一种仿生纳米材料及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种仿生纳米材料及其制备方法和应用 (Bionic nano material and preparation method and application thereof ) 是由 欧青 于 2021-07-14 设计创作，主要内容包括：一种仿生纳米材料及其制备方法和应用。本发明涉及一种仿生纳米材料,所述仿生纳米材料包括二氧化铈、聚丙烯酸、二氢卟吩e6、华蟾酥毒基和仿生膜,聚丙烯酸涂复在二氧化铈表面合成纳米材料,华蟾酥毒基和二氢卟吩e6分别通过物理吸附和化学键结合负载在纳米材料表面得到纳米复合材料,仿生膜涂复于纳米复合材料外层得到仿生纳米材料,还提供了一种操作简单,易于规模化生产该仿生纳米材料的制备方法。本发明的仿生纳米材料具备了较好的稳定性、分散性及安全性,且产氧策略持续时间长,可在缺氧环境下依然保持有效的光动力杀伤效果,有利于减少化疗药物的副作用,增强其肿瘤富集效率,并应用于光动力治疗联合化疗抗肿瘤的治疗中。(A bionic nanometer material and its preparation method and application are provided. The invention relates to a bionic nano material which comprises cerium dioxide, polyacrylic acid, chlorin e6, cinobufagin and a bionic membrane, wherein the polyacrylic acid is coated on the surface of the cerium dioxide to synthesize the nano material, the cinobufagin and chlorin e6 are respectively loaded on the surface of the nano material through physical adsorption and chemical bond combination to obtain a nano composite material, and the bionic membrane is coated on the outer layer of the nano composite material to obtain the bionic nano material. The bionic nano material has better stability, dispersibility and safety, has long duration of an oxygen generating strategy, can still keep effective photodynamic killing effect in an anoxic environment, is beneficial to reducing the side effect of chemotherapy drugs and enhancing the tumor enrichment efficiency of the chemotherapy drugs, and is applied to the treatment of combining photodynamic therapy with chemotherapy for resisting tumors.)
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体说是一种仿生纳米材料及其制备方法和应用。
背景技术
化学疗法是目前运用最为广泛的肿瘤治疗手段之一,然而化疗药物的全身分布性和缺乏靶向能力也导致了对健康细胞的损伤。随着纳米技术在医学应用上的发展，通过多种治疗方式结合来降低化疗药物的用量或通过药物递送系统改善药物靶向策略让联合疗法给这一困境带来了新的希望。光动力/化疗的联合方式由于其良好的区域选择性、最小的侵袭性、较低的毒性已经开发了多种优秀的治疗策略。然而光动力疗法作为一种氧依赖性治疗方式在多数情况下与肿瘤内部的缺氧环境并不兼容，进入细胞的光敏剂往往找不到足够的氧气进行转化导致治疗效果的降低。为了克服这一问题，氧气载体策略被开发出来用于提供额外的氧气，但光动力治疗是一个长时间的治疗过程，单次爆发性供养方案的氧气利用率低，可持续性差。因此，仍然需要制定一种能够可持续产氧策略来应对当前的挑战。
二氧化铈是一种具有萤石结构的稀土金属氧化物，其特殊的外电子结构和氧空位导致了两种不同价态的铈离子(Ce3+/Ce4+)在表面共存，其中表面Ce3+的含量是类过氧化物酶的催化核心。因此这种独特的结构使得二氧化铈具有内源性类过氧化物酶活性,利用二氧化铈的类过氧化物酶活性可以主动分解肿瘤微环境中过量的H2O2产生氧气克服肿瘤缺氧。这种能够不断催化且不消耗自身的产氧方式有望开发一种持续性强、稳定性高的纳米酶活性制剂用于肿瘤治疗,然而二氧化铈的材料毒性和表面修饰能力弱等性质限制了这种材料的生物应用，另外大多数二氧化铈的合成方法需要极高的煅烧温度也对大规模生产造成困难,因此需要开发一种更为安全可靠且易于合成的二氧化铈纳米酶制剂。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种具有自产氧能力、可负载光敏剂和化疗药物、生物安全性高和粒径小的仿生纳米材料，还提供一种工艺简单、无需高温、耗时短、易于规模化的纳米仿生材料的制备方法，并相应地提供了一种上述仿生纳米材料在制备抗肿瘤光动力治疗联合化疗载体中的应用，本发明中仿生纳米材料为共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料。
本发明提供了一种仿生纳米材料，所述仿生纳米材料包括二氧化铈、聚丙烯酸、二氢卟吩e6、华蟾酥毒基和仿生膜，所述聚丙烯酸涂复在二氧化铈表面合成纳米材料，所述华蟾酥毒基和二氢卟吩e6分别通过物理吸附和化学键结合负载在纳米材料表面得到纳米复合材料，所述仿生膜涂复于纳米复合材料外层得到仿生纳米材料。
作为优选，所述仿生纳米材料的颗粒粒径为10nm-20nm。
本发明提供了上述一种仿生纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
S1、通过硝酸分解碳酸铈获得铈离子，将铈离子和聚丙烯酸均匀分散在双蒸水中，滴加氨水搅拌，氨水的加入方式为逐滴缓慢滴加，离心去除不溶性沉淀后经超声分散得到聚丙烯酸修饰的二氧化铈，即获得所述纳米材料；
S2、将二氢卟吩e6与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)搅拌混合后再加入步骤S1制得的聚丙烯酸修饰的二氧化铈继续搅拌，所得溶液离心分散后得到负载二氢卟吩e6的聚丙烯酸修饰的二氧化铈；
S3、将华蟾酥毒基加入负载二氢卟吩e6的聚丙烯酸修饰的二氧化铈中混合搅拌，经离心分散后得到共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈，即获得所述纳米复合材料；
S4、将收集的红细胞膜与癌细胞膜超声破碎，通过在PBS中搅拌反应制得仿生膜；
S5、将共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈与仿生膜共超声后在恒温水浴下搅拌，经离心分散后得到共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料，即获得所述仿生纳米材料。
作为优选，所述步骤S1中聚丙烯酸和碳酸铈比例为1:2.3～3，所述氨水的浓度为20％～30％，搅拌速度为500rpm～700rpm，搅拌时间为12～16h，离心转速为3500rpm～4500rpm，离心时间为5～10min，共离心水洗5～7次，超声功率为80W～100W，超声时间为10～15min。
作为优选，所述步骤S2中聚丙烯酸修饰的二氧化铈、二氢卟吩e6、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的比例为0.05：0.5～1：6～12：12～24，搅拌速度为500rpm～700rpm，二氢卟吩e6加入EDC和NHS后搅拌时间为2～6h，再加入聚丙烯酸修饰的二氧化铈后搅拌时间为6～24h，离心转速为10000rpm～12000rpm，离心时间为10～15min。
作为优选，所述步骤S3中华蟾酥毒基和负载二氢卟吩e6的聚丙烯酸修饰的二氧化铈的比例为0.5～1：10，搅拌速度为500rpm～700rpm，搅拌时间为4～6h，离心转速为10000rpm～12000rpm，离心时间为10～15min。
作为优选，所述步骤S4中红细胞膜与癌细胞膜的比例为2：1～2，超声功率为80W～100W，超声时间为2～5min，超声温度为0～-4℃，搅拌速度为500rpm～700rpm，搅拌时间为2～3h。
作为优选，所述步骤S5中共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈与仿生膜的比例为1：5～10，超声功率为80W～100W，超声时间2～5min，所述水浴搅拌速度为500rpm～700rpm，水浴温度为35～37℃，搅拌时间为2～4小时，离心转速为8000～1000rpm。
本发明提供了一种仿生纳米材料在制备抗肿瘤光动力治疗联合化疗载体中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料，其聚丙烯酸涂层改善了二氧化铈的水溶性和难以修饰性，其仿生涂层改善了二氧化铈的生物安全性。
2、本发明的仿生纳米材料由聚丙烯酸包裹的二氧化铈作为核心载体，聚丙烯酸的包裹可以作为载体基底通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)化学键结合负载二氢卟吩e6，这一负载方式使得二氢卟吩e6难以从材料表面泄露，减少其全身性的光毒性，同时可以通过物理吸附负载华蟾酥毒基，这种负载方式可以通过pH值调节结合强弱使得化疗药物可控释放，减少化疗药物对健康细胞的损伤。仿生膜的伪装可以逃避巨噬细胞的识别，同时通过同型靶向原理主动靶向至肿瘤组织，改善二氧化铈的靶向性和体内滞留时间，延长仿生纳米材料的循环时间，有利于减少化疗药物的副作用，增强其肿瘤富集效率。
3、本发明将二氢卟吩e6和华蟾酥毒基负载于聚丙烯酸包裹的二氧化铈上的结构设计来制备仿生纳米材料，可广泛应用于肿瘤缺氧微环境所引起效果减弱的光动力治疗。该仿生纳米材料利用二氧化铈的自产氧能力和二氢卟吩e6的活性氧转化能力设计了产氧-耗氧气-产活性氧的级联反应抗肿瘤策略。与传统氧气载体策略相比具有更强的可持续性，氧气利用率更高。本发明的仿生纳米材料还具有光响应和pH响应机制，可以实现活性氧、化疗药物的可控释放，在激光促进下激活二氢卟吩e6产生活性氧，可在缺氧环境下依然保持有效的光动力杀伤效果，在低pH值下主动释放药物降低化疗药物和光敏剂的毒副作用，其极小的粒径也有利于增加二氧化铈的表面活性和仿生纳米材料的组织渗透性。
4、本发明的原材料的选择和结构顺序的设计相辅相成，使本发明的仿生纳米材料具备了较好的稳定性、分散性及安全性，在激光照射下该仿生纳米材料能产生活性氧引起细胞凋亡，二氧化铈能够提供额外的氧气用于供给活性氧生产时的消耗，可应用于处于极端缺氧环境的肿瘤治疗中，通过联合氧气、光动力以及化疗达成多手段治疗策略。
5、本发明提供的负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料的制备方法操作简单，无需高温，耗时短，易于规模化生产应用。
附图说明
图1为本发明实施例1负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料的透射电镜图；
图2为本发明实施例1二氧化铈、二氢卟吩e6、共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈和共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料的紫外吸收光谱曲线图；
图3为本发明实施例1共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料加入外源性H2O2后的产氧曲线，右下角附图为产氧的实物图片；
图4为本发明实施例1共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料消耗H2O2的速率；
图5为本发明实施例1共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈和共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料的免疫逃避成像，其中灰色荧光代表进入巨噬细胞的纳米复合材料(CPCC)/纳米仿生材料(CPCCM)；
图6为本发明实施例1游离的二氢卟吩e6、共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈和共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料的生物分布定量图；
图7为本发明实施例1游离的二氢卟吩e6、共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈和共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料的活死染色图像(灰色荧光代表被标记的死细胞)；
图8为本发明实施例1游离的二氢卟吩e6和华蟾酥毒基、共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈和共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料处理乳腺癌小鼠后的肿瘤体积变化；
图9为本发明实施例1游离的二氢卟吩e6和华蟾酥毒基、共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈和共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料处理乳腺癌小鼠后肿瘤荧光强度变化(黑圈表示荧光范围)。
具体实施方式
下面将结合图1-9详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定，以下实施例中，若无特别说明，所采用的原料和仪器均为市售，浓度单位M为mol/L，DMSO为二甲基亚砜，PBS为磷酸缓冲盐溶液。
实施例1
一种本发明提供的仿生纳米材料，仿生纳米材料包括二氧化铈、聚丙烯酸、二氢卟吩e6、华蟾酥毒基和仿生膜，聚丙烯酸涂复在二氧化铈表面合成纳米材料，所述华蟾酥毒基和二氢卟吩e6分别通过物理吸附和化学键结合负载在纳米材料表面得到纳米复合材料，仿生膜涂复于纳米复合材料外层得到仿生纳米材料，仿生纳米材料的颗粒粒径为10nm-20nm。
本发明提供了上述一种仿生纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
S1、将1M铈离子(本方法利用浓硝酸分解2.3g碳酸铈得到)和1g聚丙烯酸均匀分散在双蒸水中，缓慢滴加40ml 30％氨水在搅拌机600rpm下搅拌至溶液变为淡黄色，继续搅拌12h至溶液变为深棕色。经离心机4000rpm下离心10min去除不溶性沉淀，继续在该条件下离心水洗5次经80W～100W超声15min得到聚丙烯酸修饰的二氧化铈，即获得纳米材料(记作CP)；
S2、将1mg二氢卟吩e6溶于1ml DMSO，再加入12mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和24mg的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)在搅拌机600rpm下搅拌4h，将反应结束的混合物滴入1mg/ml聚丙烯酸修饰的二氧化铈中继续搅拌24h。经离心机12000rpm下离心15min获得负载二氢卟吩e6的聚丙烯酸修饰的二氧化铈；
S3、将100ug/ml的华蟾酥毒基加入到获得的负载二氢卟吩e6的聚丙烯酸修饰的二氧化铈中，并于搅拌机600rpm下搅拌4h，再经离心机12000rpm下离心15min获得共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈，即获得纳米复合材料(记作CPCC)；
S4、将收集的红细胞膜与癌细胞膜80W～100W冰上超声5min破碎大片的膜结构，通过PBS1：1混合两种膜溶液在37℃下的搅拌机600rpm下搅拌4h制得仿生膜；
S5、将制备的共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈与仿生膜1：10混合于80W超声2min后在水浴温度37℃，搅拌机600rpm下水浴搅拌4h，经离心机8000rpm离心分散后得到共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料，即获得仿生纳米材料(记作CPCCM)。
如图1所示，对本实施例中制得的聚丙烯酸修饰的二氧化铈(CP)、共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料(CPCCM)进行透射电镜成像分析，其结果表明均匀分散的球形二氧化铈被成功制备，且粒径为15nm±5，仿生膜成功包裹在共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈表面。
用紫外分光光度计分析本实施例1制得的聚丙烯酸修饰的二氧化铈(CP)、二氢卟吩e6(Ce6)、共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈(CPCC)和共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料(CPCCM)，得到如图2所示的紫外吸收光谱图，从图中可以看到CPCCM出现了Ce离子、二氢卟吩e6和杂化膜(M)的特征吸收峰。
如图3和图4所示，对本实施例1中制得的共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料(CPCCM)进行体外过氧化物酶酶活性评估，结果表面在外源H2O2的加入后10min内氧气迅速增加，右下角的实物图像观察到明显的汽包生成。同时过氧化氢在仿生纳米材料加入后迅速分解表明了共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料可以催化H2O2的分解产生大量氧气。
实施例2
一种本发明的共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料在免疫逃避和肿瘤靶向的应用，采用实施例1制得的共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料。
将共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈(CPCC)和共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料(CPCCM)与巨噬细胞共孵育观察其摄取程度，其中灰色荧光代表进入巨噬细胞的纳米复合材料(CPCC)/纳米仿生材料(CPCCM)，结果如图5所示，未经仿生膜包裹的纳米复合材料(CPCC)在浓度达到100μg/ml以上时被巨噬细胞识别并吞噬，而仿生膜包裹的纳米复合材料(CPCCM)在该浓度范围内未被吞噬表明仿生膜的修饰能够有效逃避免疫系统的识别。图6的体内靶向实验表明(图中CCeO2是CPCC，CCeO2M是CPCCM)，尾静脉注射48h后游离的二氢卟吩e6(Free Ce6)的在肿瘤部位(Tumor)荧光强度明显低于纳米复合材料(CPCC)，而经过仿生膜包裹后的纳米复合材料(CPCCM)具有更强的荧光，进一步提高了肿瘤的富集量，并能延长在肿瘤内的滞留时间。
实施例3
一种本发明的共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料在体外抗乳腺癌细胞中的应用，采用实施例1制得的共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料。
通过活死染色法(图中灰色光点为被标记的死细胞)评估缺氧环境下激光激活/关闭的二氢卟吩e6(Ce6)、共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈(CPCC)和共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料(CPCCM)对乳腺癌细胞的杀伤作用。如图7所示，由于缺氧环境的影响在激光照射下二氢卟吩e6无法发挥正常的光动力杀伤效果，荧光强度较弱。CPCC在未经过激光照射时药物主动释放荧光增加，CPCCM未经激光照射时由于膜的包裹药物释放速率较低，荧光弱于CPCC。在激光照射下，CPCCM的膜结构崩解导致药物释放增加同时二氧化铈的催化产氧作用改善了肿瘤缺氧环境，CPCCM和CPCC均能在激光照射下达到高强度的杀伤作用。
实施例4
一种本发明的共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料在体内抗乳腺癌细胞中的应用，采用实施例1制得的共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料。
如图8和图9所示，用100μl浓度为2mg/ml的共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈(CPCC)和共负载二氢卟吩e6和华蟾酥毒基的聚丙烯酸修饰的二氧化铈仿生纳米材料(CPCCM)以及游离的二氢卟吩e6和华蟾酥毒基(CC+L)处理乳腺癌移植瘤小鼠，其中L表示激光。与对照组相比CPCCM+L处理后的小鼠肿瘤于第6天体积下降并保持不变，表明肿瘤生长被抑制，通过小鼠治疗结束后的荧光图像(荧光为肿瘤细胞的生物荧光即黑圈标记)，CPCCM+L组荧光强度以及低至检测下限，表明CPCCM+L能起到较好的乳腺癌荷瘤治疗效果。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。