阅读说明：本技术 一种乳铁蛋白冷冻干燥保护剂及其应用 (Lactoferrin freeze-drying protective agent and application thereof ) 是由 罗述博 闫序东 杨蕾蕾 王彩云 程英 于 2018-06-05 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种乳铁蛋白冷冻干燥保护剂及其应用,所述乳铁蛋白冷冻干燥保护剂包括糖类及氨基酸,以所述乳铁蛋白的总重量为100％计,所述糖类的用量为0.01％-5％,所述氨基酸的用量为0.01％-2％。以乳铁蛋白对大肠杆菌的抑菌活性为评价指标,添加了本发明的冷冻干燥保护剂而冻干的乳铁蛋白的抑菌率明显高于未添加冷冻干燥保护剂冻干的乳铁蛋白,这表明本发明所提供的冷冻干燥保护剂可以有效降低乳铁蛋白在冷冻干燥过程中的活性损失。(The invention provides a lactoferrin freeze-drying protective agent and application thereof, wherein the lactoferrin freeze-drying protective agent comprises saccharides and amino acids, the total weight of the lactoferrin is 100%, the amount of the saccharides is 0.01% -5%, and the amount of the amino acids is 0.01% -2%. The antibacterial activity of the lactoferrin on escherichia coli is taken as an evaluation index, the bacteriostatic rate of the freeze-dried lactoferrin added with the freeze-drying protective agent is obviously higher than that of the lactoferrin freeze-dried without the freeze-drying protective agent, and the freeze-drying protective agent provided by the invention can effectively reduce the activity loss of the lactoferrin in the freeze-drying process.)

一种乳铁蛋白冷冻干燥保护剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种乳铁蛋白冷冻干燥保护剂及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

乳铁蛋白(LF)是一种天然存在于乳汁、眼泪、唾液等外分泌液中的具有生物活性功能的糖蛋白，其生物活性功能包括广谱抗菌活性、增强铁的传递和吸收、免疫调节、调节炎症反应和抗氧化作用等。乳铁蛋白的生物活性与其结构存在密切关系，一些乳铁蛋白的结构对生物活性的作用机理已经被研究确认，乳铁蛋白的各种优良生物活性必须依赖于各级蛋白质结构的正常维持。然而，乳铁蛋白对于热、pH值、离子强度等外界环境比较敏感，其结构比较容易发生改变从而丧失活性。

目前，商业化乳铁蛋白主要是从牛乳或乳清中提取得到，乳铁蛋白生产工艺的最后步骤就是将液态的乳铁蛋白溶液干燥为固态，由于乳铁蛋白的高敏感性，目前主要的干燥方法是冷冻干燥和低温喷雾干燥。

冷冻干燥(简称冻干)技术是将含水物质在低温下冻结，然后在真空条件下通过对冻干物料加热使冰升华，从而脱除水分的一种干燥方法。由于物料在冻干过程中始终处于较低的温度，因此物料理化性质改变较小，冻干后物料品质较高，且冻干后的物质结构疏松多孔，十分有利于物质的复溶。显然，冷冻干燥是最适合于乳铁蛋白这类结构不稳定的蛋白质的干燥方法。相比于滚筒干燥、喷雾干燥等干燥方式，冷冻干燥造成的乳铁蛋白结构改变和活性损失程度最低。然而，冻干过程是一个复杂的相变过程，在冻结、一次干燥和二次干燥等过程中，存在着多种诱导蛋白质变性的因素。因此，事实上，乳铁蛋白在冷冻干燥后，其生物活性仍然发生了比较轻微的损失。除了通过调节预冻温度，降温速率等工艺参数外，使用冻干保护剂也是一种尤为有效的保持乳铁蛋白生物活性的方法。

本案发明人经过实际研究发现常规冷冻干燥后再复溶的乳铁蛋白的生物活性有所降低，这表明冷冻干燥过程中乳铁蛋白发生了某种程度的变性。

为此，提供一种适合于乳铁蛋白，并且可以有效降低乳铁蛋白在冻干过程的活性损失的冷冻干燥保护剂已成为本领域亟需解决的技术问题。

发明内容

为了解决上述的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种乳铁蛋白冷冻干燥保护剂。本发明所提供的乳铁蛋白冷冻干燥保护剂可以大幅度降低乳铁蛋白在冷冻干燥过程中的活性损失。

本发明的目的还在于提供所述的乳铁蛋白冷冻干燥保护剂在乳铁蛋白冷冻干燥中的应用。

本发明的目的还在于提供一种乳铁蛋白冷冻干燥方法，该方法采用所述的乳铁蛋白冷冻干燥保护剂。

为达到上述目的，一方面，本发明提供一种乳铁蛋白冷冻干燥保护剂，其中，所述乳铁蛋白冷冻干燥保护剂包括糖类及氨基酸，以所述乳铁蛋白的总重量为100％计，所述糖类的用量为0.01％-5％，所述氨基酸的用量为0.01％-2％。

根据本发明所述的乳铁蛋白冷冻干燥保护剂，优选地，所述糖类的用量为0.1％-2％，所述氨基酸的用量为0.05％-1％。

其中，所用糖类的保护机制主要有两种，其一是粘度较高的糖类包围在蛋白质分子周围，限制物质的扩散，降低了蛋白质分子的伸展程度，如蔗糖具有一个相对较高的玻璃化转变温度，使其在冷冻状态下可与蛋白质共浓缩，起到了稀释蛋白质的作用，从而防止了聚合，并且维持蛋白分子的结构；其二是蛋白质在失去水分后，原先与水分子结合的氢键与糖分子发生结合，这样蛋白质表面的氢键和极性基团不至于因为暴露而发生变性。

根据本发明所述的乳铁蛋白冷冻干燥保护剂，优选地，所述糖类包括蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、乳果糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、葡聚糖、麦芽糊精及预糊化淀粉中的一种或几种的组合。

其中，氨基酸作为蛋白质冻干保护剂时，由于氨基酸的玻璃化转变温度相对高于非氨基酸缓冲剂，因此氨基酸对冻干制剂的稳定性起到了一定作用；在冷冻和冻干过程中，两性的氨基酸分子与蛋白分子之间发生特异的相互作用，进而可保护蛋白不变性；此外，氨基酸还可以通过阻止缓冲盐结晶的方式保护蛋白质。因此，本发明所要求保护的冷冻干燥保护剂采用糖类和氨基酸的组合可显著降低冻干工艺对乳铁蛋白活性的损失。

根据本发明所述的乳铁蛋白冷冻干燥保护剂，优选地，所述氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、色氨酸及甘氨酸中的一种或者几种的组合。

根据本发明所述的乳铁蛋白冷冻干燥保护剂，优选地，当所述氨基酸包括精氨酸及赖氨酸时，所述精氨酸与赖氨酸的摩尔比为20:1-1:20。

根据乳铁蛋白的应用领域和相关法规，冷冻干燥过程中可以选择不同的糖类及氨基酸组合以作为该乳铁蛋白冷冻干燥保护剂，例如，针对婴幼儿配方乳粉中的乳铁蛋白，其所用冷冻干燥保护剂可以选择低聚果糖和/或低聚半乳糖及色氨酸的组合，其中，低聚果糖和低聚半乳糖为益生元，其对于婴幼儿肠道健康十分有益，色氨酸对于婴幼儿神经发育十分重要；而针对用于能量补充用途的乳铁蛋白，其所用冷冻干燥保护剂可以选择果糖和各种氨基酸的组合；针对用于酸奶、液态奶的乳铁蛋白，其所用冷冻干燥保护剂可以选择成本相对低廉的乳糖和/或葡聚糖及甘氨酸的组合。

另一方面，本发明还提供了所述的乳铁蛋白冷冻干燥保护剂在乳铁蛋白冷冻干燥中的应用。

又一方面，本发明还提供了一种乳铁蛋白冷冻干燥方法，该方法采用所述的乳铁蛋白冷冻干燥保护剂，所述方法包括以下步骤：

(1)向乳铁蛋白水溶液中加入所述乳铁蛋白冷冻干燥保护剂，室温下混合均匀；

(2)对步骤(1)所得混合液进行冷冻干燥；其中，所述冷冻干燥包括以下四个阶段：

第一阶段：冷冻干燥温度在-50至-30℃范围内，保持0.5-3h，压力为0.3bar；

第二阶段：快速升温至温度为-20至-15℃范围内，保持3-8h，压力为0.3bar；

第三阶段：升温至温度为0℃，保持1-3h，压力为0.3bar；

第四阶段：升温至温度为25至35℃，保持5-10h，压力为0.3bar。

根据本发明所述的乳铁蛋白冷冻干燥方法，所用的四段冷冻干燥方法可大幅降低冻干时间，降低冻干成本，其中，主要是第二阶段，采用快速升温将温度升至-20到-15℃范围内。该操作的主要目的是：由于冻干产品的水分主要是在低温下排出的，即在溶液的共融点以下排出，所述乳铁蛋白的共熔点在-14至-12℃，因此，冷冻干燥过程中在共融点温度下提供更多热量是缩短冷冻干燥时间的重要因素。前阶段尽可能多的排除水分，可以缩短后期干燥时间。

根据本发明所述的乳铁蛋白冷冻干燥方法，优选地，所述混合时间为1-60min。

根据本发明所述的乳铁蛋白冷冻干燥方法，优选地，所述冷冻干燥过程中控制料液的厚度为1-5cm。其中，冷冻干燥过程中，如果料液厚度过大会导致料液无法彻底被冻干，因此在本发明提供的乳铁蛋白冷冻干燥方法中需控制料液的厚度为1-5cm。

根据本发明所述的乳铁蛋白冷冻干燥方法，优选地，第二阶段为快速升温至温度为-15℃。

根据本发明所述的乳铁蛋白冷冻干燥方法，优选地，所述快速升温的升温速率为1-1.5℃/min。

根据本发明所述的乳铁蛋白冷冻干燥方法，优选地，以所述乳铁蛋白水溶液的总重量为100％计，其中乳铁蛋白的浓度为1-10％，更优选为5％。

根据本发明所述的乳铁蛋白冷冻干燥方法，优选地，所述乳铁蛋白水溶液的pH值为6.5-7.0。

根据本发明所述的乳铁蛋白冷冻干燥方法，优选地，所述乳铁蛋白水溶液的电导率为1.5mS/cm以下。其中，乳铁蛋白冷冻干燥过程中，控制该乳铁蛋白水溶液的电导率为1.5mS/cm以下可以降低其中所含盐类的量，进而最终所得的乳铁蛋白纯度更高。

根据本发明所述的乳铁蛋白冷冻干燥方法，其中，所用乳铁蛋白水溶液是通过层析和膜滤技术制备得到的，具体而言，其制备方法包括以下步骤：对脱脂奶或乳清蛋白等含有乳铁蛋白的乳原料进行离子交换层析，得到乳铁蛋白粗提液，以该乳铁蛋白粗提液的总重量为100％计，其中乳铁蛋白的浓度约为1％；

再对所述乳铁蛋白粗提液进行超滤浓缩脱盐，得到pH值为6.5-7.0，电导率在1.5mS/cm以下，浓度为1-10％的乳铁蛋白水溶液。

其中，若乳铁蛋白的浓度大于10％，则乳铁蛋白水溶液会有沉淀产生，堵塞膜滤，影响浓缩速度，进而无法继续浓缩。

在乳铁蛋白水溶液中加入本发明所提供的乳铁蛋白冷冻干燥保护剂，搅拌均匀，之后按照所述冻干程序将乳铁蛋白冷冻干燥。以乳铁蛋白对大肠杆菌的抑菌活性为评价指标，添加了本发明的冷冻干燥保护剂而冻干的乳铁蛋白的抑菌率明显高于未添加冷冻干燥保护剂冻干的乳铁蛋白，这表明本发明所提供的冷冻干燥保护剂可以有效降低乳铁蛋白在冷冻干燥过程中的活性损失，即该冷冻干燥保护剂可以有效减少乳铁蛋白在冷冻干燥过程中所遭受的损害，在一定程度上提高了乳铁蛋白在生产加工中的生物活性保存率。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合以下具体实施例对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

本发明中未详细提及的操作步骤及所用仪器设备，可按照所属领域的常规操作或是参照所用仪器设备的说明书进行。

实施例1

本实施例提供了一种乳铁蛋白冷冻干燥方法，其包括以下步骤：

在5L浓度为5wt％的乳铁蛋白水溶液(pH值为6.5-7.0，电导率为1.5mS/cm以下)中，加入冻干保护剂，保护剂包含12.5g的乳糖和5g的甘氨酸，即5wt％的乳糖和2wt％的甘氨酸(以乳铁蛋白的质量计)，温和搅拌至保护剂溶解，将所得混合液倒入冻干托盘中，料液厚度为2cm。

按照以下程序对乳铁蛋白水溶液进行冻干操作：-40℃预冻1h；一次干燥将温度在20min内升高至-20℃并维持8h，升温速率为1℃/min；再将温度升高至0℃，保持1h；二次干燥将温度继续升高至30℃维持10h，真空度始终保持在约0.3mbar，结束。将冻干后的乳铁蛋白在无菌条件下粉碎包装。

实施例1制备所得乳铁蛋白对大肠杆菌抑制活性的检测方法包括以下步骤：

菌种：大肠杆菌K99菌株：C83312(国家兽医微生物菌种保藏中心)。

培养基：缓冲蛋白胨水，结晶紫中性红胆盐琼脂。

菌液制备：挑取斜面保藏的大肠杆菌少量于10mL蛋白胨水中，于37℃、60转/min培养活化16h，按照1％的接种量将第一代活化菌液转移至新的蛋白胨水中，37℃、60转/min培养1h，使菌液浓度达到10⁶-10⁷，再稀释10倍备用。

乳铁蛋白溶液制备：以纯水溶解乳铁蛋白冻干粉，配制浓度为2mg/mL的乳铁蛋白溶液，以0.2μm针头式滤膜过滤乳铁蛋白溶液。

抑菌实验：在8.6mL的蛋白胨水中添加0.4mL该浓度为2mg/mL的乳铁蛋白溶液，再添加1mL浓度为10⁵-10⁶的大肠杆菌菌液，37℃培养24h进行平板计数。

检测结果：

实施例1中使用本发明所提供的冻干保护剂的乳铁蛋白与未使用冻干保护剂的乳铁蛋白(除未加入冷冻干燥保护剂外，其他工艺均与实施例1相同)对大肠杆菌的抑制活性结果见如下表1所示。

表1

样品组	24h菌数	抑菌率
			对照	4.72×10<sup>8</sup>	—
常规冻干(未使用冻干保护剂)乳铁蛋白	3.13×10<sup>7</sup>	93.37％
			实施例1使用冻干保护剂的乳铁蛋白	8.51×10<sup>6</sup>	98.2％

由表1中结果可知，在乳铁蛋白冷冻干燥过程中使用了本发明所提供的冷冻干燥保护剂后，乳铁蛋白的抑菌性提高了4.83％。

实施例2

本实施例提供了一种乳铁蛋白冷冻干燥方法，其包括以下步骤：

在5L浓度为5wt％的乳铁蛋白水溶液(pH值为6.5-7.0，电导率为1.5mS/cm以下)中加入冻干保护剂，保护剂包含5g乳糖和2.5g甘氨酸，即2wt％的乳糖和1wt％的甘氨酸(以乳铁蛋白的质量计)，温和搅拌至保护剂溶解，将所得混合液倒入冻干托盘中，料液厚度为2cm。

按照以下程序对乳铁蛋白水溶液进行冻干操作：-40℃预冻1h；一次干燥将温度在20min内升高至-20℃并维持8h，升温速率为1℃/min；再将温度升高至0℃，保持1h；二次干燥将温度继续升高至30℃维持10h，真空度始终保持在约0.3mbar，结束。将冻干后的乳铁蛋白在无菌条件下粉碎包装。

实施例2所得乳铁蛋白对大肠杆菌抑制活性的检测方法同实施例1。

检测结果：

实施例2中使用本发明所提供的冻干保护剂的乳铁蛋白与未使用冻干保护剂的乳铁蛋白(除未加入冷冻干燥保护剂外，其他工艺均与实施例2相同)对大肠杆菌的抑制活性结果见如下表2所示。

表2

由表2中结果可知，在乳铁蛋白冷冻干燥过程中使用了本发明所提供的冷冻干燥保护剂后，乳铁蛋白的抑菌性提高了5.41％。

实施例3

本实施例提供了一种乳铁蛋白冷冻干燥方法，其包括以下步骤：

在5L浓度为5wt％的乳铁蛋白水溶液(pH值为6.5-7.0，电导率为1.5mS/cm以下)中加入冻干保护剂，保护剂包含0.0125g低聚果糖、0.0125g低聚半乳糖、0.0125g精氨酸和0.0125g色氨酸，即0.01wt％的糖类和0.01wt％的氨基酸(以乳铁蛋白的质量计)，温和搅拌至保护剂溶解，将所得混合液倒入冻干托盘中，料液厚度为2cm。

按照以下程序对乳铁蛋白水溶液进行冻干操作：-40℃预冻1h；一次干燥将温度在20min内升高至-20℃并维持8h，升温速率为1℃/min；再将温度升高至0℃，保持1h；二次干燥将温度继续升高至30℃维持10h，真空度始终保持在约0.3mbar，结束。将冻干后的乳铁蛋白在无菌条件下粉碎包装。

实施例3制备所得乳铁蛋白对大肠杆菌抑制活性的检测方法同实施例1。

检测结果：

实施例3中使用本发明所提供的冻干保护剂的乳铁蛋白与未使用冻干保护剂的乳铁蛋白(除未加入冷冻干燥保护剂外，其他工艺均与实施例3相同)对大肠杆菌的抑制活性结果见如下表3所示。

表3

样品组	24h菌数	抑菌率
			对照	4.72×10<sup>8</sup>	—
常规冻干(未使用冻干保护剂)乳铁蛋白	3.13×10<sup>7</sup>	93.37％
			实施例3使用冻干保护剂的乳铁蛋白	9.53×10<sup>6</sup>	97.98％

由表3中结果可知，在乳铁蛋白冷冻干燥过程中使用了本发明所提供的冷冻干燥保护剂后，乳铁蛋白的抑菌性提高了4.61％。

实施例4

本实施例提供了一种乳铁蛋白冷冻干燥方法，其包括以下步骤：

在5L浓度为5wt％的乳铁蛋白水溶液(pH值为6.5-7.0，电导率为1.5mS/cm以下)中加入冻干保护剂，保护剂包含0.125g低聚果糖、0.125g低聚半乳糖、0.0625g精氨酸和0.0625g色氨酸，即0.1wt％的糖类和0.05wt％的氨基酸(以乳铁蛋白的质量计)，温和搅拌至保护剂溶解，将所得混合液倒入冻干托盘中，料液厚度为2cm。

按照以下程序对乳铁蛋白溶液进行冻干操作：-40℃预冻1h；一次干燥将温度在20min内升高至-20℃并维持8h，升温速率为1℃/min；再将温度升高至0℃，保持1h；二次干燥将温度继续升高至30℃维持10h，真空度始终保持在约0.3mbar，结束。将冻干后的乳铁蛋白在无菌条件下粉碎包装。

实施例4制备所得乳铁蛋白对大肠杆菌抑制活性的检测方法同实施例1。

检测结果：

实施例4中使用本发明所提供的冻干保护剂的乳铁蛋白与未使用冻干保护剂的乳铁蛋白(除未加入冷冻干燥保护剂外，其他工艺均与实施例4相同)对大肠杆菌的抑制活性结果见如下表4所示。

表4

样品组	24h菌数	抑菌率
			对照	4.72×10<sup>8</sup>	—
常规冻干(未使用冻干保护剂)乳铁蛋白	3.13×10<sup>7</sup>	93.37％
			实施例4使用冻干保护剂的乳铁蛋白	3.91×10<sup>6</sup>	99.17％

由表4中结果可知，在乳铁蛋白冷冻干燥过程中使用了本发明所提供的冷冻干燥保护剂后，乳铁蛋白的抑菌性提高了5.8％。

实施例5

本实施例提供了一种乳铁蛋白冷冻干燥方法，其包括以下步骤：

在5L浓度为5wt％的乳铁蛋白水溶液(pH值为6.5-7.0，电导率为1.5mS/cm以下)中加入冻干保护剂，保护剂包含5g乳糖、2.5g甘氨酸、0.5g甘露醇和0.5g明胶，即2wt％的乳糖，1wt％的甘氨酸，0.2wt％的甘露醇和0.2wt％明胶(以乳铁蛋白的质量计)，温和搅拌至保护剂溶解，将所得混合液倒入冻干托盘中，料液厚度为2cm。

按照以下程序对乳铁蛋白水溶液进行冻干操作：-40℃预冻1h；一次干燥将温度在20min内升高至-20℃并维持8h，升温速率为1℃/min；再将温度升高至0℃，保持1h；二次干燥将温度继续升高至30℃维持10h，真空度始终保持在约0.3mbar，结束。将冻干后的乳铁蛋白在无菌条件下粉碎包装。

实施例5所得乳铁蛋白对大肠杆菌抑制活性的检测方法同实施例1。

检测结果：

实施例5中使用本发明所提供的冻干保护剂的乳铁蛋白与未使用冻干保护剂的乳铁蛋白(除未加入冷冻干燥保护剂外，其他工艺均与实施例5相同)对大肠杆菌的抑制活性结果见如下表5所示。

表5

样品组	24h菌数	抑菌率
			对照	4.72×10<sup>8</sup>	—
常规冻干(未使用冻干保护剂)乳铁蛋白	3.13×10<sup>7</sup>	93.37％
			实施例5使用冻干保护剂的乳铁蛋白	7.92×10<sup>6</sup>	98.32％

由表5中结果可知，在乳铁蛋白冷冻干燥过程中使用了本发明所提供的冷冻干燥保护剂后，乳铁蛋白的抑菌性提高了4.95％。

实施例6

本实施例提供了一种乳铁蛋白冷冻干燥方法，其包括以下步骤：

在5L浓度为5wt％的乳铁蛋白水溶液(pH值为6.5-7.0，电导率为1.5mS/cm以下)中加入冻干保护剂，保护剂包含0.125g低聚果糖、0.125g低聚半乳糖、0.0625g精氨酸和0.0625g色氨酸，即0.1wt％的糖类和0.05wt％的氨基酸(以乳铁蛋白的质量计)，温和搅拌至保护剂溶解，将所得混合液倒入冻干托盘中，料液厚度为2cm。

按照如下表6中所示的冷冻干燥程序对乳铁蛋白水溶液进行冻干操作，将冻干后的乳铁蛋白在无菌条件下粉碎包装。其中，不同冷冻干燥程序所对应的效果时间及所得乳铁蛋白的含水量同样如下表6所示。

表6

注：工艺1及工艺2中第二阶段快速升温的升温速度为1℃/min。

从表6中可以看出，按照“对比工艺1”对乳铁蛋白进行冷冻干燥，冻干需要26h，“对比工艺2”中单独缩短第四阶段的冻干时间，会导致含水量升高，含水量可达到6.25％，表明采用该“对比工艺2”对乳铁蛋白进行冻干并没有达到干燥目的。而提高第二阶段的温度，如采用本发明提供的“工艺1”、“工艺2”不仅可以减少第二阶段的干燥时间，同时第四阶段的干燥时间也可以大幅降低。由此可见，采用本发明所提供的冷冻干燥程序对乳铁蛋白进行冷冻干燥可以明显降低冷冻干燥的时间，进而也降低了冷冻干燥的成本。