阅读说明：本技术 一种制备具有所需铁饱和度的乳铁蛋白的方法 (Method for preparing lactoferrin with required iron saturation ) 是由 罗述博 王彩云 杨蕾蕾 程英 云战友 杨吉武 于 2018-06-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种制备具有所需铁饱和度的乳铁蛋白的方法,该方法包括：准备饱和乳铁蛋白溶液；采用缓冲液调节饱和乳铁蛋白溶液的pH值；其中,是根据所需铁饱和度确定所调节的pH值；超滤,制备具有所需铁饱和度的乳铁蛋白产品。本发明的方法可有针对性的制备不同铁饱和度的乳铁蛋白,方法操作简便,效率高,调节精度高。(The present invention provides a process for preparing lactoferrin having a desired degree of iron saturation, the process comprising: preparing a saturated lactoferrin solution; regulating the pH value of the saturated lactoferrin solution by adopting a buffer solution; wherein the adjusted pH is determined according to the desired iron saturation; and (4) performing ultrafiltration to prepare a lactoferrin product with the required iron saturation. The method can be used for preparing the lactoferrin with different iron saturation degrees in a targeted manner, and is simple and convenient to operate, high in efficiency and high in adjusting precision.)

一种制备具有所需铁饱和度的乳铁蛋白的方法

技术领域

本发明是关于一种制备乳铁蛋白的方法，具体是一种从含有乳铁蛋白的乳制品中根据不同功能特性需求制备具有所需铁饱和度的乳铁蛋白的方法，属于乳制品加工工艺技术领域。

背景技术

乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)，又称“乳转铁蛋白”，是一种非血红素铁结合性糖蛋白，属于转铁蛋白家族。各种哺乳动物都能产生乳铁蛋白，但其浓度因物种而异，人奶中乳铁蛋白浓度最高，含量可达1700mg/L，乳铁蛋白在牛奶中平均浓度为100mg/L。其具有优越的功能特性，研究表明乳铁蛋白具有广谱抗菌和抗病毒感染作用；能够参与机体铁代谢，促进铁的吸收和利用，调节体内铁的平衡；调节骨髓细胞的生成，促进细胞的生长；增强机体免疫抗病能力；抑制人体肿瘤细胞，能与多种抗生素及抗真菌制剂协同作用更有效治疗疾病。

乳铁蛋白是一种铁结合蛋白，铁的结合度会影响乳铁蛋白在活性上的表现，由于乳铁蛋白可以稳定并可逆地结合2个Fe³⁺，因此乳铁蛋白具有不同的铁结合状态：缺铁型乳铁蛋白(Apo-LF)、铁半饱和型和铁饱和型乳铁蛋白(Holo-LF)。研究表明，LF在结合铁和释放铁时构象会发生很大的变化，Holo-LF与Apo-LF相比，结构更稳定，更致密。研究发现乳铁蛋白的铁饱和度影响其生理功能的发挥。卢蓉蓉等研究表明随着铁饱和度的升高，乳铁蛋白的抑菌能力下降。Jiang研究表明在体外试验中Apo-LF刺激隐窝细胞增殖作用要显著高于Holo-LF。Wang等研究表明Apo-LF的体内促成骨活性高于Holo-LF。而铁饱和型乳铁蛋白在人体补充铁元素上发挥重要作用。

因此就需要对天然状态下的乳铁蛋白进行铁饱和的调节，制备成适合不同功能需求的乳铁蛋白。

目前从乳成分中分离乳铁蛋白的文献较多，但对乳铁蛋白活性进行调节的并不多。目前对乳铁蛋白活性的调节主要是通过如何保护乳铁蛋白的天然活性的角度出发，在减少蛋白变性的情况下尽量保留其生物活性，也有一些现有技术通过单纯的添加铁离子到乳铁蛋白溶液中进行调解。

CN105566489A公开了一种制备不同铁饱和度乳铁蛋白的方法，其在含有乳铁蛋白的脱脂乳中加入不同浓度的铁离子溶液，并加入碳酸盐充分混合，之后进行阳离子交换，经脱盐和冷冻干燥得到不同铁饱和度的乳铁蛋白。此方法将金属离子直接加入原奶会造成原奶的不稳定，不利于乳铁蛋白吸收，盐溶液的加入也会影响树脂的吸附提取效果，同时各类蛋白的存在能否保证铁离子被乳铁蛋白充分吸收也存在疑问。

CN105558041A公开了一种具有耐热保护作用食品级乳铁蛋白微乳的制备方法，其是通过构建乳铁蛋白油包水的微乳体系，来提高乳铁蛋白的耐热性，但是对乳铁蛋白本身的活性没有增强作用。

CN102459328A公开了一种改进乳铁蛋白抗微生物活性的方法，该方法通过添加酸和醇溶液达到减低铁饱和度的目的，但这种方法引入了酸溶液和醇溶液，对食品安全存在隐患，同时对铁饱和度的控制范围也十分有限，只能控制铁饱和度在10％以下。

整体来说，现有调节乳铁蛋白活性的方法对铁饱和度的控制范围小，精度低，后期程序繁琐。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种新的制备具有所需铁饱和度的乳铁蛋白的方法，提高效率和调节精度。

本发明的另一目的在于提高所制备得到的具有所需铁饱和度的乳铁蛋白产品。

一方面，本发明提高了一种制备具有所需铁饱和度的乳铁蛋白的方法，该方法包括：

准备饱和乳铁蛋白溶液；

采用缓冲液调节饱和乳铁蛋白溶液的pH值；其中，是根据所需铁饱和度确定所调节的pH值；

超滤，制备具有所需铁饱和度的乳铁蛋白产品。

根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，所述准备饱和乳铁蛋白溶液的过程包括：

将含乳铁蛋白的原料制成乳铁蛋白浓度0.1-10％、pH值6.5的乳铁蛋白溶液；

使用过量的含有Fe³⁺的盐溶液与上述乳铁蛋白溶液混合，混合液室温条件下搅拌1-3小时，得到饱和乳铁蛋白溶液。

根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，含有Fe³⁺的盐溶液与乳铁蛋白溶液的混合液中，Fe³⁺与乳铁蛋白的摩尔比为2:1～5:1。

根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，乳铁蛋白溶液是按照以下方法制备的：

从含乳铁蛋白的原料(例如牛乳或其他来源的原奶，乳铁蛋白粉)中层析分离其中的乳铁蛋白，并经超滤脱盐，得到乳铁蛋白溶液；

优选地，经超滤脱盐后的溶液用10mM柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液调整其pH值为6.5，得到乳铁蛋白溶液。

根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，含有Fe³⁺的盐溶液为FeCl₃溶液或Fe₂(SO₄)₃溶液，用碳酸盐缓冲液调节pH到9。

根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，调节饱和乳铁蛋白溶液的pH值时采用的缓冲液为柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。

根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，超滤条件为：超滤膜的孔径10kDa-30kDa，优选30kDa。

根据本发明的具体实施方案，本发明的方法还包括将超滤后的物料冻干以制备具有所需铁饱和度的乳铁蛋白产品粉的过程，其中，所述冻干条件为：

料液厚度为1cm，冻干程序为：-40℃,2h,0.3bar→-20℃,15h,0.3bar→0℃,2h,0.3bar→35℃,12h,0.3bar。

根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，是按照pH值X与铁饱和度y(％)的关系y＝0.0643*2.27045^X(如图2所示)，根据所需铁饱和度确定所调节的pH值。

另一方面，本发明还提供了按照所述的方法制备得到的乳铁蛋白产品。其饱和度可在2％-96％之间。

根据本发明的一具体实施方案，本发明的一种调节乳铁蛋白活性的方法包括：

制备乳铁蛋白溶液：选取富含乳铁蛋白的牛乳或其他来源的原奶，通过离子交换柱(SP Sepharose Big Beads,GE Healthcare)进行分离，柱子首先用缓冲液平衡到pH值6-7，上样后呈阳离子的蛋白质用一定浓度的(0-1.5M)NaCl梯度洗脱下来，收集第二个洗脱峰，洗脱液经过10kDa的超滤膜进行脱盐，得到乳铁蛋白溶液。

制备饱和乳铁蛋白溶液：将乳铁蛋白溶液调节成浓度为pH6.5的10mM磷酸盐缓冲液，乳铁蛋白浓度为0.1-10％左右。用以下的方法将其饱和，可使用含有Fe³⁺的盐溶液(如硫酸铁、氯化铁等)，优选FeCl₃溶液，用碳酸盐缓冲液调节pH到9，使用过量的FeCl₃溶液与乳铁蛋白溶液混合，由于一个乳铁蛋白分子可以结合两个铁离子，因此要求含铁溶液与乳铁蛋白溶液的摩尔比2:1到5:1之间。混合液室温条件下搅拌1-3小时，得到饱和乳铁蛋白溶液。

调节铁饱和度：制备不同pH的碳酸盐缓冲液(pH8-10,100mM)，用碳酸钠和氢氧化钠配制。柠檬酸盐缓冲液(pH2-5,100mM)，柠檬酸盐缓冲液组成为通过添加柠檬酸将100mM柠檬酸三钠调节成不同pH。用柠檬酸缓冲液调节饱和乳铁蛋白溶液pH值，最后超滤浓缩去除Fe和其它盐成分。也可用乙酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液等代替。

除杂：除去溶液中过量的铁离子及其他盐溶液，采用超滤工艺，超滤膜的孔径范围10kDa-30kDa，优选30kDa。

按照上述的方法，针对不同用途得到不同铁饱和度2％-96％的乳铁蛋白。

本发明的技术方案是以乳铁蛋白溶液为原料，乳铁蛋白溶液来源包括所有可提取乳铁蛋白的来源，例如乳液包括人乳、牛乳、羊乳、马乳、驼乳等未经过55℃以上温度处理的的初乳、全脂乳、脱脂乳、乳清液(包含浓缩乳清液)，溶液可以是直接提取的液体产品也可以是由固体样品溶解后的溶液，乳铁蛋白浓度为0.1-10％。

本发明中所提及的蛋白溶液浓度需控制在0.1-10％，优选2-3％，当乳铁蛋白浓度过低时，处理的乳铁蛋白量过低，降低生产效率，而将乳铁蛋白的浓度提升过高，会造成蛋白絮凝沉淀等风险，不利于后续工艺的开展。

本发明所述对乳铁蛋白溶液添加缓冲盐，可以使用柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，优选磷酸盐缓冲液。配制成pH6.5和浓度为10mM的缓冲盐溶液，防止蛋白出现变性等现象。同时缓冲液可以在稍后调节溶液pH值时，不产生剧烈变化，调控更加精准。

本发明所述使乳铁蛋白溶液饱和的铁来源为FeCl₃溶液，用碳酸盐缓冲液调节pH到9。同时也可选用FeCl₃·6H₂O溶液或Fe₂(SO₄)₃溶液。铁离子的添加量需要满足，铁离子与乳铁蛋白的摩尔比为3:1以上，优选3:1。

在50℃条件下搅拌0.5-3小时，得到饱和乳铁蛋白溶液。适当升高温度可以使乳铁蛋白空间结构展开，更充分地完成游离铁离子与结合铁的交换，过量的铁离子能够更快地使乳铁蛋白达到饱和状态。

本发明所述的铁饱和度调节方式，是通过不同pH值的柠檬酸缓冲液调节饱和乳铁蛋白溶液pH值，制备不同pH的柠檬酸盐缓冲液(pH2-8，100mM)，柠檬酸盐缓冲液组成为通过添加柠檬酸将100mM柠檬酸三钠调节成不同pH。

根据物料浓缩采用的一般膜滤工艺，本发明采用膜浓缩工艺，由于乳铁蛋白分子量在80kD，所以滤膜孔径小于乳铁蛋白分子量选择30kDa-50kDa，浓缩时既能保证浓缩浓度又能保持很好的通量除去盐、酸和金属离子等，提高工作效率。

根据本发明，当电导率小于2mS/cm，对样品进行浓缩冻干，得到不同饱和度的乳铁蛋白样品。

附图说明

图1为本发明的调节乳铁蛋白活性的方法工艺路线图。

图2为本发明的调节乳铁蛋白活性的方法中pH值与铁饱和度的关系的曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施例及附图进一步详细说明本发明的特点及所具有的技术效果，但本发明并不因此而受到任何限制。本发明中乳铁蛋白饱和度检测方法参照《乳铁蛋白铁饱和度检测方法的对比》中方法二(引自《中国乳品工业》,2015)进行。

实施例1

根据本发明的方法，参照图1所示流程，按照以下步骤调节乳铁蛋白活性，得到高铁饱和度的乳铁蛋白：

利用离子交换技术从1吨脱脂奶中得到的约50L乳铁蛋白溶液，其中含有乳铁蛋白100g，对溶液进行脱盐处理，并将蛋白溶液浓缩到2％。

向溶液种添加磷酸盐，将乳铁蛋白溶液调节到pH6.5，磷酸盐浓度为10mM；

再向溶液中添加配置好FeCl₃溶液，摩尔浓度为乳铁蛋白浓度的三倍；

溶液在室温下搅拌1小时，值得完全饱和的乳铁蛋白。

根据不同应用需求，添加pH值为5的柠檬酸盐缓冲液，将乳铁蛋白溶液调至pH＝8，制成铁饱和度为47％的样品。

根据拟合方程y＝0.0643*2.27045^X计算，当x＝8时，y＝45％，说明曲线能够很好预测需要调节饱和度的范围。

该溶液经过30kDa的超滤膜浓缩脱盐，电导小于1.5ms/cm时，体积浓缩5倍，进行冻干。

实施例2

根据本发明的方法，参照图1所示流程，按照以下步骤制备缺铁型乳铁蛋白：

将乳铁蛋白粉末样品配制成3％的溶液；

向溶液种添加醋酸盐，将乳铁蛋白溶液调节到pH6.5，缓冲液盐浓度为10mM；

由于是缺铁型乳铁蛋白，一般情况下天然乳铁蛋白的铁饱和度在20％左右，根据不同应用需求，添加pH值为2的柠檬酸盐缓冲液，将溶液pH值调节到5，可以将乳铁蛋白溶液制成铁饱和度到达4.1％的样品。

根据拟合方程y＝0.0643*2.27045^X计算，当x＝5时，y＝3.88％，说明曲线能够很好预测需要调节饱和度的范围。

该溶液经过30kDa的超滤膜浓缩脱盐，电导小于1.5ms/cm时，体积浓缩5倍，无菌过滤灌装成液体保存。

对比例：

本对比例的方法为CN 105566489 A中记载的制备不同铁饱和度乳铁蛋白的方法。

该方法是分别在含有乳铁蛋白的脱脂乳中加入1mM、3mM和5mM的铁离子溶液，并加入100mM-200mM的NaHCO₃充分混匀，之后分别进行阳离子交换层析，经浓缩脱盐和冷冻干燥后即得不同铁饱和度的乳铁蛋白。

该对比例的方法在实施时发现，铁离子溶液和NaHCO₃溶液的添加，会导致原料的电导率增加，影响离子交换树脂的吸附作用，目标蛋白无法充分吸附，导致产品得率降低。

牛乳是一个复杂的体系，添加盐溶液也会对其它成分造成影响，从铁离子的添加角度上考虑，牛乳中有多种协助微量元素运输的蛋白，能够与其结合，这就需要更多的添加铁离子溶液，本发明所使用的浓度为乳铁浓度的2-4倍，而该对比方法是几十甚至上百倍，造成成本增加和效率降低。同时对比方法是在工艺前段进行调节，一旦由于实验条件发生变化，导致乳铁蛋白没有充分吸附铁离子，无法在后段进行进一步准确调控。