黄烷衍生物及其制备和应用
阅读说明：本技术 黄烷衍生物及其制备和应用 (Flavane derivative and preparation and application thereof ) 是由 宋少江 刘庆博 史绍春 王雨奚 侯子琳 姚国栋 黄肖霄 于 2020-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明属于药物化学领域,涉及黄烷衍生物及其制备方法和应用,具体涉及黄烷衍生物及其制备方法和在制备抗老年性痴呆药物中的应用。本发明提供通式(I)、(II)、(III)或(IV)所示的黄烷衍生物、其立体异构体或药学上可接受的盐,其中,R-(1)-R-(6)如权利要求书和说明书所述。本发明所述的黄烷衍生物、其立体异构体或药学上可接受的盐或其药物组合物具有明显的Aβ蛋白,乙酰胆碱酯酶,丁酰胆碱酯酶抑制活性,可以用于制备抗老年性痴呆药物。(The invention belongs to the field of medicinal chemistry, relates to a flavane derivative, a preparation method and application thereof, and particularly relates to the flavane derivative, the preparation method thereof and the application thereof in preparing an anti-senile dementia medicament. The invention provides flavane derivatives represented by general formula (I), (II), (III) or (IV), stereoisomers or pharmaceutically acceptable salts thereof, wherein R 1 ‑R 6 As described in the claims and specification. The flavane derivative, the stereoisomer or the pharmaceutically acceptable salt thereof or the pharmaceutical composition thereof has obvious A beta protein, acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase inhibition activities,can be used for preparing medicine for treating senile dementia.)
技术领域
本发明属于药物化学领域，涉及黄烷衍生物及其制备方法和应用，具体涉及 黄烷衍生物及其制备方法和在制备抗老年性痴呆药物中的应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimers disease)即所谓的老年痴呆症。是一种致死性神经退行性疾病,临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退， 并有各种神经精神症状和行为障碍。
截至目前为止，阿尔兹海默病的发病机制尚没有统一的定论。随着阿尔兹海 默病的患者越来越年轻化，以及人们对生活质量的追求越来越高，阿尔兹海默病 已成为了继肿瘤之后威胁人类健康的第二大疾病。其次，阿尔兹海默病的病理主 要以神经炎性斑、神经元死亡以及神经原纤维缠结为主要的特征，属于一种慢性 进行性的中枢神经系统退行性的病变。目前为止，阿尔兹海默病的主要发病人群 为60岁以上的老年人，病患在患病的初期会出现记忆方面的障碍，主要特征为 对近期发生过的事情容易忘记以及记忆力受到损害随着病患病情的不断加重，病 患会出现失语、行为障碍、认知障碍以及失忆等现象，并且在情绪和行为上会出 现焦虑淡漠以及攻击的行为。
阿尔茨海默病主要临床表现为脑细胞的广泛死亡，特别是基底节区的脑细 胞。正常情况下,基底节区发出的纤维投射到大脑与记忆和认知有关的皮质，它 释放乙酰胆碱。短期记忆的形成必须有乙酰胆碱的参与,患者与正常人相比乙酰 胆碱转移酶的含量比正常人减少90％。
目前在临床上对于阿尔兹海默病的相关发病机制研究主要有以下几种说法， 分别为胆碱能学说、tau蛋白假说、神经血管学说、氧化应激学说以及β-淀粉 样蛋白瀑布学说等。虽然目前医学界对AD的发病机制以及治疗方法仍存在诸多 争议，其中研究相对较为成熟的为乙酰胆碱酯酶抑制剂。乙酰胆碱是一种重要的 神经递质，与人体记忆的形成以及储存跟胆碱能的系统有着密切的联系。对各种 因素所导致的胆碱能神经元的损伤，以及有关的皮层海马等部位的胆碱能神经传 递受到损伤所导致的一系列阿尔兹海默病临床现象的发生，起到重要的影响作 用。
我国传统药用植物资源十分丰富，其生理活性物质是研究和发现新药的先导 化合物，是开发新药的天然宝库，从天然产物中提取活性物质，开发成安全性好. 毒性低的新药具有重要应用价值和广阔发展前景。黄烷是猴耳环中药材的有效大 量成分之一，含量约为0.1％,其结构式如下。有大量文献报道黄烷类化合物具有 显著的抗氧化和自由基清除活性，近些年来有大量文献报道，基于黄酮骨架为母 核，基于活性片段组合的原理，设计合成了一系列具有显著抑制乙酰胆碱酯酶、 丁酰胆碱酯酶、单胺氧化酶等神经保护活性的衍生物，它不同于目前已知的胆碱 脂酶抑制剂或M受体的激动剂、拮抗剂，虽然这些衍生物的单一靶点治疗活性 都很有限，但其作用广泛，是多功能阿尔兹海默病靶点抑制剂。
发明内容
本发明的目的在于提供系列黄烷衍生物。
本发明是通过如下技术方案实现的:
黄烷衍生物结构通式如下:
本发明提供通式(I)、(II)、(III)或(IV)所示的黄烷衍生物、其立体异构 体或药学上可接受的盐：
式I中，R1、R2独立地为H、OH、卤素、硝基、氨基、氰基、C1-8烷氧基、 C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧基、未取代或取代的苄基或C1-8烷酰基、苯甲酰基或联苯酰基、或R1与R2一起形成5-6元杂环；
式II中，R3为H、卤素、硝基、卤代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷氧基、取代 或未取代的苯基、苄基或萘环，所述取代基为卤素、硝基、氨基、氰基、C1-C6烷基、C1-6烷氧基；
式III中，R4、R5为H、卤素、硝基、氨基、氰基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷 基；
式IV中，R6为H、卤素、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基，C1-C6烷基、C1-6烷氧基、取代或未取代的5-10元芳基、R7，R8为卤素、C1-C6烷基、卤 代C1-C6烷基；
进一步地，本发明优选如下结构的黄烷衍生物、其立体异构体或药学上可接 受的盐：
式I中，R1、R2独立地为H、OH、卤素、硝基、氨基、氰基、C1-C4烷氧基、 C1-C4烷基、卤代C1-C4烷基、卤代C1-C4烷氧基；
或R1与R2一起形成二氧亚甲基；
式II中，R3为H、卤素、硝基、卤代卤代C1-C4烷基、卤代C1-C4烷氧基；
式III中，R4、R5为H、卤素、硝基、氨基、氰基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷 基；
式IV中，R6为C1-C6烷基、C1-6烷氧基、R7、R8为H、卤素、C1-C4烷基、卤代C1-C4烷基。
进一步地，本发明优选如下的黄烷衍生物、其立体异构体或药学上可接受的 盐：
本发明还提供了所述的黄烷衍生物或其药学上可接受的盐的制备方法。
所述的方法包括如下步骤：
(1)将黄烷母核、碳酸钾、硫酸二甲酯加入到干燥的丙酮，加热60℃回流 下反应。反应完毕，加氨水，搅拌，乙酸乙酯萃取，上硅胶柱，石油醚冲杂质， 石油醚:乙酸乙酯(5:1)冲洗得中间体1；
(2)将上步得到的中间体1(GTF-1)，10％NaOH溶液，加入到THF中，室 温下反应。反应完毕，滴入2.0mol/l的盐酸调制PH＝5-6，乙酸乙酯萃取，上硅 胶柱,石油醚洗脱除去杂质，石油醚:乙酸乙酯(2:1)冲洗得中间体2；
(3)将(2)中获得的中间体2(GTF-2)，苯环上含各种取代基的肉桂酸， EDCI，DMAP加入到CH2Cl2中，室温下反应。反应完毕，乙酸乙酯萃取，减压浓 缩，微孔滤膜过滤，高效液相色谱分离，获得式I类化合物；
(4)将(2)中获得的中间体2(GTF-2)，苯环上含各种取代基的苯甲酸， EDCI，DMAP加入到CH2Cl2中，室温下反应。反应完毕，乙酸乙酯萃取，减压浓 缩，微孔滤膜过滤，高效液相色谱分离，获得式II类化合物；
(5)将(2)中获得的中间体2(GTF-2)，碳酸钾，苯环上含各种取代基的 苯磺酰氯，加入到干燥的丙酮中，60℃回流反应。反应完毕，乙酸乙酯萃取，减 压浓缩，微孔滤膜过滤，高效液相色谱分离，获得式III类化合物；
(6)将(2)中获得的中间体2(GTF-2)，碳酸钾，溴丙炔，加入到干燥的 丙酮中，60℃回流反应。上硅胶柱，石油醚冲杂质，石油醚:乙酸乙酯(2:1)冲 洗得关键中间体3(GTF-3)；
(7)将(6)中获得的中间体3(GTF-3)，抗坏血酸钠,五水硫酸铜，烷基 溴加入到乙腈与水体积比为1：1的溶液中，室温下反应。反应完毕，乙酸乙酯 萃取，减压浓缩，微孔滤膜过滤，高效液相色谱分离，获得式IV类化合物。
本发明提供了一种药物组合物，包含所述的黄烷衍生物、其立体异构体或药 学上可接受的盐和药学上可接受的赋形剂。
本发明所述的黄烷衍生物、其立体异构体或药学上可接受的盐或其药物组合 物具有明显的Aβ蛋白，乙酰胆碱酯酶，丁酰胆碱酯酶抑制活性，可以用于制备 抗老年性痴呆药物。
附图说明
图1为乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶测试结果；
A：化合物A15与乙酰胆碱酯酶的动力学作用图；B：乙酰胆碱酯酶动力学 曲线斜率与底物浓度关系图；C：化合物C4与丁酰胆碱酯酶的动力学作用图； D：丁酰胆碱酯酶动力学曲线斜率与底物浓度关系图。
图2为双氧水诱导的SY5Y神经细胞保护活性测试以及对正常的SY5Y神经 细胞的细胞毒性测试结果；
A：化合物A15和C4对SY5Y神经细胞的细胞毒活性结果；B：化合物A15 和C4对双氧水诱导的SY5Y神经细胞的保护活性结果。
具体实施方式
实施例1黄烷关键中间体1的制备
(1)50ml茄型瓶加入黄烷母核(GTF)(2g,2.30mmol),碳酸钾(6.24g,46.0 mmol),硫酸二甲酯(6.24g,46.0mmol),干燥的丙酮25ml,60℃加热回流下反应 10h。反应完毕，加氨水，搅拌，乙酸乙酯萃取三次，上硅胶柱,石油醚冲杂质， 石油醚:乙酸乙酯(5:1)冲洗得关键中间体1,结构鉴定数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.44(s,2H,2”,6”-H),6.65(s,2H,2'，6'-H),6.45 (d,J＝2.11Hz,1H,6-H),6.32(d,J＝2.11Hz,1H,8-H),4.94(dd,J＝10.58,1.67Hz, 1H，2-H),3.94(s,9H,3”，4”，5”-OCH3),3.88(s,6H,3'，5'-OCH3),3.85(s,3H, 4'-OCH3),3.83(s,3H,5-OCH3),2.86(m,1H,4-H),2.70(m,1H，4-H),2.23(m,1H， 3-H),2.02(m,1H,3-H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ165.1,158.4,156.2,153.5 (2C),153.1(2C),150.3,143.0,137.8,137.3,108.7,107.4,103.3(2C),97.2,78.2, 61.1,61.0,56.5(2C)，56.3(2C),55.8，29.1,19.7.HR-ESI-MS:563.1888[M+Na]+, (calcd for C29H32O10Na,563.1891).
实施例2黄烷关键中间体2的制备
(2)50ml茄型瓶加入中间体1(GTF-1)(1.5g,4.40mmol),THF 20ml，10％ NaOH水溶液10ml，室温下反应10h。反应完毕，滴入2.0mol/l的盐酸调制 PH＝5-6，乙酸乙酯萃取三次，上硅胶柱，石油醚洗脱除去杂质，石油醚:乙 酸乙酯(2:1)冲洗得关键中间体2，结构鉴定数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ6.64(s,2H,2',6'-H),6.06(d,J＝2.28Hz,1H, 6-H),6.04(d,J＝2.29Hz,1H,8-H),4.88(dd,J＝10.59,1.99Hz,1H,2-H),3.87(s, 6H,3',5'-OCH3),3.85(s,3H,4'-OCH3),3.79(s,3H,5-OCH3),2.77(ddd,J＝16.71, 5.70,2.57Hz,1H,4-H),2.62(ddd,J＝16.83,10.12,6.25Hz,1H,4-H),2.18(m,1H, 3-H),1.98(m,1H,3-H).13CNMR(150MHz,CDCl3):δ159.2,156.7,155.7,153.8 (2C),138.0,137.8,103.8,103.7,96.5,92.0,78.5,61.3,56.6(2C),56.0,30.2,19.9. HR-ESI-MS:369.1309[M+Na]+,(calcd forC19H22O6Na,369.1321).
实施例3黄烷苯甲酸酯类衍生物的制备：
(1)10ml茄型瓶加入中间体2(GTF-2)(10mg,27.5μmol)，4-硝基苯甲酸(9.2 mg，55.0μmol),EDCI(10.54mg,55.0μmol),DMAP(3.4mg,27.5μmol),CH2Cl26 ml，室温下反应8h。反应完毕，乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩，微孔滤膜过滤， 高效液相色谱分离，RP-HPLC(MeCN-H2O,65:35,3.0ml/min,tR＝25min)。
4”-硝基苯甲酸酯衍生物结构鉴定数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ8.36(m,4H,2”,3”,5”,6”-H),6.65(s,2H,2',6'-H),6.48(d,J＝2.17Hz,1H,8-H),6.33(d,J＝2.17Hz,1H,6-H),4.94(dd,J＝10.69, 1.85Hz,1H,2-H),3.88(s,6H,3',5'-OCH3),3.85(s,3H,4'-OCH3),3.84(s,3H, 5-OCH3),2.86(m,1H,4-H),2.70(m,1H,4-H),2.23(m,1H,3-H),2.03(m,1H,3-H). 13C NMR(150MHz,CDCl3):δ163.6,158.6,156.3,153.5(2C),151.0,150.5,149.8, 137.7,137.1,135.1,131.4(2C),123.8,109.3,103.2(2C),103.1,96.6,78.2,61.0, 56.3(2C),55.8,29.6,19.9.HR-ESI-MS:518.1462[M+Na]+,(calcd for C26H25NO9Na, 518.1422).HPLC purity:97.76％,retention time:9.46min.
4”-氟苯甲酸酯衍生物结构鉴定数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ8.21(dd,J＝8.8,5.4Hz,2H,2”,6”-H),7.18(t,J ＝8.6Hz,2H,3”,5”-H),6.65(s,2H,2',6'-H),6.46(d,J＝2.0Hz,1H,8-H),6.32(d,J ＝2.0Hz,1H,6-H),4.94(m,1H,2-H),3.88(s,6H,3',5'-OCH3),3.85(s,3H, 4'-OCH3),3.83(s,3H,5-OCH3),2.85(m,1H,4-H),2.69(m,1H,4-H),2.23(m,1H, 3-H),2.02(m,1H,3-H).13CNMR(150MHz,CDCl3):δ164.3,158.5,156.3,153.5 (2C),150.0,137.7,137.2,135.2(q,JC-F＝32.2Hz),130.7(2C),125.8(q,JC-F＝3.6 Hz),125.7,123.7(q,JC-F＝272.7Hz),109.1,103.2(2C),96.7,78.2,70.0,56.3(2C), 55.8,29.6,20.0.HR-ESI-MS:491.1481[M+Na]+,(calcd for C26H25FO7Na,491.1477). HPLC purity:95.38％.
4”-三氟甲基苯甲酸酯衍生物结构鉴定数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ8.31(d,J＝8.1Hz,2H,2”,6”-H),7.78(d,J＝8.2 Hz,2H,3”,5”-H),6.65(s,2H,2',6'-H),6.47(d,J＝1.9Hz,1H,8-H),6.33(d,J＝1.9 Hz,1H,6-H),4.94(m,1H,2-H),3.88(s,6H,3',5'-OCH3),3.85(s,3H,4'-OCH3), 3.84(s,3H,5-OCH3),2.86(dd,J＝17.1,3.1Hz,1H,4-H),2.70(m,1H,4-H),2.23 (m,1H,3-H),2.03(m,1H,3-H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ164.3,158.5,156.3, 153.5(2C),150.0,137.7,137.2,135.2(q,JC-F＝32.2Hz),130.7(2C),125.8(q,JC-F＝ 3.6Hz),125.7,123.7(q,JC-F＝272.7Hz),109.1,103.2(2C),96.7,78.2,70.0,56.3 (2C),55.8,29.6,20.0.HR-ESI-MS:541.1449[M+Na]+,(calcd for C27H25F3O7, 541.1445).HPLC purity:96.53％.
实施例4黄烷肉桂酸酯类衍生物的制备：
(1)10ml茄型瓶加入中间体2(GTF-2)(10mg,27.5μmol)，4-三氟甲基肉桂 酸(11.0mg，55.0μmol)，EDCI(11.54mg,55.0μmol)，DMAP(3.4mg,27.5μmol))， CH2Cl26 ml，室温下反应8h。反应完毕，乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩，微孔 滤膜过滤，高效液相色谱分离，RP-HPLC(MeCN-H2O,65:35,3.0ml/min,tR＝38 min)。
4”-三氟甲基肉桂酸酯衍生物结构鉴定数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3)：δ7.87(d,J＝16.02Hz,1H,7”-H),7.68(m,4H, 2”,3”,5”,6”-H),6.69(d,J＝16.02Hz,1H,8”-H),6.65(s,2H,2',6'-H),6.43(d,J＝2.15 Hz,1H,8-H),6.29(d,J＝2.15Hz,1H,6-H),4.92(dd,J＝10.71,1.88Hz,1H,2-H), 3.88(s,6H,3',5'-OCH3),3.85(s,3H,4'-OCH3),3.83(s,3H,5-OCH3),2.85(m,1H, 4-H),2.68(m,1H,4-H),2.22(m,1H,3-H),2.02(m,1H,3-H).13C NMR(150MHz, CDCl3):δ165.1,158.4,156.2,153.5(2C),150.0,144.7,137.7,137.2,132.4(q,JC-F＝ 32.86Hz),128.5,126.1(2C,q,JC-F＝3.61Hz),108.8,103.2(2C),96.8,78.2,56.3 (2C),55.8,29.6,19.9.HR-ESI-MS:567.1636[M+Na]+,(calcd for C29H27F3O7Na, 567.1601)，HPLC purity:95.13％,retention time:11.97min.
4”-氟肉桂酸酯衍生物结构鉴定数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.82(d,J＝16.0Hz,1H,7”-H),7.59(d,J＝5.5 Hz,1H,6”-H),7.58(d,J＝5.4Hz,1H,2”-H),7.11(m,2H,3”-H),6.65(s,2H,2', 6'-H),6.54(d,J＝16.0Hz,1H,8”-H),6.42(d,J＝2.0Hz,1H,8-H),6.28(d,J＝2.0 Hz,1H,6-H),4.92(dd,J＝10.6,1.4Hz,1H,2-H),3.88(s,6H,3',5'-OCH3),3.85(s, 3H,4'-OCH3),3.82(s,3H,5-OCH3),2.85(dd,J＝17.1,3.2Hz,1H,4-H),2.67(m, 1H,4-H),2.02(m,2H,3-H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ165.6,163.5,158.4, 156.2,153.5(2C),150.1,145.4,137.7,137.3,130.4,130.3(2C),117.2,103.2(2C), 96.9,78.2,70.0,56.3(2C),55.8,29.7,20.0.HR-ESI-MS:517.1636[M+Na]+,(calcd for C28H27FO7Na,517.1633).HPLC purity:95.77％.
3”-三氟甲基肉桂酸酯衍生物结构鉴定数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.87(d,J＝16.1Hz,1H,7”-H),7.82(d,J＝7.7Hz, 1H,6”-H),7.76(d,J＝7.9Hz,1H,2”-H),7.68(d,J＝7.7Hz,1H,4”-H),7.56(d,J＝ 7.8Hz,1H,5”-H),6.69(d,J＝16.0Hz,1H,8”-H),6.65(s,2H,2',6'-H),6.43(d,J＝ 2.1Hz,1H,8-H),6.29(d,J＝2.1Hz,1H,6-H),4.93(dd,J＝10.6,1.5Hz,1H,2-H), 3.88(s,6H,3',5'-OCH3),3.85(s,3H,4'-OCH3),3.83(s,3H,5-OCH3),2.85(dd,J＝ 17.3,3.3Hz,1H,4-H),2.69(m,1H,4-H),2.02(m,2H,3-H).13C NMR(150MHz, CDCl3):δ165.2,158.5,156.2,153.5(2C),150.0,144.8,137.7,135.1,131.4,129.7 (2C),127.2,125.0,119.5,108.9,103.2(2C),96.8,78.2,70.0,56.3(2C),55.8,29.7, 20.0.HR-ESI-MS:567.1601[M+Na]+,(calcd forC29H27F3O7Na,567.1598).HPLC purity:95.17％.
3”,4”-二氧亚甲基肉桂酸酯衍生物结构鉴定数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.76(d,J＝15.9Hz,1H,7”-H),7.06(m,2H,2”, 6”-H),6.84(d,J＝8.0Hz,1H,5”-H),6.65(s,2H,2',6'-H),6.43(d,J＝15.9Hz,1H, 8”-H),6.41(d,J＝2.1Hz,1H,8-H),6.28(d,J＝2.1Hz,1H,6-H),6.02(s,2H, 10”-CH2),4.92(dd,J＝10.7,1.8Hz,1H,2-H),3.88(s,6H,3',5'-OCH3),3.85(s,3H, 4'-OCH3),3.82(s,3H,5-OCH3),2.84(m,1H,4-H),2.68(m,1H,4-H),2.02(m,1H, 3-H),2.01(m,1H,3-H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ165.9,158.4,156.1,153.5 (2C),150.2,150.1,148.6,146.4,137.6,137.3,128.7,125.02,115.2,108.8,108.6, 103.3,103.2,101.8,96.9,78.1,61.0,56.3(2C),55.8,29.7,19.9.HR-ESI-MS: 543.1655[M+Na]+,(calcd for C29H28O9Na,543.1626).HPLC purity:95.06％.
4”-N,N-二甲基肉桂酸酯衍生物结构鉴定数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.79(d,J＝15.8Hz,1H,7”-H),7.47(d,J＝8.9 Hz,2H,2”,6”-H),6.69(d,J＝8.9Hz,2H,3”,5”-H),6.65(s,2H,2',6'-H),6.42(d,J ＝2.1Hz,1H,8-H),6.38(d,J＝15.8Hz,1H,8”-H),6.28(d,J＝2.1Hz,1H,6-H), 4.92(dd,J＝10.7,1.8Hz,1H,2-H),3.88(s,6H,3',5'-OCH3),3.85(s,3H,4'-OCH3), 3.81(s,3H,5-OCH3),2.84(m,1H,4-H),2.67(m,1H,4-H),2.21(m,1H,3-H),2.01 (m,1H,3-H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ166.6,158.3,156.1,153.4(2C),152.1, 150.5,147.3,137.6,137.4,130.2(2C),125.1,111.9,108.4,103.4,103.2(2C),101.8, 97.2,78.1,60.1,56.3(2C),55.7,29.7,19.9.HR-ESI-MS:520.2300[M+H]+,(calcd for C30H34NO7,520.2330).HPLC purity:95.08％.
实施例5黄烷磺酸酯类衍生物的制备：
(1)10ml茄型瓶加入中间体2(GTF-2)(10mg,27.5μmol)，碳酸钾(8.0mg,50 μmol)，苯磺酰氯(9.0mg，50μmol)，干燥的丙酮6ml，60℃回流反应8h。 反应完毕，乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩，微孔滤膜过滤，高效液相色谱分离， RP-HPLC(MeCN-H2O,65:35,3.0ml/min,tR＝38min)。
苯磺酸酯类衍生物结构鉴定数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.90(m,2H,3”,7”-H),7.67(t,J＝7.48Hz,1H, 5”-H),7.54(t,J＝7.77Hz,2H,4”,6”-H),6.59(s,2H,2',6'-H),6.22(d,J＝2.16Hz, 1H,8-H),6.11(d,J＝2.17Hz,1H,6-H),4.86(dd,J＝10.50,1.73Hz,1H,2-H),3.87 (s,6H,3',5'-OCH3),3.84(s,3H,4'-OCH3),3.69(s,3H,5-OCH3),2.77(m,1H,4-H), 2.62(m,1H,3-H),2.18(m,1H,3-H),1.97(m,1H,3-H).13C NMR(150MHz, CDCl3):δ158.3,156.0,153.5(2C),148.8,137.8,136.9,135.9,134.3,129.3,128.6, 110.1,103.8,103.2(2C),97.5,78.2,61.0,56.3(2C),55.8,29.3,19.8.HR-ESI-MS: 509.1242[M+Na]+,(calcd for C25H26O8SNa,509.1241).HPLC purity:95.19％, retention time:6.02min.
4”-硝基苯磺酸酯衍生物结构鉴定数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ8.38(d,J＝8.8Hz,2H,3”,5”-H),8.09(d,J＝8.9 Hz,2H,2”,6”-H),6.58(s,2H,2',6'-H),6.21(d,J＝2.2Hz,1H,8-H),6.15(d,J＝2.2 Hz,1H,6-H),4.85(dd,J＝10.7,1.9Hz,1H,2-H),3.86(s,6H,3',5'-OCH3),3.84(s, 3H,4'-OCH3),3.75(s,3H,5-OCH3),2.80(ddd,J＝17.3,5.5,2.3Hz,1H,4-H),2.64 (m,1H,4-H),2.19(m,1H,3-H),1.97(m,1H,3-H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ 158.6,156.2,153.6(2C),151.1,148.4，141.4,138.0,136.6,130.0(2C),124.5,110.6, 103.4,103.3,97.2,78.4,70.0,56.3(2C),55.9,29.2,19.8.HR-ESI-MS:554.1096 [M+Na]+,(calcd for C25H25NO10SNa,554.1091).HPLC purity:96.96％.
4”-氰基苯磺酸酯衍生物结构鉴定数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ8.01(d,J＝8.5Hz,2H,3”,5”-H),7.84(d,J＝ 8.5Hz,2H,2”,6”-H),6.59(s,2H,2',6'-H),6.17(d,J＝2.3Hz,1H,8-H),6.16(d,J＝ 2.2Hz,1H,6-H),4.85(dd,J＝10.7,1.9Hz,1H,2-H),3.86(s,6H,3',5'-OCH3),3.84 (s,3H,4'-OCH3),3.74(s,3H,5-OCH3),2.79(ddd,J＝17.2,5.5,2.4Hz,1H,4-H), 2.63(m,1H,4-H),2.19(m,1H,3-H),1.98(m,1H,3-H).13C NMR(150MHz, CDCl3):δ158.5,156.2,153.5(2C),148.4,139.9,137.9,136.6,129.3,118.0,117.0, 110.6,103.3(2C),97.2,78.4,70.0,56.3(2C),55.9,29.1,19.8.HR-ESI-MS: 534.1194[M+Na]+,(calcd for C25H25NO10SNa 534.1193).HPLCpurity:95.12％.
2”,4”-二氟苯磺酸酯衍生物结构鉴定数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.87(dd,J＝14.3,8.1Hz,1H,3”-H),7.02(m,2H, 5”,6”-H),6.59(s,2H,2',6'-H),6.31(d,J＝1.9Hz,1H,8-H),6.29(d,J＝1.9Hz,1H, 6-H),4.86(d,J＝9.4Hz,1H,2-H),3.87(s,6H,3',5'-OCH3),3.84(s,3H,4'-OCH3), 3.77(s,3H,5-OCH3),2.78(m,1H,4-H),2.62(m,1H,4-H),1.98(m,1H,3-H),1.97 (m,1H,3-H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ167.0(dd,JC-F＝259.9,11.2Hz),160.5 (dd,JC-F＝262.9,13.0Hz),158.5,156.1,153.5(2C),148.4,137.8,136.7,133.4(d, JC-F＝10.80Hz)120.5(dd,J＝14.0,3.8Hz),112.3(dd,JC-F＝22.1,3.7Hz),110.4, 106.2(t,JC-F＝24.0Hz),103.3,103.2,97.2,70.0,56.3(2C),55.9,29.6,19.8. HR-ESI-MS:545.1054[M+Na]+,(calcd forC25H24F2O8SNa,545.1052).HPLC purity: 95.22％.
实施例6黄烷三氮唑类衍生物的制备：
(1)50ml茄型瓶加入中间体2(GTF-2)(1.0g,2.75mmol)，碳酸钾(690.0mg,5.5mmol)，溴丙炔(654.5mg，5.5mmol)，干燥的丙酮20ml，60℃回流反应8h。 上硅胶柱，石油醚冲杂质，石油醚:乙酸乙酯(2:1)冲洗得关键中间体3，结构鉴定 数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ6.65(s,2H,2',6'-H),6.21(d,J＝2.28Hz,1H,8-H),6.21(d,J＝2.27Hz,1H,6-H),4.89(dd,J＝10.70,1.80Hz,1H,2-H),4.64(d,J＝ 2.35Hz,2H,1”-CH2),3.88(s,6H,3',5'-OCH3),3.85(s,3H,4'-OCH3),3.80(s,3H, 5-OCH3),2.79(ddd,J＝16.74,5.59,2.32Hz,1H,4-H),2.64(m,1H,4-H),2.51(t,J ＝2.35Hz,1H,3”-H),2.19(m,1H,3-H),2.00(m,1H,3-H).HR-ESI-MS:407.1469 [M+H]+,(calcd for C22H24O6,407.1465).
(2)50ml茄形瓶中加入中间体3(GTF-3)(18mg,47.0μmol)，溶解在乙腈与 水体积比为1:1的混合溶液中(6ml)，再加入抗坏血酸钠(9.2mg,47.0μmol), 五水硫酸铜(11.8mg,47.0μmol)，最后加入烷基溴(190.0μmol)。回流反应6h，反 应完毕，乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩，微孔滤膜过滤，高效液相色谱分离， RP-HPLC(MeCN-H2O,65:35,3.0ml/min,tR＝38min)。
4”-三氟甲基-1,2,3-三氮唑衍生物结构鉴定数据如下：
1HNMR(600MHz,CDCl3)：δ7.63(s,1H,3”-H),6.65(s,2H,2',6'-H),6.24(d, J＝2.27Hz,1H,8-H),6.17(d,J＝2.27Hz,1H,H-6),5.16(s,2H,6”-CH2),4.89(dd, J＝10.62,1.51Hz,1H,2-H),4.38(t,J＝6.54Hz,2H,4”-CH2),3.88(s,6H, 3',5'-OCH3),3.85(s,3H,4'-OCH3),3.79(s,3H,5-OCH3),2.79(ddd,J＝16.64,5.50, 2.19Hz,1H,4-H),2.64(m,1H,4-H),2.19(m,1H,3-H),2.01(m,1H,3-H),1.91(dt, J＝14.40,7.12Hz,2H,5”-CH2),1.37(dq,J＝14.69,7.35Hz,1H,6”-CH2),0.96(t,J＝ 7.35Hz,3H,7”-CH3).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ158.8,158.2,156.3,153.5 (2C),144.3,137.7,137.4,122.7,104.0,103.3(2),94.7,92.2,78.3,62.3,61.0,56.3 (2C),55.7,50.3,32.4,29.8,19.9,19.6,13.6.HR-ESI-MS:484.2441[M+H]+,(calcd for C26H34N3O6484.2442).HPLC purity:96.35％,retentiontime:5.70min.
4”-甲基-1,2,3-三氮唑衍生物结构鉴定数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.51(s,1H,3”-H),7.18(brs,4H,6”,7”,9”, 10”-H),6.64(s,2H,2',6'-H),6.21(d,J＝2.2Hz,1H,8-H),6.13(d,J＝2.2Hz,1H, 6-H),5.48(s,2H,4”-CH2),5.10(s,2H,1”-CH2),4.88(dd,J＝10.7,1.8Hz,1H,2-H), 3.88(s,6H,3',5'-OCH3),3.85(s,3H,4'-OCH3),3.77(s,3H,5-OCH3),2.77(ddd,J＝ 16.7,5.6,2.3Hz,1H,4-H),2.63(m,1H,4-H),2.35(s,3H,12”-H),2.18(m,1H,3-H), 2.00(m,3-H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ158.7,158.1,156.3,153.5(2C),144.6, 138.9,137.7,137.4,131.5,129.9,128.4,122.6,104.0,103.3(2C),94.6,92.2,78.3, 62.3,61.0,56.3(2C),55.6,54.2,29.8,21.3,19.6.HR-ESI-MS:532.2443[M+H]+, (calcd for C30H34N3O6,532.2442).HPLCpurity:96.73％.
2”-氯-1,2,3-三氮唑衍生物结构鉴定数据如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.65(s,1H,3”-H),7.44(d,J＝7.9Hz,1H,8”-H), 7.32(td,J＝7.7,1.5Hz,1H,7”-H),7.28(dd,J＝7.6,0.9Hz,1H,5”-H),7.21(dd,J＝ 7.59,1.1Hz,1H,6”-H),6.65(s,2H,2',6'-H),6.22(d,J＝2.1Hz,1H,8-H),6.17(d,J ＝2.1Hz,1H,6-H),5.68(s,2H,4”-CH2),5.13(s,2H,1”-CH2),4.88(dd,J＝10.6,1.4 Hz,1H,2-H),3.88(s,6H,3',5'-OCH3),3.85(s,3H,4'-OCH3),3.78(s,3H,5-OCH3), 2.78(m,1H,4-H),2.63(m,1H,4-H),2.18(m,1H,3-H),2.00(m,1H,3-H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ158.7,158.1,156.3,153.5(2C),144.6,137.7,137.4, 133.7,132.5,130.6,130.5,130.1,127.8,123.1,104.1,103.3(2C),94.7,92.2,78.3, 62.3,61.0,56.3(2C),55.7,51.6,29.8,19.7.HR-ESI-MS:552.1900[M+H]+,(calcd for C29H31ClN3O6,552.1896).HPLC purity:95.24％.
4”-丁基-1,2,3-三氮唑衍生物结构鉴定数据如下：
1HNMR(600MHz,CDCl3):δ7.63(s,1H,3”-H),6.65(s,2H,2',6'-H),6.24(d,J ＝2.3Hz,1H,8-H),6.17(d,J＝2.3Hz,1H,6-H),5.16(s,2H,6”-CH2),4.89(dd,J＝ 10.6,1.5Hz,1H,2-H),4.38(t,J＝6.5Hz,2H,4”-CH2),3.88(s,6H,3',5'-OCH3), 3.85(s,3H,4'-OCH3),3.79(s,3H,5-OCH3),2.79(ddd,J＝16.6,5.5,2.2Hz,1H, 4-H),2.64(m,1H,4-H),2.19(m,1H,3-H),2.01(m,1H,3-H),1.91(dt,J＝14.4,7.1 Hz,2H,5”-CH2),1.37(dq,J＝14.7,7.4Hz,1H,6”-CH2),0.96(t,J＝7.4Hz,3H, 7”-CH3).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ158.8,158.2,156.3,153.5(2C),144.3, 137.7,137.4,122.7,104.0,103.3(2),94.7,92.2,78.3,62.3,61.0,56.3(2C),55.7, 50.3,32.4,29.8,19.9,19.6,13.6.HR-ESI-MS:484.2441[M+H]+,(calcd for C26H34N3O6484.2442).HPLC purity:96.35％.
实施例7黄烷衍生物体外抗Aβ淀粉样蛋白聚集活性测试：
1、实验材料
β淀粉样蛋白(Aβ,Sigma公司)，六氟异丙醇(HFIP,Sigma公司)，硫磺素T (Th-T,Sigma公司)，姜黄素(Curcumin,Sigma公司)，磷酸二氢钾(KH2PO4)，氢 氧化钠(NaOH)，DMSO2、实验仪器
恒温孵育箱，Varoskan Flash酶标仪，Dragonmed手动可调式移液器，Costar 96孔透明平底板，涡旋混匀器
3实验方法
3.1 Aβ的预处理
将预先保存于-80℃冰箱中的Aβ取出，以1mg/mL的浓度溶于HFIP中。 室温下静置30min待其二级结构完全去除后，真空冷冻干燥去除HFIP，并置于 -20℃冰箱中保存。
3.2磷酸缓冲液(PBS,pH＝7.4,0.1M)制备
缓冲液的制备(PBS,buffer)：pH＝7.4，浓度为0.1mol/mL。参照中华人民 共和国药典2010年版第二部附录，取磷酸二氢钾1.36g，加0.l mol/L氢氧化钠 溶液79mL，用水稀释至200mL，用精密pH酸度计进行校正，即得。
3.3测定方法
组别设置：
(1)空白对照组：PBS 60μL,Aβ10μL,PBS+DMSO 10μL
(2)样品抑制组：PBS 60μL,Aβ10μL,药物10μL
(3)空白本底组：PBS 60μL,PBS 10μL,PBS+DMSO 10μL
(4)样品本底组：PBS 60μL,PBS 10μL,药物10μL
于96孔板分别加入上述各组溶液，置于恒温孵育箱中37℃孵育24h，然后 向各组中加入80μL Th-T溶液，置于恒温孵育箱中37℃孵育5min，用酶标仪于 (λex＝450nm；λem＝485nm)处测定各组荧光值。每组重复3次。
以Aβ单独孵育后用Th-T测定的485nm处荧光值作为对照：为了避免化合 物本身具有的荧光对结果的干扰，以扣除单独受试化合物用Th-T测定的荧光值 作为本底。
实施例8黄烷衍生物体外胆碱酯酶抑制活性测试：
1、实验材料
碘化乙酰胆碱(AchI，Sigma公司)，乙酰胆碱酯酶(AchE，Sigma公司)， 二硫二硝基苯甲酸(DTNB，Sigma公司)，磷酸二氢钾(KH2PO4)，氢氧化钠 (NaOH)，DMSO
2、实验仪器
恒温孵育箱，Varoskan Flash酶标仪，Dragonmed手动可调式移液器，Costar 96孔透明平底板，涡旋混匀器
3、实验方法
3.1酶反应试液的制备
取AChE冻干粉，用pH＝7.4的0.1mol/mLPBS将其配制成0.22U/mL的酶 溶液，-20℃冻存备用。
3.2底物和显色剂配置
分别精密称取AchI粉末0.4338g和DTNB粉末0.0793g，用pH＝7.4的0.1 mol/mLPBS，配制成为15mM的AchI工作液和2mM的DNTB工作液，4℃ 冷藏备用。
3.3测定方法
组别设置：
(1)空白对照组：PBS 40μL,PBS+DMSO 20μL,AchE20μL
(2)样品抑制组：PBS 60μL,药物20μL,AchE20μL
(3)空白本底组：PBS 60μL,PBS+DMSO 20μL,PBS 20μL
(4)样品本底组：PBS 60μL,药物20μL,PBS20μL
于96孔板分别加入上述各组溶液，置于恒温孵育箱中4℃孵育10min，然 后向各组中加入20μLAchI溶液和100μLDNTB溶液，置于恒温孵育箱中37℃ 继续孵育20min，用酶标仪于412nm处测定各组OD值。每组重复3次。
3.4结果分析：
以AChE和AchI单独孵育后用DTNB测定的412nm处OD值作为对照； 为避免化合物自身对结果的干扰，以扣除AChE用DTNB测定的OD值作为本 底。
实施例9黄烷衍生物双氧水诱导的SY5Y神经细胞保护活性测试以及对正常的SY5Y神经细胞的细胞毒性测试
1、细胞培养
神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系(购自美国模式培养物集存库ATCC, Manassas,USA)以含10％FBS的DMEM培养基(购自美国洛根海克龙Hyclone, Logan,USA)，在37℃，5％CO2的培养箱中培养，24h后细胞贴壁，弃掉旧培养 液。
2、细胞分组
空白组：不含任何药物，仅用DMEM完全培养液培养。
模型组：细胞于DMEM完全培养液培养4h后，加入1mM MPP+，继续培 养36小时。
A15组：细胞于DMEM完全培养液培养4h后，加入不同浓度(12.5μM、 25μM、50μM)的A15化合物培养1小时，再加入1mM MPP+，继续培养36 小时。
C4组：细胞于DMEM完全培养液培养4h后，加入不同浓度(12.5μM、 25μM、50μM)的C4化合物培养1小时，再加入1mM MPP+，继续培养36小 时。
3、MTT检测
3.1加入MTT溶液(0.5mg/mL)20μL孔，37℃继续孵育4h。2)弃掉废液，加 入DMSO150μL/孔，恒温振荡器上振荡10min。
3.2酶标仪(Thermo Scientific Multiskan MK3,Shanghai,China)，490nm处检测各 孔吸光度值。
4、统计学处理
所有的结果和数据在至少三个独立的实验中得到证实。所有得出的数据结果 均表示为平均值±标准差使用GraphPadPrism 7.0(加利福尼亚，美国) 软件对各组数据进行单因素方差分析，P<0.05被认为具有统计学意义。
5、实验结果
实验结果如图2所示，与空白组相比，MPP+处理的细胞存活率降低(P<0.001)。 与模型组相比，50μM的A15化合物和C4化合物对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞 损伤均有保护作用，细胞存活率分别提高了5.7％和4.1％。
表1为化合物的活性测试结果
aAβ1-42蛋白和测试化合物均为20μM。
b化合物对eeAChE和eqBuChE的IC50值。
-:未测试
表2为化合物A15和C4对双氧水诱导的SH-SY5Y细胞的保护测试结果
400μM H2O2 for 4h。
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