阅读说明：本技术 脂肽Lin-Lf4NH2和Lin-Lf5NH2及其应用 (Lipopeptide Lin-Lf4NH2And Lin-Lf5NH2And uses thereof ) 是由 王建华 刘鹤 毛若雨 滕达 王秀敏 杨娜 郝娅 于 2020-05-06 设计创作，主要内容包括：本发明提供新型的脂肽Lin-Lf4NH<Sub>2</Sub>和Lin-Lf5NH<Sub>2</Sub>及其应用。脂肽Lin-Lf4NH<Sub>2</Sub>/Lin-Lf5NH<Sub>2</Sub>是在抗菌肽LfcinB4/LfcinB5的N端偶联亚油酸,C端经过酰胺化修饰得到的。实验表明,脂肽Lin-Lf4NH<Sub>2</Sub>和Lin-Lf5NH<Sub>2</Sub>对革兰氏阳性菌和阴性菌均具有较好的抑制作用,比母体肽的MIC值小,热稳定性好,在小鼠皮肤脓肿模型试验中能够显著降低皮肤荷菌量,减轻皮肤组织损伤,具有比Lf4NH<Sub>2</Sub>和Lf5NH<Sub>2</Sub>更好的治疗效果,是极具应用价值的小分子脂肽,可用于制备新型抗菌抗感染药物等,应用前景广阔。(The invention provides a novel lipopeptide Lin-Lf4NH 2 And Lin-Lf5NH 2 And applications thereof. Lipopeptide Lin-Lf4NH 2 /Lin‑Lf5NH 2 Is obtained by coupling linoleic acid at the N end of antibacterial peptide LfcinB4/LfcinB5 and amidating modification at the C end. Experiments show that the lipopeptide Lin-Lf4NH 2 And Lin-Lf5NH 2 Has better inhibiting effect on gram-positive bacteria and gram-negative bacteria, has smaller MIC value than parent peptide, has good thermal stability, can obviously reduce the skin bacterial load and lighten the skin tissue damage in a mouse skin abscess model test, and has the inhibiting effect on gram-positive bacteria and gram-negative bacteria compared with Lf4NH 2 And Lf5NH 2 Better treatment effect, is the micromolecular lipopeptide with great application value, can be used for preparing novel antibacterial and anti-infective medicaments and the like, and has wide application prospect.)

脂肽Lin-Lf4NH2和Lin-Lf5NH2及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及脂肽Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂及其应用。

背景技术

乳铁蛋白肽(Lactoferricin，简写Lfcin)是乳铁蛋白在酸性环境下经胃蛋白酶作用N端释放的一段多功能抗菌肽(Gifford等，2005)，Lfcin与乳铁蛋白的功能密切相关，包含了乳铁蛋白的大部分功能域，具有强大的抗菌、抗癌、抗病毒、抗寄生虫和抗炎活性(Hao等,2018)。在许多情况下，Lfcin不仅保留了乳铁蛋白的活性，甚至比亲本蛋白的活性更强(Arias等，2014)。由牛乳铁蛋白第17-41位氨基酸残基组成的LfcinB被认为是奶牛、小鼠和山羊等多种Lfcins中最有效的(Bruni等，2016；Ulvatne等，2001)。细菌耐药性的迅速增加对抗生素构成了严重挑战，与传统抗生素相比，由于抗菌肽具有较强的抗菌活性和不同的抗菌机制，不易形成耐药性，具有成为未来抗菌药物的潜力(Andersson等，2016；Seo etal.，2012)。然而抗菌肽的临床治疗与应用仍然存在问题，为了提高Lfcins的抗菌活性，开发新的功能，对抗耐药菌的出现，需要用到包括氨基酸替代、化学修饰、环化、嵌合、聚合等多种分子设计策略(Hao等，2018；Yin等，2014)。

发明内容

本发明的目的是提供新型的脂肽Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂及其应用。

本发明构思如下：为了进一步提高多肽LfcinB4和LfcinB5的抗菌活性，本发明将LfcinB4和LfcinB5的N端偶联亚油酸，C端经过酰胺化修饰，获得两条脂肽Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂。随后，对Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂抗菌活性、毒性及体内药效进行评价，为新型抗菌的药物创制提供理论依据。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种脂肽Lin-Lf4NH₂，其是在抗菌肽LfcinB4的N端偶联亚油酸，C端经过酰胺化修饰得到的。其序列如下：(Linoleic acid)-FKAWRWAWRWKKLAAPS-NH₂(SEQ ID NO:1)。

脂肽Lin-Lf4NH₂的结构如式(I)所示：

第二方面，本发明提供脂肽Lin-Lf5NH₂，脂肽Lin-Lf5NH₂是在抗菌肽LfcinB5的N端偶联亚油酸，C端经过酰胺化修饰得到的。其序列如下：(Linoleic acid)-FKAFRWAWRWKKLAAPS-NH₂(SEQ ID NO:2)。

脂肽Lin-Lf5NH₂的结构如式(II)所示：

第三方面，本发明提供含有脂肽Lin-Lf4NH₂和/或脂肽Lin-Lf5NH₂的广谱抗菌药物或组合物。

第四方面，本发明提供含有脂肽Lin-Lf4NH₂和/或脂肽Lin-Lf5NH₂的防腐剂、杀菌剂或表面活性剂。

第五方面，本发明提供脂肽Lin-Lf4NH₂和/或脂肽Lin-Lf5NH₂的以下任一应用：

1)用于制备抗菌药物或组合物；

2)用于制备防腐剂；

3)用于制备杀菌剂；

4)用于制备表面活性剂。

所述菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。优选包括葡萄球菌属(Staphylococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)细菌。更优选包括猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、鸡白痢沙门菌(Salmonella pullorum)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明的脂肽Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂是人工设计合成的活性多肽，包含17个氨基酸残基，带5个正电荷，N端偶联亚油酸，C端被酰胺化修饰，分子量分别为2450.09Da和2411.05Da。与母体肽Lf4NH₂和Lf5NH₂相比，Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂具有更高的抗菌活性和热稳定性，在低浓度范围内几乎没有细胞毒性。

实验表明脂肽Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂对革兰氏阳性菌和阴性菌均具有较好的抑制作用，比母体肽的MIC值小，热稳定性好，在小鼠皮肤脓肿模型试验中能够显著降低皮肤荷菌量，减轻皮肤组织损伤，效果优于抗生素莫匹罗星，是极具应用价值的小分子脂肽，可用于制备新型抗菌抗感染药物等，应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明脂肽Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂的质谱图。

图2为本发明实施例3中脂肽Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂的细胞毒性。

图3为本发明实施例5中脂肽Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂的治疗后小鼠皮肤荷菌量。

图4为本发明实施例5中脂肽Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂的治疗后小鼠皮肤组织切片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中使用的实验材料：MEM高糖细胞培养液、胰蛋白酶消化液、细胞用PBS、胎牛血清及青链霉素混合液均购自美国Gibco公司，ELISA板和无菌96孔培养板购自Thermo Scientific，抗生素2％莫匹罗星软膏购自中国兽医药品监察所，人类永生化表皮细胞(Hacat)购自北京协和医院，六周龄SPF级BALB/c小鼠北京维通利华试验动物有限公司。其它常规试剂采用进口分装或国产分析纯。

以下实施例中涉及的培养基和缓冲液配方：

MH液体培养基：2.4g溶于80mL蒸馏水中，完全溶解后定容至100mL，121℃高压灭菌20min。

MH固体培养基：3.65g溶于80mL蒸馏水中，完全溶解后定容至100mL，121℃高压灭菌20min。

细胞完全培养液：10％胎牛血清，100U/mL青链霉素(双抗)，90％MEM高糖基础培养液。

PBS磷酸盐缓冲液：NaCl 4.25g，KH₂PO₄ 0.12g，Na₂HPO₄ 1.825g，KCl 0.1g溶于蒸馏水中，完全溶解后定容至500mL，121℃高压灭菌20min。

以下实施例中涉及的菌种见表1：

表1菌株及来源

实施例1脂肽Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂的设计与合成

多肽LfcinB4和LfcinB5的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示，为了进一步提高LfcinB4和LfcinB5的抗菌活性，分别对两条多肽的结构进行优化设计。

将Fmoc-Phe-OH、HOBT、HBTU、DIEA于DMF中溶解混匀，并与脱去Fmoc保护基的MBHA树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Phe-resin；按照相同的方法依次缩合反应后续氨基酸，分别得到Fmoc-Lf4-resin和Fmoc-Lf5-resin，用含有体积分数1％TFA的DCM溶液脱去侧链保护基，得到Lf4NH₂-resin和Lf5NH₂-resin；分别将脂肪酸Lin、HOBT、HBTU和DIEA于DMF中溶解混匀，并与Lf4NH₂-resin、Lf5NH₂-resin进行缩合反应，得到Lin-Lf4NH₂-resin、Lin-Lf5NH₂-resin；将Lin-Lf4NH₂、Lin-Lf5NH₂从树脂上切割下来、纯化得到脂肪酸修饰抗菌肽Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂。

反向高效液相色谱C18柱测定合成肽纯度(>95％)，ESI-MS质谱确认Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂的分子量(图1)。

实施例2脂肽Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂的抗菌活性检测

根据实施例1中获得的抗菌肽和脂肽(Lf4NH₂,Lf5NH₂,Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂)，用超纯水配制浓度为2560μg/mL的抗菌肽溶液，2倍倍比稀释至终浓度2μg/mL，将不同浓度的抗菌肽溶液分别加到无菌96孔细胞培养板中，每孔10μL，每个样品三个平行，相同量(10μL)PBS作为阴性对照，空白对照组为无菌MH培养基。制备MIC板。菌株采用MH培养液体基培养，37℃振荡培养至生长对数期(OD_600nm＝0.4～0.6)，将菌液制备成浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经37℃孵育后的无菌MH液体培养基稀释至10⁵CFU/mL后，向制备好的MIC板样品孔中每孔加90μL菌悬液，37℃恒温孵育16-18h直至阴性对照孔出现肉眼可见的明显浑浊菌液，能够完全抑制细菌生长的最低浓度即为肽对受试菌株的MIC值。如出现跳孔或平行样间结果不一致情况，则重新测试。每个处理三个平行样。最小抑菌浓度(MIC)测定参照Tian等建立的微量肉汤稀释法，根据具体情况略有改动(Tian等，2009)。

结果如表2所示，脂肽Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂具有广谱抗菌活性。对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和猪葡萄球菌的MIC值为3.27-6.64μM，优于母体肽Lf4NH₂和Lf5NH₂(7.31-59.57μM)。对革兰氏阴性菌沙门氏菌的MIC值为3.27-3.32μM，优于母体肽Lf4NH₂和Lf5NH₂(7.31-14.89μM)，这说明脂肽Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂对革兰氏阳性菌和阴性菌株均表现出不同程度的抑菌效果。

表2抗菌肽和脂肽的MIC值测定

实施例3脂肽Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂的细胞毒性实验

MTT法检测抗菌肽和脂肽(Lf4NH₂，Lf5NH₂，Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂)，对Hacat细胞毒性。MTT可被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为不溶的蓝紫色结晶甲瓒，沉积于细胞内，而死细胞不发生此反应。DMSO可溶解细胞中的蓝紫色结晶甲瓒，溶解后可通过溶液吸光值间接反映活细胞数量。一定细胞数量范围内，结晶形成量与细胞数成正比。

37℃，5％CO₂及饱和湿度条件下，Hacat细胞培养于MEM完全培养基中。用移液枪吹打细胞，MEM完全培养基重悬细胞，以2.5×l0⁵ cells/mL密度接种于96孔板中，每孔100μL，设置3个重复。24h后移除培养基，每孔按浓度梯度加入100μL浓度为1、2、4、8、16、32、64、128、256μg/mL样品肽，对照孔加等量的PBS溶液。继续孵育24h后，移除培养基，PBS洗两次，每孔中加入100μL浓度为5mg/mL的MTT(避光操作)。将96孔板移至培养箱继续培养4h。弃MTT液后每孔加入150μL DMSO，振荡器振荡10min，待孔底结晶完全溶解，570nm波长测各孔吸光度。根据以下公式计算细胞存活率：存活率(％)＝处理组OD值/对照组OD值×100％(Li等,2017)。

结果如图2所示，脂肽Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂在低浓度1-16μg/mL范围内几乎没有细胞毒性。

实施例4脂肽Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂的热稳定性实验

样品肽溶液分别放置4℃、20℃、40℃、60℃、80℃和100℃环境孵育1h，冷却后分别取10μL样品肽和90μL对数期(10⁵CFU/mL)的猪葡萄球菌NCTC10350菌液中，阴性对照组为PBS代替抗菌肽的受试菌液，空白对照组为无菌MH培养基。每个处理三个平行样。将培养板置于37℃恒温孵育16-18h，直至阴性对照孔出现肉眼可见的明显浑浊菌液，观察经不同温度处理后肽的MIC变化情况(Chen等，2017)。

结果如表3所示，在不同的温度条件下，脂肽Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂的MIC值没有发生变化，表明其具有良好的热稳定性。

表3抗菌肽和脂肽经不同温度处理后的MIC值

实施例5脂肽Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂对猪葡萄球菌诱导的小鼠皮肤脓肿的治疗效果

6周龄SPF级BALB/c小鼠(15g/只)，将小鼠随机分为7组，每组15只，用剃毛刀将小鼠腹部毛剃掉，皮下注射生长对数期的猪葡萄球菌NCTC10350(7.5×10⁸CFU/mL，200μL/只)。感染48h后，小鼠腹部皮肤形成脓肿。将小鼠进行麻醉处理，接下来用肽Lf4NH₂,Lf5NH₂,Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂(浓度为10mg/mL)涂抹小鼠脓肿部位，每天涂抹两次，连续七天观察后取脓肿部位匀浆测皮肤荷菌量以及进行皮肤组织切片观察。未感染的小鼠作为空白对照组，仅用缓冲液(10％Na₃PO₄，45％PEG和45％甘油配制)和2％莫匹罗星(Mupirocin)分别作为阴性对照和阳性对照。

结果如图3和图4所示，Lin-Lf4NH₂(荷菌量下降百分比为28.13％)和Lin-Lf5NH₂(荷菌量下降百分比为33.07％)可显著降低小鼠脓肿皮肤荷菌量，优于Lf4NH₂(荷菌量下降百分比为18.77％)，Lf5NH₂(荷菌量下降百分比为18.93％)和抗生素莫匹罗星(荷菌量下降百分比为24.93％)。此外，根据小鼠皮肤组织切片观察，脂肽Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂可以显著减轻皮肤组织损伤。这些结果表明，脂肽Lin-Lf4NH₂和Lin-Lf5NH₂对小鼠脓肿模型的外用治疗效果优于母体肽Lf4NH₂和Lf5NH₂。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献:

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2.Arias,M.,McDonald,L.J.,Haney,E.F.,Nazmi,K.,Bolscher,J.G.M.,Vogel,H.J.,2014.Bovine and human lactoferricin peptides:chimeras and new cyclicanalogs.Biometals:an international journal on the role of metal ions inbiology，biochemistry，and medicine 27，935-948.

3.Bruni，N.,Capucchio，M.T.，Biasibetti，E.,Pessione,E.,Cirrincione,S.,Giraudo,L.,Corona，A.，Dosio，F.，2016.Antimicrobial Activity of Lactoferrin-Related Peptides and Applications in Human and Veterinary Medicine.Molecules21.

4.Ulvatne，H.,Haukland,H.H.,Olsvik,O.,Vorland,L.H.,2001.LactoferricinB causes depolarization of the cytoplasmic membrane of Escherichia coli ATCC25922and fusion of negatively charged liposomes.FEBS letters 492,62-65.

5.Andersson，D.I.，Hughes，D.，Kubicek-Sutherland，J.Z.，2016.Mechanismsand consequences of bacterial resistance to antimicrobial peptides.Drugresistance updates:reviews and commentaries in antimicrobial and anticancerchemotherapy 26,43-57.

6.Seo,M.D.,Won，H.S.，Kim，J.H.，Mishig-Ochir,T.,Lee,B.J.,2012.Antimicrobial peptides for therapeutic applications:a review.Molecules17,12276-12286.

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8.Tian Z.,Dong T.,Yang Y.,Teng,D.,Wang,J.,2009.Expression ofantimicrobial peptide LH multimers in Escherichia coli C43(DE3).ApplMicrobiol Biotechnol,2009,83(1):143-149.

9.Li,Z.，Mao，R.，Teng，D.,Hao，Y.，Chen，H.，Wang，X.，Wang，X.，Yang，N.,Wang,J.,2017.Antibacterial and immunomodulatory activities of insect defensins-DLP2 and DLP4 against multidrug-resistant Staphylococcus aureus.Sci Rep 7,12124.

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序列表

<110> 中国农业科学院饲料研究所

<120> 脂肽Lin-Lf4NH2和Lin-Lf5NH2及其应用

<130> KHP201110677.5

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Phe Lys Ala Trp Arg Trp Ala Trp Arg Trp Lys Lys Leu Ala Ala Pro

1 5 10 15

Ser

<210> 2

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Phe Lys Ala Phe Arg Trp Ala Trp Arg Trp Lys Lys Leu Ala Ala Pro

1 5 10 15

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