朱健伟 马博 赵昂 于 2021-07-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种含蓝萼甲素的骨靶向纳米试剂的制备方法及其应用,属于生物材料领域。含蓝萼甲素的骨靶向纳米试剂,是将蓝萼甲素包裹在CHO-PEG-(2k)-(ALN)-(2)共聚物中所得。CHO-PEG-(2k)-(ALN)-(2)共聚物制备方法：N-叔丁氧羰基乙二胺和丙烯酸甲酯,在35-45℃下反应42-54h,得到超支化分子；超支化分子在pH8.0-9.0条件下反应,得超支化乙二胺交联分子；阿伦磷酸钠和超支化乙二胺交联分子反应,得化合物4；化合物4溶于氯化氢甲醇饱和溶液中,反应得到共聚物。本发明纳米试剂具有骨肿瘤靶向性和较好的肿瘤治疗效果,制备方法简单,得到的纳米粒子尺寸均一性较好,可以应用于制备治疗骨肉瘤的药物中。(The invention provides a preparation method and application of a bone targeting nano-reagent containing glaucocalyxin A, belonging to the field of biological materials. The bone targeting nanometer reagent containing glaucocalyxin A is prepared by coating glaucocalyxin A in CHO-PEG 2k ‑(ALN) 2 The copolymer was obtained. CHO-PEG 2k ‑(ALN) 2 The preparation method of the copolymer comprises the following steps: reacting N-tert-butyloxycarbonyl ethylenediamine with methyl acrylate at 35-45 ℃ for 42-54h to obtain hyperbranched molecules; reacting the hyperbranched molecules under the condition of pH8.0-9.0 to obtain hyperbranched ethylenediamine cross-linked molecules; reacting the sodium alendronate with hyperbranched ethylenediamine cross-linked molecules to obtain a compound 4; and dissolving the compound 4 in a saturated solution of hydrogen chloride and methanol, and reacting to obtain the copolymer. The nano reagent has bone tumor targeting property and better tumor treatment effect, the preparation method is simple, and the obtained nano particles have better size uniformity and can be applied to the preparation of medicines for treating osteosarcoma.)
技术领域
本发明属于生物医药和生物材料领域，具体涉及一种含蓝萼甲素的骨靶向纳米试剂的制备方法及其应用。
背景技术
骨肉瘤作为青少年原发恶性骨组织肿瘤中最常见的一种，其恶性程度高，侵袭性强，病情进展十分迅速，死亡率极高。目前，临床上治疗骨肉瘤的方法主要包括手术治疗、化疗、放疗等传统方法以及综合治疗。骨肉瘤的病发部位在骨组织中，肿瘤边缘不清晰，手术治疗不能完全切除病灶导致肿瘤复发和转移；常规药物的靶向性差，药物难以到达骨组织导致疗效低，同时治疗靶点单一，且长期使用会造成多药耐药性。目前尚未有专门用于治疗骨肉瘤的药物，因此迫切需要研发可抑制骨肉瘤增殖与转移且可以主动靶向作用于骨组织的新药。
发明内容
本发明的目的是提供一种含蓝萼甲素的纳米试剂，具有骨肿瘤靶向性和较好的肿瘤治疗效果。
本发明的另一目的是提供所述骨靶向纳米制剂的其制备方法，该方法操作简单、成本低，得到的纳米粒子尺寸均一性较好。
本发明的第三个目的是含蓝萼甲素的骨靶向纳米试剂在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。
一种含蓝萼甲素的骨靶向纳米试剂，是将蓝萼甲素包裹在CHO-PEG2k-(ALN)2共聚物中所得，所述CHO-PEG2k-(ALN)2共聚物的结构式如下：
其中n为1000-5000。
本发明还提供一种含蓝萼甲素的骨靶向纳米试剂的制备方法，包括如下步骤：CHO-PEG2k-(ALN)2共聚物和蓝萼甲素溶于四氢呋喃中，然后滴加到搅拌状态下的水中后，除去四氢呋喃，最后离心，取上清液，即得含蓝萼甲素的骨靶向纳米粒子。
在本发明中，所述CHO-PEG2k-(ALN)2共聚物采用如下方法制备：
(1)N-叔丁氧羰基乙二胺和丙烯酸甲酯，在氮气气氛中，在35-45℃、搅拌状态下反应42-54h，得到超支化分子；
(2)将超支化分子在pH值为8.0-9.0条件下反应，得到超支化乙二胺交联分子；
(3)阿伦磷酸钠和超支化乙二胺交联分子反应，得到化合物4，结构式如下：
(4)化合物4溶于氯化氢甲醇饱和溶液中，在室温下反应6-10h，得到CHO-PEG2k-(ALN)2共聚物。
在本发明中，步骤(2)反应条件如下：反应温度为室温，搅拌状态下反应4-8小时。
在本发明中，步骤(3)中反应时间为20-28h。
本发明还提供所述含蓝萼甲素的骨靶向纳米试剂在制备治疗骨肉瘤的药物方面的应用。
与现有技术相比，本发明的主要优点包括以下几个方面：(1)本发明制备的骨靶向纳米粒子结构明确，合成工艺简单。(2)本发明制备的骨靶向纳米粒子粒子水溶性好，粒径均一，具有较好的骨瘤靶向性。(3)本发明制备的含蓝萼甲素的骨靶向纳米试剂具有优异的抗肿瘤效果和生物安全性，毒副作用低，作为新型抗骨肉瘤靶向药物具备良好的应用前景。
附图说明
图1关键中间体化合物2的质谱图。
图2是蓝萼甲素骨靶向纳米粒子的TEM图,说明制备的纳米粒在60-120nm之间。
图3：是蓝萼甲素单体及骨靶向纳米试剂治疗骨肉瘤细胞的细胞活力图。
图4：是蓝萼甲素骨靶向纳米粒子诱导人骨肉瘤细胞凋亡的流式双染图，Contrl组为空白对照，细胞几乎没有凋亡发生，与蓝萼甲素水溶液给药组GLA(10μM)相比，蓝萼甲素纳米粒子组(GLA-CHO)和蓝萼甲素骨靶向纳米组(GLA-CHO-ALN)的凋亡程度显著提高。
图5：是蓝萼甲素骨靶向纳米试剂治疗裸鼠体内骨肉瘤肿瘤治疗结果图。
具体实施方式
实例1骨靶向纳米材料的制备
(1)超支化分子的合成
将3g的N-Boc-乙二胺(N-叔丁氧羰基乙二胺，18.72mmol)溶于100ml甲醇，将12.89g丙烯酸甲酯(149.76mmol)滴加于上述溶液中，在氮气气氛中，在40℃、搅拌状态下反应48h。将反应产物在50℃减压条件下，用旋转蒸发器去除溶剂和过量丙烯酸甲酯，将该化合物干燥，得到6.08g粘稠无色透明油状的化合物1(18.31mmol)，收率为97.8％。反应式如下：
(2)超支化乙二胺交联分子的合成
将6.01g化合物1(18.08mmol)加入圆底烧瓶中，溶解于6ml四氢呋喃中，加入0.1M的氢氧化钠水溶液调节pH值至8.5，在室温(10-30℃)、搅拌状态下反应6小时。反应结束后，用1M的盐酸将混合物的pH调节至6.0。在减压下除去溶剂，将残余物溶解在20mL甲醇中，并在冰水浴中冷却，然后过滤取滤液，旋转蒸发去除溶剂，得到3.66g白色泡沫状化合物2(12.03mmol)，收率66.52％。化合物2的质谱图如图1所示。反应式如下：
(3)超支化乙二胺交联分子与阿伦磷酸钠的缩合反应
将7.08g阿伦磷酸钠(21.78mmol)添加到20ml去离子水中，形成悬浮液。向悬浮液中逐滴加入0.1M的氢氧化钠水溶液，直到pH值为8.5，此时悬浮液变为透明溶液。在氮气气氛中、室温下，将1.52g化合物2(4.99mmol)溶解于6ml N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的DMF溶液(NHS含量为2.30g，DMF是干燥的)中，搅拌1h，然后添加3.83g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC，19.98mmol)和2.02g的三乙醇胺(TEA，20mmol)，在搅拌状态下反应12h。用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤反应产物，取水层，然后用CH2Cl2萃取2次，每次CH2Cl2的用量为5毫升，收集所有有机相并减压蒸发，残渣经硅胶柱(洗脱液是体积比为15:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液)纯化，得到1.81g透明液体化合物3(3.63mmol)，收率72.75％。
将1.81g化合物3溶于乙腈(20ml)中，然后将该溶液分为四份，每15分钟向50ml、30mM阿伦磷酸钠水溶液中添加1mL。在每次添加之前，用1M NaOH溶液将pH保持在8.5。化合物3加样结束后，在室温、搅拌状态下，反应12h，然后旋转蒸发得到化合物4(2.20g，2.71mmol，74.66％)。反应式如下：
(4)CHO-PEG2k-(ALN)2共聚物的合成
将化合物4(2.20g，2.71mmol)溶于HCl-MeOH饱和溶液中，在室温下搅拌反应8h，然后旋转蒸发得到1.35g化合物5(1.90mmol)，收率70.11％。反应式如下：
1.25克的CHO-PEG2k-COOH(Mw＝2000，0.5mmol)与0.23g的NHS(2mmol)和0.38g的EDC(2mmol)溶解于无水DMF(6mL)中并搅拌1h以激活羧酸部分。将1.35g化合物5(1.90mmol)溶于4ml无水DMF中，然后加入2.02g的TEA(20mm)，搅拌均匀后加入上述配制的含有CHO-PEG2k-COOH的溶液中，室温(10-30℃)、搅拌下反应24h。将所得溶液倒入透析袋(MWCO1000Da)中并用去离子水透析72小时，以去除其他未反应的分子。最后冷冻干燥得到目标产物CHO-PEG2k-(ALN)2，其中ALN是阿伦磷酸钠的缩写。PEG是聚乙二醇的缩写。反应式如下：
其中n＝2000。
实例2蓝萼甲素骨靶向纳米粒子的制备
称取100mg实施例1制备的CHO-PEG2k-(ALN)2共聚物和10mg蓝萼甲素，加入10ml四氢呋喃溶解，然后按照20滴/min的速度慢慢滴加到快速搅拌(1000转/分钟)的10ml水中后，加入氮气并搅拌120分钟，以除去溶液中的四氢呋喃，最后离心，取上清液，即得蓝萼甲素浓度为1mg/ml的蓝萼甲素骨靶向纳米粒子。
通过透射电子显微镜观察蓝萼甲素骨靶向纳米粒子的形貌和尺寸，结果如图2，可以发现纳米粒子呈球状，尺寸较为均匀，粒径大小在60～120nm之间，由于粒径小于200nm，因此蓝萼甲素骨靶向纳米粒子可以通过强渗透和长滞留(EPR)效应进入肿瘤组织内。
实例3蓝萼甲素骨靶向纳米粒子对人骨肉瘤细胞活力抑制作用
蓝萼甲素浓度为1mg/ml的蓝萼甲素骨靶向纳米粒子采用去离子水稀释至蓝萼甲素浓度分别为1、2、5、10、20、50μg的蓝萼甲素骨靶向纳米粒子。
另外，配制1、2、5、10、20、50μg/ml的蓝萼甲素水溶液(蓝萼甲素单体)。
取对数生长期的人骨肉瘤细胞143B细胞，按5×103～1×104个/孔的密度接种于96孔板内，每孔100μL，每孔分别加入不同浓度的蓝萼甲素骨靶向纳米粒子、蓝萼甲素水溶液，每个浓度的药物平行设置6个复孔，以考察各药物各浓度对人骨肉瘤细胞活力的抑制作用。各药物干预24h后，采用四唑盐(MTT)比色法评价蓝萼甲素骨靶向纳米粒子和蓝萼甲素水溶液对骨肉瘤细胞的生长及活力的影响。根据吸光度值计算蓝萼甲素骨靶向纳米粒子和蓝萼甲素单体对骨肉瘤细胞活力的抑制率，计算半数抑制浓度IC50值。如图3所示绘制细胞活力抑制图。蓝萼甲素骨靶向纳米粒子的IC50值为15.27μg/mL，蓝萼甲素水溶液的IC50为18.85μg/mL。与蓝萼甲素单体相比，蓝萼甲素骨靶向纳米粒子的IC50显著降低，说明蓝萼甲素骨靶向纳米粒子可以更好的抑制肿瘤增殖。
实例4流式细胞仪检测蓝萼甲素骨靶向纳米粒子诱导人骨肉瘤细胞凋亡的作用
蓝萼甲素浓度为10μg/mL的蓝萼甲素纳米粒子，按照实施例2中蓝萼甲素浓度为1mg/ml的蓝萼甲素骨靶向纳米粒子的制备方法进行制备，不同之处在于以100mg的PEG替代蓝萼甲素骨靶向纳米粒子，最后采用去离子水稀释至10μg/mL。
蓝萼甲素浓度为10μg/mL的蓝萼甲素骨靶向纳米粒子：将实施例2中蓝萼甲素浓度为1mg/ml的蓝萼甲素骨靶向纳米粒子采用去离子水稀释所得。
采用Annexin-PI双染试剂盒检测蓝萼甲素骨靶向纳米粒子诱导人骨肉瘤细胞凋亡的作用。取对数生长期的人骨肉瘤细胞143B细胞，用1640培养基制成2×106个细胞/ml的细胞悬液，接种于6孔培养板，每孔2mL，培养24h。去除培养液，每孔分别加入含有10μg/mL蓝萼甲素的蓝萼甲素水溶液、蓝萼甲素纳米粒子、蓝萼甲素骨靶向纳米粒子2mL，干预24h后，分别收集各孔上清中的死细胞，用不含EDTA的胰酶消化收集皿底的细胞，将上清和皿底细胞混匀，4℃条件下2000rpm离心5min，收集细胞，加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞，加入5μL的Annexin-V-FITC探针混匀后，再加入5μL PI染色，混匀、避光、反应15min，用流式细胞仪检测，得到蓝萼甲素骨靶向纳米粒子诱导人骨肉瘤细胞凋亡的流式双染图(图4),从图中可以看到，蓝萼甲素骨靶向纳米粒子给药组的细胞凋亡程度(49.6％+30.6％)比蓝萼甲素水溶液给药组的细胞凋亡程度(29.4％+23.1％)显著提高，说明蓝萼甲素骨靶向纳米粒可以更好的促进骨肉瘤细胞凋亡。
实例5蓝萼甲素骨靶向纳米粒子对裸鼠骨肉瘤原位肿瘤的治疗作用
采用肌肉注射麻醉的方法麻醉裸鼠，待裸鼠痛觉消失后，在8倍外科手术用显微镜下，采用显微外科手术的方法，用手术剪在裸鼠右后肢胫骨上端剪开1cm的纵切口，剪开皮肤，暴露胫骨上端。用1mL注射器沿胫骨方向穿通骨腔再拔出，用微量注射器吸取5μL的人骨肉瘤细胞143B细胞(浓度：2×106/5μL)注射入胫骨，边注射边慢慢往外抽，直到打完5μL，之后用外科缝线缝合创口。整个操作过程在超净工作台中完成。
待肿瘤生长至体积约为100mm3进行给药治疗，分为3组，空白对照组，蓝萼甲素单体给药组(蓝萼甲素水溶液)，蓝萼甲素骨靶向纳米粒给药组两天给药一次，蓝萼甲素单体给药组和蓝萼甲素骨靶向纳米粒给药组每次给药剂量均为5mg蓝萼甲素/kg。给药第21天处死，取肿瘤，测量并计算肿瘤体积。结果如图5所示。通过计算发现，与空白对照组相比，蓝萼甲素骨靶向纳米粒给药组肿瘤体积缩小了68％，蓝萼甲素单体给药组肿瘤体积缩小了23％。蓝萼甲素骨靶向纳米粒给药组的治疗效果比蓝萼甲素单体给药组治疗效果更好。