类人乳铁蛋白肽及其应用
阅读说明：本技术 类人乳铁蛋白肽及其应用 (Human lactoferrin-like peptide and application thereof ) 是由 项琪 黄亚东 肖雪 倪佩红 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种类人乳铁蛋白肽,其分子结构为人乳铁蛋白N端α-螺旋区14-31残基的可溶性多肽Lfcin结构类似物,保留有与Lfcin相同的折叠结构,所述类人乳铁蛋白肽为具有不大于35个氨基酸长度的多肽,其氨基酸序列包括含有(1)或(2)的氨基酸序列。类乳铁蛋白肽与来源于人乳铁蛋白N-末端α-螺旋区或牛乳铁蛋白N-末端α-螺旋区结构类似,通过结构模拟设计系列类似结构物,利用基因工程获取多肽产物,测试合成的多肽产物在较低浓度范围内对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、假单胞菌和痤疮丙酸杆菌等病原菌具有显著抑制活性,但不影响乳酸杆菌等益生菌的正常生长,对皮肤微生态具有调节作用。可应用于大健康,如化妆品和食品等领域。(The invention discloses a human lactoferrin-like peptide, the molecular structure of which is a soluble polypeptide Lfcin structural analogue of human lactoferrin N-terminal alpha-helical region residues 14-31, a folding structure which is the same as that of Lfcin is reserved, the human lactoferrin-like peptide is a polypeptide with the length of not more than 35 amino acids, and the amino acid sequence of the human lactoferrin-like peptide comprises the amino acid sequence containing (1) or (2). The lactoferrin-like peptide is similar to a structure of an N-terminal alpha-helical region derived from human lactoferrin or an N-terminal alpha-helical region derived from bovine lactoferrin, a series of similar structures are designed through structural simulation, a polypeptide product is obtained through genetic engineering, and the synthesized polypeptide product is tested to have remarkable inhibitory activity on pathogenic bacteria such as escherichia coli, staphylococcus aureus, staphylococcus epidermidis, pseudomonas and propionibacterium acnes in a lower concentration range, but the normal growth of probiotics such as lactobacillus is not influenced, so that the lactoferrin-like peptide has a regulating effect on skin micro-ecology. Can be used in the fields of health promotion, such as cosmetics and food.)
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及类人乳铁蛋白的制备方法及其应用。
背景技术
乳铁蛋白肽(Lactoferricin，Lfcin)是乳铁蛋白经胃液消化后从N端释放的具有21-45个氨基酸残基短肽，其功能除不能结合铁离子外，具备乳铁蛋白的所有生物学活性。在乳铁蛋白肽的诸多生理功能中，最引人注目的是其抗菌作用，其抗菌作用广谱，包括许多革兰氏阴性、阳性病原菌和真菌，例如大肠杆菌、绿脓杆菌、金色葡萄球菌、链球菌和白色念珠菌等，目前对乳铁蛋白肽的抗菌机理主要有两种观点：一种是阻断细菌对铁的利用，另一种是带正电荷的乳铁蛋白肽与细菌膜上的磷脂基团相互作用形成穿孔，导致细菌内容物外泄，细胞死亡。乳铁蛋白肽还能抑制铁诱导的脂质过氧化，减少氧自由基的产生。乳铁蛋白肽还具有免疫调节功能，因其多种生物功能受到广泛关注，成为研究与开发的热点。但其对皮肤微生态微生物调节功能未见报道。目前乳铁蛋白肽主要通过水解经色谱法、超滤法、盐析、酸沉淀等方法制得的乳铁蛋白，再通过离心、阳离子或疏水性亲和层析、脱盐、冷冻干燥制得，制备工艺复杂，得率低，成本较高。
现有研究表明牛乳铁蛋白肽具有比人乳铁蛋白肽更强的抗菌活性，前者是后者的400多倍，我们分析牛乳铁蛋白肽与人乳铁蛋白肽序列结构，基于最优的疏水强度和净电荷数范围，进行结构模拟与设计，设计了一系列基于人乳铁蛋白肽二级结构的新型改良肽，通过基因工程重组表达结合两步层析法获得系列类人乳铁蛋白肽，可以选择性抑制不利于皮肤完整性的有害菌，营养益生菌，维持皮肤微生态平衡。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一系列类人乳铁蛋白肽及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
类人乳铁蛋白肽，其分子结构为人乳铁蛋白N端α-螺旋区14-31残基的可溶性多肽Lfcin结构类似物，保留有与Lfcin相同的折叠结构，所述类人乳铁蛋白肽为具有不大于35个氨基酸长度的多肽，其氨基酸序列包括含有(1)或(2)的氨基酸序列：
(1)包含类人乳铁蛋白N端α-螺旋区14-31残基的可溶性多肽所示的氨基酸序列SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.7；
(2)SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或一个以上且具有与SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。
上述类人乳铁蛋白肽优选的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.7所示，编码的核苷酸序列如NO.8-SEQ ID NO.14所示。
含有上述核苷酸序列的表达载体，宿主载体为大肠杆菌、酵母、芽孢杆菌、昆虫或中国仓鼠卵巢细胞。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明的类乳铁蛋白肽与来源于人乳铁蛋白N-末端α-螺旋区(45个氨基酸残基)或牛乳铁蛋白N-末端α-螺旋区(23个氨基酸残基)结构类似，通过结构模拟设计系列类似结构物，利用基因工程重组表达或多肽合成方法获取多肽产物，测试合成的多肽产物在较低浓度范围内(5-25μmol.L-1)对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、假单胞菌和痤疮丙酸杆菌等病原菌具有显著抑制活性，但不影响乳酸杆菌等益生菌的正常生长，对皮肤微生态具有调节作用。筛选的多肽产物可应用于大健康，如化妆品和食品等领域。
附图说明
图1为Phyre2软件模拟S1-S7的空间结构图。
图2为S1-S7融合sumo基因进行重组分泌表达图。
Lane1和6为未诱导胞外，2为SD1，3为SD2，4为SD3，5为SD4，7为SD5，8为SD6，9为SD7诱导72小时胞外。
图3为人乳铁蛋白肽S1及其改良肽S2-S7在工作浓度(5μmol.L-1)条件下分别对表皮葡萄球菌(Se)、痤疮丙酸杆菌(PA)、假单胞菌(Pse)和金黄色葡萄球菌(Sa)和乳酸杆菌(La)生长的作用情况。
图4为透射电镜观察乳铁蛋白肽对痤疮杆菌生长抑制作用；
A为对照组；B为S2处理组。
图5为斑贴实验，其中A为PBS，B为空白，C为实施例2中类人乳铁蛋白肽S2原液样品，D为C样品对照缓冲盐。
图6为受试者使用实施例2中类人乳铁蛋白肽S2四周前后VISA面部图片；其中，A为使用前，B为使用四周后。
图7为受试者使用实施例2中类人乳铁蛋白肽S2四周前后面部红色素、油脂含量、紫质等参数变化统计情况，W0为使用前，W4为使用四周后。
具体实施方式
：
实施例1：类人乳铁蛋白肽结构设计
人乳铁蛋白肽LfcinH是由人乳铁蛋白的N末端α螺旋区14-31经蛋白酶消化后形成(TKCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR)，由链内二硫键形成具有两亲构象的发夹结构，疏水核呈“T形”排列。Bellamy等研究发现牛乳铁蛋白肽LfcinB(FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRR)抑菌和杀菌作用与人乳铁蛋白肽LfcinH比较，前者是后者的400多倍；分析其结构发现LfcinB具有更多正电荷净电荷数和更强的疏水性强度，正电荷数与疏水性强度决定其抗菌能力，但这种特性具有限制性，净电荷增加只在一定范围内提高其抗菌活性，抗菌肽疏水性同样如此，疏水性要适中，既可溶解于水中快速运送到靶微生物(要求低的疏水性)，又要与细胞质膜双分子层的疏水区域作用(要求高的疏水性)，因此在LfcinH衍生肽结构优化设计中，存在一个最优的疏水强度和净电荷数范围，在这个范围内，疏水性和正电荷数与抗菌活性呈正相关。利用Phyre2软件模拟肽的空间结构；蛋白疏水分析工具和DNAstar软件计算多肽亲水值(GRAVY值)和净正电荷数，使用APD抗菌肽数据库和CAMP抗菌肽数据库的prediction工具预测衍生肽的抗菌活性，获得最优LfcinH衍生肽S2-S7，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.7所示。
S1-S7多肽序列信息设计如表1所示：
表1
实施例2：类乳铁蛋白肽重组表达
采用sumo融合表达系统进行大肠表达或酵母分泌表达，由捷瑞合成编码融合sumo标签DNA序列片段SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6、SD7的表达质粒(SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6、SD7的序列分别如SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.14所示)，热击转化大肠表达菌BL21或电击转化酵母菌GS115,抗性筛选阳性转化子，分别用IPTG或甲醇诱导表达筛选高表达菌株，经过两步Ni柱纯化和sumo酶切获得单体蛋白S1-S7。S1-S7融合sumo基因进行重组分泌表达如图2所示。
实施例3：对皮肤表皮微生物菌群选择性作用
本实施例中将实施例2中纯化的人乳铁蛋白肽S1及其6条改良肽(S2-S7)，采用肉汤稀释法分别测定对皮肤表皮微生物菌群优势菌群表皮葡萄球菌(Se)、痤疮丙酸杆菌(PA)和假单胞菌(Pse)，次优势菌群乳酸杆菌(La)、金黄色葡萄球菌(Sa)的最小抑菌浓度。
具体步骤如下：将培养至对数生长期的上述系列菌液稀释至2×105～7×105cfu.ml-1；用PBS(磷酸钠缓冲溶液，pH值7.0)将人乳铁蛋白肽S1及其6条改良肽(S2-S7)配制为最高待测浓度10倍的储备液，再进行梯度稀释，得到系列稀释浓度的乳铁蛋白肽溶液；向灭菌试管中分别加入2ml稀释的菌悬液，并分别加入200μl相应浓度的待测乳铁蛋白肽，以无菌液培养基与水混合体系作为空白，以氨苄青霉素为阳性对照，纯水为阴性对照。置于37度或30度振荡培养箱中保温培养24h后观察结果，以能阻止细菌生长的最小乳铁蛋白肽浓度作为MIC。
实验结果如表3：
表3乳铁蛋白肽体外最小抑菌浓度(MICμmol.L-1)
名称
Se
PA
Pse
Sa
La
S1
>250
40
>250
>250
>250
S2
5
5
5
150
>250
S3
20
20～40
20
200～250
>250
S4
20
100
20
>250
>250
S5
20
40
>250
>250
>250
S6
20
5～20
5
>250
>250
S7
>250
>250
>250
>250
>250
由实施例3的实验结果表3可知：人乳铁蛋白肽S1及其改良肽S2-S6分别对表皮葡萄球菌(Se)、痤疮丙酸杆菌(PA)、假单胞菌(Pse)和金黄色葡萄球菌(Sa)等病原菌具有不同程度的抑制作用，随着改良肽的正电荷数的减少其抑菌作用降低，低于6个正电荷数失去抑菌活性，如示例S7在较高浓度250μmol.L-1下对表皮葡萄球菌(Se)、痤疮丙酸杆菌(PA)、假单胞菌(Pse)和金黄色葡萄球菌(Sa)抑制作用不明显。改良肽S2抑菌作用最强，对表皮葡萄球菌(Se)、痤疮丙酸杆菌(PA)、假单胞菌(Pse)和金黄色葡萄球菌(Sa)的MIC值分别为5、5、5、150μmol.L-1。人乳铁蛋白肽S1及其改良肽S2-S6对益生菌乳酸杆菌(La)生长无影响，而且一定程度还可促进乳酸杆菌(La)生长，起营养作用(见图3La所示)。
实施例4：乳铁蛋白肽对痤疮杆菌抑制作用机制
将实施例2制备的对痤疮丙酸杆菌作用最强的类人乳铁蛋白肽S2配成浓度为10μg.ml-1对对数期培养的痤疮丙酸杆菌作用4小时后取样固定，进行透射电镜制片观察，结果见图4，类人乳铁蛋白肽S2对痤疮丙酸杆菌生长抑制作用主要是由于对细菌细胞壁和细胞膜造成穿孔，导致大量溶质外泄，细菌大量死亡。
实施例5：类人乳铁蛋白肽对皮肤细胞的刺激
(1)类人乳铁蛋白肽对体外表皮细胞的细胞毒性
按照《中国药典》2015版第三部通则生物学活性测定法--MTT法测定乳铁蛋白肽一定作用浓度范围内对3T3和Hacat细胞的细胞毒性。
表4乳铁蛋白肽对皮肤细胞的细胞毒性
结果显示：乳铁蛋白肽S1及其6条改良肽在工作浓度(5-20μmol.L-1)条件下对皮肤细胞基本无刺激。
(2)乳铁蛋白肽对正常皮肤的刺激作用
采用人体皮肤斑贴试验测试类人乳铁蛋白肽对正常皮肤的刺激作用。
选用18名志愿者，年龄20～45岁，皮肤健康，无皮肤病过敏史，符合受试者志愿入选标准，随机均分为2组进行斑贴实验，每组使用一种样品。选用合格的斑贴器，以封闭式斑贴实验方法，将实施例2中类人乳铁蛋白S2(5μg/ml)蛋白液与对照溶剂(50mM磷酸盐(pH7.0)各50μl均匀涂抹于斑贴器内，外用专用胶带贴覆于受试者后背，24h后去除受试物，分别在去除后第0、0.5、24、48h观察皮肤反应，按照《化妆品卫生规范》中皮肤反应分级标准记录其结果。如图5所示。
人体皮肤斑贴实验结果表明：在第0、0.5、24、48小时观察这18名受试者皮肤反应，其中0例出现皮肤不良反应，说明含有类人乳铁蛋白肽的蛋白原液安全无刺激。
实施例6：乳铁蛋白肽在皮肤上的应用
选取身体健康符合条件的实验对象30名，每天涂抹含5ug/ml的类人乳铁蛋白肽S2原液2次，用VISIA面部图像观察受试者使用四周后(W4)袪痘效果、CK皮肤测试仪检测面部皮肤紫质特征，结果如图6和图7所示。使用类人乳铁蛋白肽S2原液4周后，30名痘痘肌志愿者面部痤疮红色素值比使用前(W0)下降39.8％，油脂分泌量减少41.9％，有极显著性差异(p<0.01)，面部紫质特征计数比使用前减少了50.8％，有极显著性差异(p<0.01)，说明受试者面部的卟啉明显减少，卟啉是细菌的代谢物，会堵塞毛孔导致痤疮，使用类人乳铁蛋白肽S2原液可以抑制面部病原菌的生长，调节面部皮肤微生态，有效改善痤疮。
序列表
<110> 广州暨南大学医药生物技术研究开发中心有限公司，广州肽能基因生物工程有限公司
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