阅读说明：本技术 基于芘和香豆素衍生物的亚硫酸氢根荧光探针、制备方法及应用 (Pyrene and coumarin derivative-based bisulfite fluorescent probe, and preparation method and application thereof ) 是由 高光芹 郑昕 谢普会 赵鹏飞 申丽婕 郭冰洁 凡雨鑫 李明旻 于 2020-06-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种基于芘和香豆素衍生物的亚硫酸氢根荧光探针、制备方法及应用,荧光探针的结构式如下：<Image he="95" wi="139" file="DEST_PATH_IMAGE002.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>,将1-乙酰基芘和4-(二乙氨基)水杨醛溶解于甲烷磺酸中,90℃反应一段时间,反应完全后,将反应液倒入冰水中,加入高氯酸,有大量沉淀产生,抽滤得固态粗产品,固态粗产品经硅胶柱层析分离得到荧光探针(B1)。该探针在CH<Sub>3</Sub>CN-HEPES(v/v＝6:4,v/v,pH＝7.4)缓冲溶液中与SO<Sub>2</Sub>发生特异性亲核反应,从而实现对水溶液中亚硫酸氢根的特异性识别检测。(The invention provides a pyrene and coumarin derivative-based bisulfite fluorescent probe, a preparation method and application thereof, wherein the structural formula of the fluorescent probe is as follows: dissolving 1-acetylpyrene and 4- (diethylamino) salicylaldehyde in methanesulfonic acid, reacting for a period of time at 90 ℃, pouring the reaction solution into ice water after the reaction is completed, adding perchloric acid, generating a large amount of precipitates, performing suction filtration to obtain a solid crude product, and performing silica gel column chromatography separation on the solid crude product to obtain the fluorescent probe (B1). The probe is in CH 3 Reaction with SO in CN-HEPES (v/v: 6:4, v/v, pH 7.4) buffer solution 2 A specific nucleophilic reaction is carried out, thereby realizing the sulfurous acid in the aqueous solutionSpecific recognition and detection of hydrogen radicals.)

基于芘和香豆素衍生物的亚硫酸氢根荧光探针、制备方法及 应用

技术领域

本发明涉及亚硫酸氢根检测剂领域，具体涉及一种基于芘和香豆素衍生物的亚硫酸氢根荧光探针、制备方法及应用。

背景技术

二氧化硫（SO₂）会造成大气污染，二氧化硫容易溶于水，在水中会以其衍生物亚硫酸氢根（HSO₃ ^-）或者亚硫酸根（SO₃ ^2-）的形式存在。过多接触二氧化硫会对生物体的健康造成危害。长期暴露在二氧化硫气体中会对人的呼吸系统带来危害，大大的增加了心血管疾病以及呼吸系统疾病的风险。例如，过量摄入二氧化硫会给人体的胃肠带来损伤。因此，对于二氧化硫残留量的检测是非常有必要的。传统的几种技术，包括电化学法、色谱法、毛细管电泳法已被开发用于检测二氧化硫衍生物，但此类方法大多耗时较长，会对被检测物质的结构造成破坏。

荧光探针检测法具有高灵敏度、操作简单、非侵入性、非破坏性、高选择性、高时序性、和空间分辨率高、生物相容性好等突出优势,尤其在实时监测上格外适合。荧光探针既可以在环境中也可以在生物体内检测被测物。正因如此，其在化学、环境、医学和生物方面有着非常普遍的应用。正因如此，以荧光探针来检测二氧化硫残留量的方法已经越来越受到人们关注。荧光探针可以在短期内得出成果，时效性好，同时不会对被检测物质造成损坏。

发明内容

本发明提出了一种基于芘和香豆素衍生物的亚硫酸氢根荧光探针、制备方法及应用，解决了现有技术中常规的亚硫酸氢根检测剂不能应用于实际医疗中，制备方法复杂且细胞毒性大的技术问题。

本申请基于SO₂的亲核性设计了一种含芘和香豆素结构荧光探针，该探针在CH₃CN-HEPES（v/v＝6:4, v/v, pH＝7.4）缓冲溶液中与SO₂发生特异性亲核反应，从而实现对水溶液中亚硫酸氢根的特异性识别检测。

实现本发明的技术方案是：

一种基于芘和香豆素衍生物的亚硫酸氢根荧光探针，荧光探针的结构式如下：。

所述的基于芘和香豆素衍生物的亚硫酸氢根荧光探针的制备方法，步骤如下：将1-乙酰基芘和4-(二乙氨基)水杨醛溶解于甲烷磺酸中，90℃反应一段时间，反应完全后，将反应液倒入冰水中，加入高氯酸，有大量沉淀产生，抽滤得固态粗产品，固态粗产品经硅胶柱层析分离得到荧光探针（B1）。

合成路线为：

所述1-乙酰基芘和4-(二乙氨基)水杨醛的摩尔比为1：（1-6），反应时间为8-18h。

所述1-乙酰基芘与甲烷磺酸的摩尔比为1：（25-50），1-乙酰基芘与高氯酸的摩尔比为1：（6-16）。

所述硅胶柱层析分离采用体积比为1:（20-40）的甲醇和二氯甲烷的洗脱液，荧光探针产率为45-85%。

所述的荧光探针在检测亚硫酸氢根领域的应用。

所述基于芘和香豆素衍生物的荧光探针对亚硫酸氢根的识别机理如下：

本发明的有益效果是：

（1）本申请所涉及的荧光探针具有较高的荧光量子产率、原料简单、合成方法简单，产率较高易得等诸多优点。

（2）本申请所涉及的荧光探针的荧光发射波长（630 nm）在近红外区。环境中和生物体及组织中的一些内源性荧光团产生“自荧光”，其发射波长都在可见光区域（400～600nm），同时生物机体组织对可见光的散射较强，经常对外源性荧光探针的荧光信号造成了严重干扰。而环境中和生物机体组织内在近红外区域（600～900 nm）的背景荧光明显减弱并且吸收系数最小，对近红外光的散射也较少，可以使近红外光能在生物体内具有较强的组织穿透性。本申请所涉及的荧光探针大大降低了相关背景干扰，因而能增加荧光技术的灵敏度和穿透性。

（3）本申请所涉及的荧光探针对亚硫酸氢根具有高效专一的识别性能，具有抗干扰性强，响应速度快（响应时间为30 s）、灵敏度高（对亚硫酸氢根的最低检出限为39 nM）的优点。

（4）本申请所涉及的荧光探针对亚硫酸氢根的识别主要是利用亚硫酸氢根的亲核性，探针与亚硫酸氢根发生特异性亲核加成。其识别机理通过高分辨质谱进行了确证。单独探针的正离子模式下高分辨质谱测试数据为402.1850（理论值为402.1852），探针与亚硫酸氢根发射特异性识别反应后负离子模式下高分辨质谱测试数据为482.1434（理论值为482.1432）（附图10）。高分辨质谱数据验证了本申请的荧光探针识别亚硫酸氢根的识别机理，为进一步开发更多的亚硫酸氢根荧光探针奠定了基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的实施例1荧光探针B1核磁共振氢谱图（溶剂为DMSO）。

图2为本发明的实施例1荧光探针B1核磁共振碳谱图（溶剂为DMSO）。

图3为本发明的实施例1荧光探针B1高分辨质谱图（溶剂为CH₃OH）。

图4为本发明的荧光探针B1荧光选择性图，激发波长550 nm。

图5为本发明的荧光探针B1识别亚硫酸氢根的荧光抗干扰性图，激发波长550 nm，发射波长630 nm。

图6为本发明的荧光探针B1识别亚硫酸氢根的荧光滴定图，激发波长550 nm。

图7为本发明的荧光探针B1识别亚硫酸氢根的最低检出限图，激发波长550 nm，发射波长630 nm。

图8为本发明的荧光探针B1识别亚硫酸氢根的pH适用图，激发波长550 nm，发射波长630 nm。

图9为本发明的荧光探针B1识别亚硫酸氢根的荧光动力学图，激发波长550 nm，发射波长630 nm。

图10为本发明的荧光探针B1识别亚硫酸氢根的高分辨机理验证图（溶剂为CH₃OH，负离子模式）。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1-乙酰基芘（244.3 mg, 1 mmol）和4-(二乙氨基)水杨醛（193.3 mg, 1 mmol）溶于甲烷磺酸（2.4 g, 25 mmol）中，加热至90℃搅拌反应8小时，反应完全后，将反应液倒入冰水中，加入高氯酸（603 mg, 6 mmol），有大量沉淀产生，抽滤得固体的粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离（洗脱液为甲醇：二氯甲烷=1:25，体积比）得到紫色固体225 mg即为产物B1，产率为45%。

核磁共振测定：¹H NMR (DMSO-d ₆ , 400 MHz) δ 1.23 (t, J = 7.2 Hz, 6 H),3.66 (d, J = 5.2 Hz, 4 H), 7.06 (d, J = 1.6 Hz, 1 H), 7.38 (dd, J = 2.0 Hz, 1H), 7.89 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 8.20 (m,2 H), 8.43 (m,6 H), 8.58 (d, J = 9.2Hz, 1 H), 8.68 (d, J = 8.0 Hz, 1 H); ¹³C NMR (DMSO-d ₆ , 100 MHz) δ 12.5, 46.2,55.4, 96.0, 114.9, 119.4, 119.7, 123.6, 123.8, 124.3, 124.9, 125.6, 127.2,127.6, 127.7, 128.9, 129.3, 130.4, 130.9, 131.1, 132.9, 134.4, 148.5, 156.8,160.3, 167.4。核磁共振氢谱图如图1所示，核磁共振碳谱图如图2所示。

高分辨质谱测定：HR-ESI-MS calcd for C₂₉H₂₄NO⁺: 402.1852, found 402.1850[M+H⁺]。高分辨质谱图如图3所示。

实施例2

1-乙酰基芘（244.3 mg, 1 mmol）和4-(二乙氨基)水杨醛（386.6 mg, 2 mmol）溶于甲烷磺酸（3.8 g, 40 mmol）中，加热至90℃搅拌反应12小时，反应完全后，将反应液倒入冰水中，加入高氯酸（804 mg, 6 mmol），有大量沉淀产生，抽滤得固体的粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离（洗脱液为甲醇：二氯甲烷=1:30，体积比）得到紫色固体275 mg即为产物B1，产率为55%。

核磁共振测定：¹H NMR (DMSO-d ₆ , 400 MHz) δ 1.23 (t, J = 7.2 Hz, 6 H),3.66 (d, J = 5.2 Hz, 4 H), 7.06 (d, J = 1.6 Hz, 1 H), 7.38 (dd, J = 2.0 Hz, 1H), 7.89 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 8.20 (m,2 H), 8.43 (m,6 H), 8.58 (d, J = 9.2Hz, 1 H), 8.68 (d, J = 8.0 Hz, 1 H); ¹³C NMR (DMSO-d ₆ , 100 MHz) δ 12.5, 46.2,55.4, 96.0, 114.9, 119.4, 119.7, 123.6, 123.8, 124.3, 124.9, 125.6, 127.2,127.6, 127.7, 128.9, 129.3, 130.4, 130.9, 131.1, 132.9, 134.4, 148.5, 156.8,160.3, 167.4。核磁共振氢谱图如图1所示，核磁共振碳谱图如图2所示。

高分辨质谱测定：HR-ESI-MS calcd for C₂₉H₂₄NO⁺: 402.1852, found 402.1850[M+H⁺]。高分辨质谱图如图3所示。

实施例3

1-乙酰基芘（244.3 mg, 1 mmol）和4-(二乙氨基)水杨醛（773.2 mg, 4 mmol）溶于甲烷磺酸（4.3 g, 45 mmol）中，加热至90℃搅拌反应13小时，反应完全后，将反应液倒入冰水中，加入高氯酸（1.2 g, 12 mmol），有大量沉淀产生，抽滤得固体的粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离（洗脱液为甲醇：二氯甲烷=1:35，体积比）得到紫色固体350 mg即为产物B1，产率为70%。

核磁共振测定：¹H NMR (DMSO-d ₆ , 400 MHz) δ 1.23 (t, J = 7.2 Hz, 6 H),3.66 (d, J = 5.2 Hz, 4 H), 7.06 (d, J = 1.6 Hz, 1 H), 7.38 (dd, J = 2.0 Hz, 1H), 7.89 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 8.20 (m,2 H), 8.43 (m,6 H), 8.58 (d, J = 9.2Hz, 1 H), 8.68 (d, J = 8.0 Hz, 1 H); ¹³C NMR (DMSO-d ₆ , 100 MHz) δ 12.5, 46.2,55.4, 96.0, 114.9, 119.4, 119.7, 123.6, 123.8, 124.3, 124.9, 125.6, 127.2,127.6, 127.7, 128.9, 129.3, 130.4, 130.9, 131.1, 132.9, 134.4, 148.5, 156.8,160.3, 167.4。核磁共振氢谱图如图1所示，核磁共振碳谱图如图2所示。

高分辨质谱测定：HR-ESI-MS calcd for C₂₉H₂₄NO⁺: 402.1852, found 402.1850[M+H⁺]。高分辨质谱图如图3所示。

实施例4

1-乙酰基芘（244.3 mg, 1 mmol）和4-(二乙氨基)水杨醛（1159.8 mg, 6 mmol）溶于甲烷磺酸（4.8 g, 50 mmol）中，加热至90℃搅拌反应18小时，反应完全后，将反应液倒入冰水中，加入高氯酸（1.6 g, 16 mmol），有大量沉淀产生，抽滤得固体的粗产品。粗产品经硅胶柱层析分离（洗脱液为甲醇：二氯甲烷=1:40，体积比）得到紫色固体425 mg即为产物B1，产率为85%。

核磁共振测定：¹H NMR (DMSO-d ₆ , 400 MHz) δ 1.23 (t, J = 7.2 Hz, 6 H),3.66 (d, J = 5.2 Hz, 4 H), 7.06 (d, J = 1.6 Hz, 1 H), 7.38 (dd, J = 2.0 Hz, 1H), 7.89 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 8.20 (m,2 H), 8.43 (m,6 H), 8.58 (d, J = 9.2Hz, 1 H), 8.68 (d, J = 8.0 Hz, 1 H); ¹³C NMR (DMSO-d ₆ , 100 MHz) δ 12.5, 46.2,55.4, 96.0, 114.9, 119.4, 119.7, 123.6, 123.8, 124.3, 124.9, 125.6, 127.2,127.6, 127.7, 128.9, 129.3, 130.4, 130.9, 131.1, 132.9, 134.4, 148.5, 156.8,160.3, 167.4。核磁共振氢谱图如图1所示，核磁共振碳谱图如图2所示。

高分辨质谱测定：HR-ESI-MS calcd for C₂₉H₂₄NO⁺: 402.1852, found 402.1850[M+H⁺]。高分辨质谱图如图3所示。

实施效果例

1 mM的探针溶液配制：准确称量实施例1制备的探针(B1)，B1溶解在乙腈（CH₃CN）溶液中配制1 mM的溶液备用。

荧光选择性实验：

专一的选择性是考察荧光探针优异性的首要条件。配制pH为7.4、浓度为10 mM的HEPES缓冲溶液，并用乙腈配制浓度为1 mM的探针B1乙腈溶液。用荧光光谱仪考察了探针B1对亚硫酸氢根的选择性。如附图4所示，在550 nm的荧光激发条件下，单独的探针探针B1 (10 µM)在CH₃CN-HEPES（v/v＝6:4, v/v, pH＝7.4）缓冲溶液中在630 nm处具有较强的荧光发射强度，当加入亚硫酸氢根(10 eq.)后，在630 nm处的荧光发射几乎完全淬灭，但是加入其它活性小分子物质(10 eq.)后，溶液体系的荧光发射强度与单独探针体系的荧光发射强度相比没有明显变化。以上实验结果表明，该探针对亚硫酸氢根具有较好的专一选择性。

抗干扰性实验：

为了测试探针分子对亚硫酸氢根检测的抗干扰能力，在荧光发射光谱中分别测试了探针识别亚硫酸氢根对常见氨基酸小分子物质的抗干扰性能力。配制pH为7.4、浓度为10 mM的HEPES缓冲溶液，并用乙腈配制浓度为1 mM的探针B1乙腈溶液。由附图5可知，在其他常见氨基酸小分子物质存在时加入亚硫酸氢根与单独加入亚硫酸氢根时所得到的荧光发射强度(630 nm)基本相同，该结果表明探针B1对亚硫酸氢根的检测具有较强的抗干扰能力。

最低检出限实验：

良好的检出限是检验一个探针分子是否具有应用价值的标准之一。配制pH为7.4、浓度为10 mM的HEPES缓冲溶液，并用乙腈配制浓度为1 mM的探针B1乙腈溶液。固定探针B1浓度为10 µM，测定其对不同浓度的亚硫酸氢根的荧光发射响应强度，随着亚硫酸氢根浓度的增加，体系荧光发射强度在630 nm处不断降低（附图6），研究发现溶液荧光发射强度在亚硫酸氢根浓度为0-0.8 µM间呈线性（R² = 0.98，附图7），经计算(3σ/k)得出该探针分子对亚硫酸氢根的最低检出限为39 nM。

酸碱度（pH）对探针识别能力的影响

为了检验探针是否可以在不同的酸碱度（pH）条件下识别亚硫酸氢根，探讨探针在实际样品中的应用，运用荧光光谱仪考察了探针B1在不同酸碱度（pH）对其识别亚硫酸氢根的影响。分别配制pH为4，5，6，7，8，9浓度为10 mM的HEPES缓冲溶液，并用乙腈配制浓度为1 mM的探针B1溶液。在HEPES -CH₃CN (6:4, v/v)溶液体系中，改变缓冲体系的pH值（4-9），单独探针(10 μL)的荧光发射强度(630 nm)变化不大，但是当加入10当量的亚硫酸氢根的条件下，体系荧光发射强度(630 nm)在pH为4-9间具有较明显的淬灭（附图8），该结果表明探针B1可以应用于生理条件下识别检测亚硫酸氢根。

动力学实验

良好的识别速度是考察探针的重要指标之一。采用荧光光谱仪考察了探针对亚硫酸氢根的动力学实验。在CH₃CN-HEPES（v/v＝6:4, v/v, pH＝7.4）缓冲溶液中，固定探针B1浓度为10 µM，在550 nm处激发条件下，测定单独探针和探针加亚硫酸氢根的荧光发射（630 nm）随时间的变化。如附图9所示，单独探针随时间的增长荧光强度并未有太大的波动；当加入亚硫酸氢根后，溶液体系荧光发射强度瞬间降低，并在30 s时达到响应平台。以上结果表明，探针对亚硫酸氢根的识别响应快速灵敏，达到了实时检测的效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。