阅读说明：本技术 一种荧光探针及其制备方法 (Fluorescent probe and preparation method thereof ) 是由 卞旺青 卢宇靖 龙威 何燕 张焜 张智 陈泽丰 王亚坤 陈霓平 黄艺斌 于 2020-07-03 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物医药技术领域,尤其涉及一种荧光探针及其制备方法。本发明公开了一种荧光探针,包括：式(I)所示的化合物和转铁蛋白；式(I)所示的化合物与转铁蛋白通过氨基和羧基的缩合反应进行结合。本发明提供的荧光探针优选以转铁蛋白作为转运配体,式(I)所示的化合物作为成像剂,将转铁蛋白与式(I)所示的化合物进行自组装,得到以全铁的转运蛋白作为载体偶联小分子的荧光探针,该荧光探针可以通过配体-受体的介导与血脑屏障和脑胶质瘤上过度表达的受体TFR结合,实现成像剂有效地靶向输送,从而到达脑胶质瘤组织进行荧光成像,可以对脑胶质瘤患者进行早期的精确诊断以及术后的跟踪。(The invention relates to the technical field of biological medicines, in particular to a fluorescent probe and a preparation method thereof. The invention discloses a fluorescent probe, which comprises: a compound of formula (I) and transferrin; the compound shown in the formula (I) is combined with transferrin through condensation reaction of amino and carboxyl. The fluorescent probe provided by the invention preferably takes transferrin as a transport ligand, a compound shown in a formula (I) as an imaging agent, and the transferrin and the compound shown in the formula (I) are self-assembled to obtain the fluorescent probe which takes the transport protein of total iron as a carrier and couples small molecules.)

一种荧光探针及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种荧光探针及其制备方法。

背景技术

胶质瘤是源自神经上皮的肿瘤，占颅脑肿瘤的40％～50％，是最常见的颅内恶性肿瘤，每年发病率为3～8人/10万人口，年新增发病例超14000例。年龄段10-20岁与40-50岁为发病高峰期，其治疗手段以手术治疗为主，放射治疗及化学治疗为辅，治疗效果有限。因此，为了胶质瘤患者能够得到准确、及时的治疗，需要较好的提前诊断手段以及术后跟踪方法。但由于胶质瘤主要发生在脑部的神经外胚层，位置比较特殊，大部分现有的荧光探针由于无法直接穿过血脑屏障(BBB)进入大脑，诊断的准确性受到影响。

发明内容

本发明提供了一种荧光探针及其制备方法，解决了现有的荧光探针由于无法直接穿过血脑屏障进入大脑，诊断的准确性受到影响的问题。

其具体技术方案如下：

本发明提供了一种荧光探针，包括：式(I)所示的化合物和转铁蛋白；

所述式(I)所示的化合物与所述转铁蛋白通过肽键连接；

其中，R₂选自脂肪羧酸或芳香羧酸，优选为C3～C8的直链羧酸或苯环个数为1～3的芳香羧酸，R₃为卤代C2～10的直链烷基，优选为卤代C4～C8的直链烷基。

需要说明的是，人转铁蛋白(TF)是一个由679个氨基酸残基组成的单链糖蛋白，含有19个二硫键，分子量为79KD。而且，转铁蛋白受体虽然在各类细胞中均有表达，但在肿瘤细胞和病理条件下BBB中的表达更为丰富，TFR能够介导TF通过胞吞来实现转铁蛋白从外周血液到脑组织的单向转运，从而跨过BBB。全铁的转铁蛋白(HOLO-TF)是Tf家族最重要的成员之一，含有两个铁原子，与在胶质瘤组织中过高表达的转铁蛋白受体TFR的亲和力高于无铁的TF(APO-TF)和单铁TF，因此，HOLO-TF可以作为肿瘤靶向成像和治疗的特异性配体使用。本发明提供的荧光探针优选以转铁蛋白作为转运配体，式(I)所示的化合物(有机小分子PROP)作为成像剂，将TF与PROP进行自组装，得到以全铁的转运蛋白作为载体偶联小分子的荧光探针(TPP)，该荧光探针可以通过配体-受体的介导穿过血脑屏障，能够主动靶向定位到脑部胶质瘤区域，与胶质瘤区域上的转铁蛋白受体特异性的结合，在近红外光的照射下，胶质瘤区域发出红色的荧光，从而实现对脑部胶质瘤的精准定位。本发明中，所述近红外光的波长优选为650-750nm。

全铁的转铁蛋白(HOLO-TF)是Tf家族最重要的成员之一，含有两个铁原子，与在胶质瘤组织中过高表达的转铁蛋白受体TFR的亲和力高于无铁的TF(APO-TF)和单铁TF，因此，优选以HOLO-TF可以作为肿瘤靶向成像和治疗的特异性配体使用。

本发明中，所述式(I)所示的化合物的制备方法包括以下步骤：

将式(II)所示的化合物与式(III)所示的化合物进行反应，得到式(I)所示的化合物；

其中，R₁为甲基，R₂选自脂肪羧酸或芳香羧酸，优选为C3～C6的直链羧酸或苯环个数为1～3的芳香羧酸，R₃为卤代C2～10的直链烷基，优选为卤代C4～C8的直链烷基。

本发明中，所述式(II)所示的化合物与所述式(III)所示的化合物的摩尔比为(1：1～1.2)，优选为1：1；所述反应的温度为室温，时间为18～26h，优选为24h。

本发明步骤1中式(II)所示的化合物的制备方法优选为：将4-甲基喹啉与4-溴甲基苯甲酸进行反应，得到式(II)所示的化合物；所述反应的溶剂优选为无水乙腈，所述反应优选在70℃下反应24h；

所述式(III)所示的化合物的制备方法优选为：将2-甲基硫苯并噻唑与1，4-二溴丁烷在催化剂下进行反应，得到式(III)所示的化合物；所述催化剂优选为三乙胺，所述反应的溶剂优选为DMF，所述反应优选在室温下反应12h。

本发明中，所述室温为25±5℃。

本发明还提供了一种荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：将式(I)所示的化合物与转铁蛋白进行偶联反应，得到荧光探针；

其中，R₂选自脂肪羧酸或芳香羧酸，优选为C3～C6的直链羧酸或苯环个数为1～3的芳香羧酸，R₃为卤代C2～10的直链烷基，优选为卤代C4～C8的直链烷基。

本发明中，所述式(I)所示的化合物与所述转铁蛋白的质量比为(1：10)～(6：10)，优选为3：10。

本发明中，所述偶联反应的温度为4℃，时间为36h～54h，优选在4℃下反应48h；

所述偶联反应之后，还包括：将所述偶联反应得到的产物进行透析，以除去游离的小分子，得到荧光探针；

所述透析的时间为24h～48h，优选为36h。

从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：

本发明提供了一种荧光探针，包括：式(I)所示的化合物和转铁蛋白；式(I)所示的化合物与转铁蛋白通过分子间氢与疏水作用进行结合。

本发明提供的荧光探针优选以转铁蛋白作为转运配体，式(I)所示的化合物作为成像剂，将转铁蛋白与式(I)所示的化合物进行自组装，得到以全铁的转运蛋白作为载体偶联小分子的荧光探针，该荧光探针可以通过配体-受体的介导穿过血脑屏障，实现成像剂有效地靶向输送，从而到达胶质瘤组织进行荧光成像，从而到达胶质瘤区域上的转铁蛋白受体特异性的结合，在近红外光的照射下，胶质瘤区域发出红色的荧光，从而实现对脑部胶质瘤的精准定位，可以对胶质瘤进行早期的精确诊断以及术后的跟踪。由于转铁蛋白的内源性，使得该荧光探针的生物相容性和生物降解性良好；由于PROP的吸收在近红外区域，相比于X射线、紫外光等，近红外有着更好的组织穿透能力，使得该荧光探针的穿透组织的深度可观；该荧光探针的低毒性可将对机体的危害降到最小，从而确保了在进行检测时无需担心对身体有任何副作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例1中化合物3的核磁共振氢谱图；

图2为本发明实施例1中化合物5的核磁共振氢谱图；

图3为本发明实施例1中化合物6的核磁共振氢谱图

图4为本发明实施例1中化合物6的核磁共振质谱图；

图5为本发明实施例3中MTT法测定的PROP和TPP孵育U87细胞后的细胞存活率的结果图；

图6为本发明实施例4中U87细胞的激光共聚焦细胞成像图，其中，(a)为TPP的荧光探针成像图，(b)DAPI的细胞染色，(c)Merge，(d)TPP的明场细胞图。

具体实施方式

本发明实施例提供了一种荧光探针及其制备方法，用于解决现有的荧光探针由于无法直接穿过血脑屏障进入大脑，诊断的准确性受到影响的问题。

为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中神经胶质瘤细胞U87细胞由广东工业大学生物医药学院提供。

本发明实施例中使用的其它原料及试剂均为市购。

实施例1

本实施例为式(I)化合物(PROP，化合物6)的制备：

(1)准确称量0.143g的化合物1与0.214g的化合物2混合，加入10ml的无水乙腈作溶剂，在70℃下反应24h得到化合物3(式II化合物)。

(2)称量0.181g化合物4和0.202g1，3-二溴丁烷,混合后加入10ml的无水DMF做反应溶剂，200ul的三乙胺做催化剂，在室温下反应12h得到化合物5(式III化合物)。

(3)称取0.303g的化合物5和0.358g的化合物3混合，加入200ul的三乙胺做溶剂，在室温下搅拌24个小时得到化合物6(式I化合物)。

由图1～4的核磁共振氢谱和核磁共振质谱测定结果可知，本实施例成功制得化合物3、化合物5、化合物6。

实施例2

本实施例为荧光探针(TPP)的合成

1、通过EDC/NHS技术将3mg转铁蛋白与0.9mg小分子PROP在4℃下进行偶联反应，反应时间为48h，然后，用透析袋透析36h以便除去游离的小分子，收集透析袋中的样品即为反应得到的TPP，储存在4℃冰箱中备用，以上实验均需在避光条件下完成。

2、准备1mg/ml的PROP母液，经梯度稀释成15个不同浓度，最小浓度为0mg/ml，之后用紫外分光光度计测量其在600-900nm范围内的吸收谱，根据吸收谱制作标准曲线；测量不同投药比样品的吸收谱，通过标准曲线计算样品中PROP浓度，再根据载药量＝(纳米颗粒中PROP的质量)/(投入的HOLO-TF和PROP总量)×100％、包封率＝(纳米颗粒中PROP的质量)/(投入的PROP质量)×100％计算得到样品的载药量和包封率，选择最适投药比的样品，计算得到PROP与转铁蛋白的最适质量比为3：10。

实施例3

本实施例为TPP毒性检测

选择对数生长期的U87细胞，消化、离心，弃上清后重悬细胞，收集单细胞悬液，进行细胞计数，计算后用完全培养基稀释成合适浓度，接种在96孔板中，在37℃，5％CO₂和95％相对湿度的条件下培养24h后，弃掉培养基，PBS洗涤三次，加入含不同浓度游离的PROP和TPP纳米颗粒进行细胞培养，孵育4h后，弃掉培养基，加入含CCK-8试剂的新鲜培养基孵育4h，用多功能酶标仪检测样品在450nm处的吸收，采用MTT法计算细胞存活率。

从图5可以看出，PROP和TPP小分子探针低毒性，对细胞基本没有伤害，符合作为生物探针的标准。

实施例4

本实施例为TPP的细胞成像研究

选择对数生长期的U87细胞，消化、离心、计数、稀释、接种。培养箱中培养24h后，弃掉培养基，PBS洗涤三次；分别加入含游离PROP和TPP纳米颗粒的新鲜培养基孵育细胞4h，弃掉培养基，PBS洗涤三次；4％多聚甲醛，37℃固定细胞10min，PBS洗涤三次；DAPI染色10min，PBS洗涤三次，激光共聚焦显微镜，在300nm的激发波长下，观察药物进入细胞的情况。

PROP(如图6所示)和TPP在神经胶质瘤细胞中发出红色荧光，且TPP在细胞中成像效果好，可用于肿瘤的检测。

另外，实验证实TPP可穿过血脑屏障，能够靶向定位到脑部胶质瘤区域，发出红色荧光。

以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。