阅读说明：本技术 一种苯并吡喃类化合物及其制备方法与应用 (Benzopyran compound and preparation method and application thereof ) 是由 周学明 林芳霞 陈光英 杨静雨 宋鑫明 李小宝 易继凌 于 2020-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种苯并吡喃类化合物,其结构通式如下：<Image he="385" wi="566" file="DDA0002561444920000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>其中R<Sub>1</Sub>、R<Sub>2</Sub>、R<Sub>3</Sub>、R<Sub>4</Sub>、R<Sub>5</Sub>、R<Sub>6</Sub>、R<Sub>7</Sub>、R<Sub>8</Sub>、R<Sub>9</Sub>、R<Sub>10</Sub>、R<Sub>11</Sub>分别为羟基、甲氧基或氢中的一种。本发明还公开了优选化合物的制备方法和其在制备抗类风湿关节炎药物中的应用。本发明首次发现了上述苯并吡喃类化合物在抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖中的活性,可用于制备抗类风湿关节炎的药物。(The invention discloses a benzopyran compound, which has the following structural general formula: wherein R is 1 、R 2 、R 3 、R 4 、R 5 、R 6 、R 7 、R 8 、R 9 、R 10 、R 11 Respectively one of hydroxyl, methoxyl or hydrogen. The invention also discloses a preparation method of the optimized compound and application of the optimized compound in preparing a medicament for resisting rheumatoid arthritis. The invention discovers that the benzopyran compound can inhibit the proliferation of synovial cells of rheumatoid arthritis for the first timeCan be used for preparing the medicine for resisting rheumatoid arthritis.)

一种苯并吡喃类化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及植物化学技术领域，具体涉及一种苯并吡喃类化合物及其制备方法与应用。

背景技术

天堂瓜馥木(Fissistigma tientangense Tsiang et P.T.Li)，是番荔枝科(Annonaceae)瓜馥木属植物。该植物可做药用，茎、叶可以治骨折水肿，全株可以治疗风湿骨痛、手足麻木等。天堂瓜馥木中含有大量化合物，急需提取出具有显著药效的新结构化合物，充分发挥天堂瓜馥木药用价值。

发明内容

本发明旨在提供一种从天堂瓜馥木中提取分离、新结构的苯并吡喃类化合物，该化合物具有抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖的活性，可应用于制备抗类风湿关节炎药物。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种苯并吡喃类化合物，其结构通式如下：

其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁分别为羟基、甲氧基或氢中的一种，即分别独立选自为-OH或-OMe或-H。

上述结构化合物可通过有机合成获得。

进一步的，所述R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁分别为羟基或氢，羟基的数量为3个。

上述苯并吡喃类化合物，优选结构式如下：

上述优选苯并吡喃类化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备天堂瓜馥木提取物

将天堂瓜馥木干燥的茎用乙醇溶液冷浸或者热提，得到提取液，减压浓缩成膏状，即为天堂瓜馥木提取物；

(2)分离纯化

将上述天堂瓜馥木提取物用水稀释制成悬浮液后，依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩成浸膏，经柱层析、薄层层析、分子筛层析、高效液相分离得到目标化合物，该化合物为新化合物且命名为fissigense A。

进一步的，步骤(1)中，所述乙醇溶液的体积浓度为30～95％，优选70～80％，更优选75％。

进一步的，步骤(1)中，所述减压浓缩，温度为30～70℃，压力为-0.06～-0.15MPa；优选温度为40～55℃，优选压力为-0.09～-0.1MPa；更优选温度为45℃，更优选压力为-0.095MPa。

进一步的，步骤(2)中，所述柱层析的条件为：用200～300目硅胶上柱，乙酸乙酯体积百分数为30％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为洗脱剂。

进一步的，步骤(2)中，所述薄层层析条件为：以乙酸乙酯体积百分数为50％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为展开剂。

进一步的，步骤(2)中，所述分子筛层析条件为：分子筛为SephadexLH-20，以氯仿体积百分数为50％的氯仿-甲醇混合溶剂为洗脱剂。

进一步的，步骤(2)中，所述高效液相的洗脱剂为体积配比为2:3的乙腈和水。

本发明任一项所述的苯并吡喃类化合物在制备抗类风湿关节炎药物中的应用。

本发明任一项所述的苯并吡喃类化合物在制备抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖药物中的应用。其中，所述的滑膜细胞为原代大鼠滑膜细胞。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明从天堂瓜馥木中提取分离出的新结构苯并吡喃类化合物，而且本发明首次发现了苯并吡喃类化合物在抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖中的活性，可用于制备抗类风湿关节炎的药物。

附图说明

图1为本发明实施例1苯并吡喃类化合物fissigense A的氢谱图。

图2为本发明实施例1苯并吡喃类化合物fissigense A的碳谱图。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

一种苯并吡喃类化合物，其结构通式如下：

其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁分别为羟基、甲氧基或氢中的一种。优选地，所述R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁分别为羟基或氢，羟基的数量为3个。上述结构化合物可通过有机合成获得。本发明通过从天堂瓜馥木中提取分离获得以下结构的苯并吡喃类化合物：

实施例1

苯并吡喃类化合物的制备，包括如下步骤：

(1)天堂瓜馥木干燥的茎10Kg按常规用75％v/v的乙醇溶液浸提3次每次7天，得到提取液，将提取液减压浓缩成膏状，浓缩温度约为45℃、压力为-0.095MPa，得到天堂瓜馥木提取物1000g。

(2)将天堂瓜馥木提取物用蒸馏水(3L)稀释成悬浮液，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯萃取(3L×3次)，将乙酸乙酯萃取液浓缩成浸膏(约256g)，浓缩温度约为45℃、压力为-0.095MPa。将上述浸膏进行硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯混合溶剂(100:0―0:100,V/V)及乙酸乙酯-甲醇(100:0―0:100,V/V)按极性递增进行硅胶柱层析，并按每次约400mL收集馏分。通过TLC检测合并相似流分分成9个组分，即Fr.1-9。

(3)Fr.3用200～300目硅胶上柱，乙酸乙酯体积百分数为30％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为洗脱剂进行洗脱，以乙酸乙酯体积百分数为50％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为展开剂进行薄层层析，根据层析效果合并流分得到3个组分Fr.3-1,Fr.3-2以及Fr.3-3。

(4)Fr.3-2以氯仿体积百分数为50％的氯仿-甲醇混合溶剂为洗脱剂进行分子筛Sephadex LH-20柱层析除去色素后得到组分Fr.3-2-1，Fr.3-2-1用高效液相进行分析制备，洗脱剂为乙腈和水，其体积配比为2:3，得到苯并吡喃类化合物fissigense A。其氢谱图、碳谱图如图1-2所示。

表1化合物1的¹H-NMR和¹³C-NMR数据

Fissigense A：为淡黄色膏状物。紫外254nm有暗斑。旋光度为

HR-ESI-MS m/z 255.0666[M-H]^-，结合¹H-NMR和¹³C NMR可知分子式为C₁₅H₁₂O₄。根据¹H,¹³C-NMR和DEPT可知化合物中含有一个苯并吡喃骨架以及一个邻三羟基苯环。HMBC谱中苯并吡喃2号位的氢与三羟基苯环的C-1’相关说明邻三羟基苯环连在苯并吡喃的2号位。确证化合物1的结构如下图所示。

苯并吡喃类化合物fissigense A的结构鉴定结果如下：

实施例2

本实施例与实施例1区别在于，步骤(1)中，所述乙醇溶液的体积浓度为30％；步骤(1)、步骤(2)中，所述浓缩的温度约为35℃，压力为-0.15MPa。获得产物结构与实施例1相同。

实施例3

本实施例与实施例1区别在于，步骤(1)中，所述乙醇溶液的体积浓度为95％；步骤(1)、步骤(2)中，所述浓缩的温度约为65℃，压力为-0.06MPa。获得产物结构与实施例1相同。

试验例：药理活性实验

实验材料细胞：滑膜细胞(原代大鼠滑膜细胞)。

细胞培养液：原代大鼠滑膜细胞培养基。

试剂：噻唑蓝(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazoliumbromide，MTT，Sigma生产)。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒(购自碧云天公司)。甲氨蝶呤(methot rexate，MTX，上海信宜药厂有限公司)。1.4仪器：96孔细胞培养板；infinite 200Pro多功能酶标仪。

实验方法

(1)MTT法测定药物对滑膜细胞的抑制作用

取对数期的滑膜细胞接种至96孔培养板(1×10⁴个细胞/孔)，设置为空白组(不给予药物)、甲氨蝶呤组(给予1μg/mL的甲氨蝶呤)、给药组(给予10、50、100μg/mL浓度的药物-实施例1制得的Fissigense A)，培养孵育过夜后用于实验。细胞给予不同浓度的药物培养48h后，每孔加入10μL浓度为5mg/mL MTT，继续培养4h后，小心吸弃培养上清液，每孔加入100μL的DMSO溶解甲瓒结晶，室温震摇5min，完全溶解后，用酶标仪在570nm处检测光密度(OD值)。根据OD值计算细胞存活率。

(2)LDH活性检测法测药物对滑膜细胞细胞活力的影响

取对数期的滑膜细胞接种至96孔培养板(1×10⁴个细胞/孔)，设置为空白组(不给予药物)、甲氨蝶呤组(给予1μg/mL的甲氨蝶呤)、给药组(给予10、50、100μg/mL浓度的药物-实施例1制得的Fissigense A)，培养孵育过夜，各组细胞培养结束后，取细胞上清液，LDH检测试剂盒检测LDH活性。LDH的活力按照下述公式计算。

统计方法

采用SPSS 22.0统计软件分析实验数据。结果用均数±标准差

表示，用单因素方差(one-way ANOVA)分析组间差异。以P<0.05认为具有统计学差异。

实验结果

(1)MTT法测定药物对滑膜细胞的抑制作用

使用不同浓度药物培养48h后，MTT法检测细胞增殖作用结果见下表2。结果表明fissigense A对滑膜细胞具有很好的抑制作用。

表2各药物对滑膜细胞的抑制作用

注：与空白组比较，^*P﹤0.05，^**P﹤0.01。

(2)LDH活性检测法测药物对滑膜细胞细胞活力的影响

使用不同浓度药物培养48h后，LDH活性检测法检测细胞活力结果见下表3。结果显示不同浓度的药物处理后，升高了细胞培养液中LDH活性(P<0.05或P＜0.01)。

表3各药物对滑膜细胞LDH活性的作用

注：与空白组比较，^*P﹤0.05，^**P﹤0.01。

以上结果表明苯并吡喃类化合物fissigense A对滑膜细胞具有很好的抑制效果，能提高细胞培养液中LDH活性。实验表明苯并吡喃类化合物具有良好的抗类风湿关节炎药效，可以用于抗类风湿关节炎药物的制备。