一种提高乳铁蛋白热稳定性的方法
阅读说明：本技术 一种提高乳铁蛋白热稳定性的方法 (Method for improving heat stability of lactoferrin ) 是由 于景华 王淑晨 韩翼宇 刘晓辉 于 2020-12-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种提高乳铁蛋白热稳定性的方法,所述方法包括如下步骤：(1)以乳铁蛋白为原料,经过透析利用所述原料制备出无铁乳铁蛋白；(2)向所述无铁乳铁蛋白中加入铁氮基三乙酸来制备出高铁饱和度的乳铁蛋白。本发明方法利用乳铁蛋白在酸性缓冲溶液中透析制备出无铁乳铁蛋白,然后向无铁乳铁蛋白中铁氮基三乙酸溶液制备出了高铁饱和度的乳铁蛋白,所述高铁饱和度的乳铁蛋白加热后的稳定性得到提高。(The invention relates to a method for improving the heat stability of lactoferrin, which comprises the following steps: (1) taking lactoferrin as a raw material, and preparing the iron-free lactoferrin by using the raw material through dialysis; (2) adding iron nitrilotriacetic acid into the iron-free lactoferrin to prepare the lactoferrin with high iron saturation. The method prepares the iron-free lactoferrin by dialyzing the lactoferrin in an acidic buffer solution, then prepares the lactoferrin with high iron saturation from a solution of iron nitrilotriacetic acid in the iron-free lactoferrin, and improves the stability of the lactoferrin with high iron saturation after being heated.)
技术领域
本发明属于食品技术领域，具体涉及一种提高乳铁蛋白热稳定性的方法。
背景技术
乳铁蛋白主要存在于哺乳动物的外分泌液中，如乳汁、泪液、唾液、汗液、胰液、胆汁等。以乳牛为例，牛乳铁蛋白是初乳形成阶段、泌乳期、涸乳期和患乳房炎期间乳房腺体分泌物中主要的糖蛋白之一。乳铁蛋白具有多种生物活性功能：广谱的抗菌性质，增强机体的抗病毒、抗氧化和免疫能力，防治感染性疾病、刺激双歧杆菌生长、维持肠道菌群的平衡、增强铁的传递和吸收等。已经成为食品界，特别是乳品界关心的热点。
乳铁蛋白是一种较理想的功能性食品配料。但是，长期以来，研究者们认为乳铁蛋白容易受热失活，不利于乳品加工。例如，牛乳铁蛋白在pH值为6.6、温度为65～69℃时就开始失活；人乳铁蛋白在70℃加热处理15～30分钟就已经完全失活。一般通过用糖分子与蛋白质的共价结合方法来提高乳铁蛋白分子的热稳定性。Peinado等人通过乳铁蛋白颗粒与阴离子多糖(藻酸盐，角叉菜胶或果胶)的静电络合来制造亚微米生物聚合物颗粒，他们发现藻酸盐，角叉菜胶和果胶等阴离子多糖可以防止乳铁蛋白对热诱导的变性，从而保持其铁结合能力。Kang Xu等将秋葵多糖和乳铁蛋白结合形成复合物来防止乳铁蛋白加热后二级结构和三级结构的丧失。这些多糖的添加会改变乳铁蛋白的粒径大小，而且这些多糖大部分都是乳化剂和增稠剂，它们的添加会影响乳铁蛋白在加工中的应用。本发明通过改变乳铁蛋白本身来提高它的热稳定性。乳铁蛋白中铁结合的多少会影响乳铁蛋白的分子构象，与无铁乳铁蛋白相比，具有结合铁的乳铁蛋白具有更紧凑的结构。乳铁蛋白一般因为聚集而失活，所述聚集是通过非共价相互作用和游离巯基残基的分子间硫醇/二硫化物反应的组合进行的。乳铁蛋白具有两个裂片，这两个裂片会在铁饱和的状态下闭合，从而可以将两个蛋白质裂片核心的非共价位点隐藏起来，减少分子间的相互作用和不溶性聚集体的形成。高铁饱和度的乳铁蛋白会在较高温度下稳定，这种稳定的表现之一就是保持二硫化物键的完整性。因此，可以通过提高乳铁蛋白的铁饱和度来提高乳铁蛋白的热稳定性。
发明内容
本发明目的在于针对乳铁蛋白对热不稳定等难题。
本发明提供了一种提高乳铁蛋白热稳定性的方法，该方法利用天然乳铁蛋白制备出无铁乳铁蛋白，然后由无铁乳铁蛋白制备出高铁饱和度的乳铁蛋白来提高乳铁蛋白的热稳定性。
具体地说，本发明提供了一种提高乳铁蛋白热稳定性的方法，所述方法包括如下步骤：(1)以乳铁蛋白为原料，经过透析利用所述原料制备出无铁乳铁蛋白；(2)向所述无铁乳铁蛋白中加入铁氮基三乙酸来制备出高铁饱和度的乳铁蛋白。
优选的是，在步骤(1)中，将所述乳铁蛋白溶解在水中制备成水溶液，然后将所述水溶液进行透析，再将经过透析得到的乳铁蛋白溶液进行干燥，得到所述无铁乳铁蛋白。
另外优选的是，所述干燥为真空干燥。
另外优选的是，所述透析采用截留范围为8-14kDa的透析袋进行。
另外优选的是，所述透析的透析时间为24小时，其中前12小时的缓冲溶液为PH＝3-5的酸性缓冲液；后12小时的缓冲溶液为水；
另外优选的是，所述透析在37℃以下的温度进行，并在透析过程中保持恒定的转速。
另外优选的是，所述酸性缓冲液选自由柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液组成的组的一种。
另外优选的是，步骤(2)包括如下子步骤：(A)将所述无铁乳铁蛋白溶解于含有NaCl的Tris-Hcl缓冲溶液中配制成1％的溶液，用HCl调节PH为7.0-7.8 之间，制得无铁乳铁蛋白溶液；(B)向所述无铁乳铁蛋白溶液加入FeNTA溶液进行反应，然后干燥，得到所述高铁饱和度的乳铁蛋白。
另外优选的是，在步骤(B)中，所述FeNTA溶液利用(i)硝酸铁和(ii) 次氮基三乙酸或次氮基三乙酸二钠盐配制而成；优选的是，所述FeNTA溶液利用(i)9.9mM硝酸铁溶液和(ii)8.5mM次氮基三乙酸或次氮基三乙酸二钠盐溶液配制而成。
另外优选的是，所述乳铁蛋白为天然乳铁蛋白。
在一些具体的实施方式中，本发明方法包括如下步骤：
(1)将天然的乳铁蛋白溶解在超纯水中制备成溶液(50-100mg/mL)，在磁力搅拌器上充分溶解，将溶液放在截留范围为8-14kDa的透析袋中；
(2)前12小时的缓冲溶液为PH＝3-5的酸性缓冲液，如柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液等，后12小时的缓冲溶液为水，在37℃以下的温度进行，保持恒定的转速；
(3)将透析好的乳铁蛋白溶液进行真空冷冻干燥，得到无铁乳铁蛋白；
(4)将无铁乳铁蛋白溶解于含有Nacl的Tris-Hcl缓冲溶液中配制成1％的溶液，用Hcl调节PH为7.0-7.8；
(5)用超纯水溶解9.9mM硝酸铁和8.5mM次氮基三乙酸或次氮基三乙酸二钠盐配制成新鲜的铁氮基三乙酸(FeNTA)溶液，用固体碳酸氢钠将pH调节至7.0。将FeNTA按比例加入到无铁乳铁蛋白溶液中，室温下反应1小时；
(6)将反应好的溶液进行真空冷冻干燥，得到高铁饱和度的乳铁蛋白。
本发明方法以乳铁蛋白例如天然乳铁蛋白为原料，制备出无铁乳铁蛋白，然后由无铁乳铁蛋白制备出高铁饱和度的乳铁蛋白来提高乳铁蛋白的热稳定性。
本发明取得的优点和积极效果为：
本发明以天然乳铁蛋白为原料，利用天然乳铁蛋白在酸性缓冲溶液中透析制备出无铁乳铁蛋白，然后向无铁乳铁蛋白中按比例加入新鲜配制的铁氮基三乙酸溶液制备出了高铁饱和度的乳铁蛋白，通过稳定性的测定，高铁饱和度的乳铁蛋白加热后的稳定性有所提高。
附图说明
图1显示了样品整体的稳定性系数。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在酸性溶液中，乳铁蛋白更容易将铁离子释放出来，所以使用酸性缓冲液将天然乳铁蛋白透析成无铁乳铁蛋白。乳铁蛋白能在碳酸根离子的存在下结合铁离子，所以使用碳酸氢钠调节PH，在碳酸根离子的存在下加入铁离子，使乳铁蛋白结合铁形成高铁饱和度的乳铁蛋白。
实施例
下文将以实施例的形式对本发明的技术方案进行举例说明，但是本发明的保护范围不限于这些实施例。
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
在实施例中，以铁饱和度为11％的天然乳铁蛋白为原料，制备出无铁乳铁蛋白，然后由无铁乳铁蛋白制备出高铁饱和度的乳铁蛋白来提高乳铁蛋白的热稳定性。具体步骤如下：
⑴将天然的乳铁蛋白溶解在超纯水中制备成50mg/ml浓度的溶液，在磁力搅拌器上充分溶解，将溶液放在截留范围为8-14kDa的透析袋中；
⑵将装有天然乳铁蛋白溶液的透析袋放进缓冲溶液中透析24小时，前12 小时的缓冲溶液为PH＝3-5的酸性缓冲液，如柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液等，后12小时的缓冲溶液为水，在室温下进行，保持恒定的转速；
⑶将透析好的乳铁蛋白溶液进行真空冷冻干燥，得到无铁乳铁蛋白，测定其饱和度为4％；
⑷将无铁乳铁蛋白溶解于含有Nacl的Tris-Hcl缓冲溶液中配制成1％的溶液，用Hcl调节PH为7.0-7.8；
⑸用超纯水溶解9.9mM硝酸铁和8.5mM次氮基三乙酸二钠盐或次氮基三乙酸配制成新鲜的铁氮基三乙酸(FeNTA)溶液，用固体碳酸氢钠将pH调节至 7.0。将FeNTA加入到乳铁蛋白溶液中，计算所需的量，以实现铁：乳铁蛋白的摩尔比分别为0.3:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.8:1。将混合物在室温下反应1小时；
⑹将反应好的溶液进行真空冷冻干燥，得到高铁饱和度的乳铁蛋白，它们的铁饱和度分别为16％、22％、25％、30％、40％。
(7)将制备的不同铁饱和度的乳铁蛋白溶解于超纯水中制备成1mg/ml的溶液，85℃加热10min，立即冷却备用。
(8)稳定性测定
通过分散体系稳定性分析仪测定加热后乳铁蛋白的稳定性，将加热后的溶液加入Turbiscan Lab稳定性分析仪专用的柱形玻璃瓶中以备测量。该仪器的检测原理是：以脉冲近红外为光源，利用两个光学探测器(透射光检测器和背散射光检测检测器)从玻璃瓶底部到顶部同步扫描，每间隔一定的高度进行一次数据采集，获得透射光和背散射光信号对样品高度的函数图像，同时也可以获得根据背散射光计算的稳定动力学参数(简称TSI)随扫描时间的变化曲线。样品的扫描参数为：样品温度设为25℃，每30min扫描一次，持续扫描8次，记录数据。稳定性系数TSI值反映了样品中颗粒物质随时间的变化情况，变化幅度越大，TSI值就越大，而体系就越不稳定，即TSI值与样品的稳定性成负相关。
图1为加热后乳铁蛋白的稳定性系数，结果显示4％和11％铁饱和度的乳铁蛋白的稳定性系数最高，说明它们加热后的稳定性最差，而通过本发明的方法得到的高一点铁饱和度的乳铁蛋白的稳定性系数较低，说明高铁饱和度的乳铁蛋白加热后的稳定性较好，随着铁饱和度的升高，乳铁蛋白加热后的稳定性系数降低，说明铁饱和度高的乳铁蛋白加热后的稳定性要优于铁饱和度低的乳铁蛋白。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。