一种预防骨质疏松乳铁蛋白糖基化产物的制备方法
阅读说明：本技术 一种预防骨质疏松乳铁蛋白糖基化产物的制备方法 (Preparation method of lactoferrin-based product for preventing osteoporosis ) 是由 张兰威 张基亮 韩雪 公丕民 陈世伟 于 2020-01-21 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种预防骨质疏松乳铁蛋白糖基化产物的制备方法,具体顺序为配制乳铁蛋白溶液,然后与单糖在特定条件下糖基化,获得两种糖基化产物比乳铁蛋白促成骨细胞增殖活性分别提高15.7%和11.3%,抑制细胞凋亡分别提高3.1%和1.2%、碱性磷酸酶分泌分别提高23.2%和20.1%,细胞周期中分别延长G2/M期73.2%和63.3%、S期68.3%和72.1%,缩短G1/G0期分别12.3%和12.0%,使JNK蛋白磷酸化水平表达分别提高-37.5%和28.8%、使ERK1/2蛋白磷酸化水平的表达提高100.9%和66.0%、使p38蛋白磷酸化水平的表达提高2.7%和74.3%,可以有效地提高牛乳铁蛋白抑制骨质疏松功能。该制备方法只需一步操作就可以完成,条件容易控制、适合产业化,修饰后的糖基化产物溶解性良好。经鉴定这两种糖基化蛋白在Lys47、Lys329和Lys627有共同的结合位点。(The invention relates to a method for preparing lactoferrin-based products for preventing osteoporosis, which comprises the steps of preparing a lactoferrin solution, then glycosylation is carried out on the two glycosylation products and monosaccharide under specific conditions to obtain two glycosylation products, the osteoblast proliferation promoting activity of the two glycosylation products is respectively improved by 15.7 percent and 11.3 percent compared with lactoferrin, the apoptosis is respectively improved by 3.1 percent and 1.2 percent, the secretion of alkaline phosphatase is respectively improved by 23.2 percent and 20.1 percent, the G2/M period is respectively prolonged by 73.2 percent and 63.3 percent, the S period is respectively prolonged by 68.3 percent and 72.1 percent, the G1/G0 period is respectively shortened by 12.3 percent and 12.0 percent, the expression of the phosphorylation level of JNK protein is respectively improved by-37.5 percent and 28.8 percent, the expression of the phosphorylation level of ERK1/2 protein is improved by 100.9 percent and 66.0 percent, the expression of the phosphorylation level of p38 protein is respectively improved by 2.7 percent and 74.3 percent, and the function of bovine lactoferrin for inhibiting osteoporosis can be. The preparation method can be completed by only one-step operation, the conditions are easy to control, the method is suitable for industrialization, and the modified glycosylation product has good solubility. The two glycosylated proteins were identified to have a common binding site at Lys47, Lys329 and Lys 627.)
技术领域
本发明属于食品蛋白改性技术领域，本发明涉及一种预防骨质疏松乳铁蛋白糖基化产物的制备方法。该方法获得的产物具有显著的抑制骨质疏松活性，并且其中一种产物使细胞增殖途径与天然人乳铁蛋白的途径一致。。
背景技术
对于婴儿而言，母乳蛋白是最为理想的，但是由于多种原因只能用牛乳或其他动物乳来替代母乳喂养。乳铁蛋白是乳中具有多功效性的糖蛋白，其生物学性质包括预防骨质疏松、抗微生物性、抗炎性、抗癌性、免疫调节性和酶活性等，目前乳铁蛋白被广泛应用于保健食品、配方奶粉、医药等领域中，但资源有限，因此提高乳铁蛋白生物学活性是缓解乳铁蛋白供需矛盾的有效途径。本发明通过糖基化获得和人乳铁蛋白相同作用途径的牛乳铁蛋白糖基化产物，旨在提高牛乳铁蛋白的促成骨细胞增殖活性，达到预防骨质疏松的作用。
增加乳铁蛋白活性，提高其利用效率，从而降低对乳铁蛋白的需求量受到广泛关注。目前，有一篇文献认为，乳铁蛋白的糖基化修饰可以提高其抗氧化性，另一篇则是报道了糖基化修饰后的乳铁蛋白其消化性有所改变。
利用糖基化技术来获得具有高活性抑制骨质疏松的乳铁蛋白糖基化产物、同时其增殖途径与天然人乳铁蛋白一致已经成为一个新的方向。如何稳定提高活性、研究结构与活性之间的关系是本领域急需解决的技术问题。
发明目的：提供一种预防骨质疏松乳铁蛋白糖基化产物的制备方法，获得具有高活性抑制骨质疏松的乳铁蛋白糖基化产物。
技术问题：本发明通过糖基化牛乳铁蛋白技术，获得的产物和天然人乳铁蛋白具有相同的促进骨细胞增殖作用途径，提高了其抑制骨质疏松的活性。
技术方案：一种预防骨质疏松乳铁蛋白糖基化产物的制备方法，该方法工艺简单、易于操作、提高抑制骨质疏松的活性、具有和天然人乳铁蛋白相同的作用途径，按照以下步骤进行：
（1）乳铁蛋白糖基化的制备：将一定量的牛乳铁蛋白用去离子水溶解，按照质量比1:1-1:10的比例加入葡萄糖、果糖或半乳糖，充分溶解后，将该溶液置于水浴锅中，于40-90℃反应12-80 h，反应结束后将溶液置于-30-20℃的环境中10-40 min；
（2）糖基化产物预处理：用分子量为5-50 kDa的透析袋，体积为3-5 L的去离子水透析48-96 h。根据BCA试剂盒测定的结果，将糖基化产物的浓度调整至0.5-2.0 mg/mL，0.22 μm滤膜除菌备用；
（3）糖基化产物对成骨细胞增殖作用：将100 μL浓度为1×104-1×106个/mL的成骨细胞溶液于96孔板中过夜培养，加入不同的糖基化产物进行检测，两种糖基化产物比未修饰的乳铁蛋白显著地促成功细胞增殖，二者的通路分别与天然牛乳铁蛋白和天然人乳铁蛋白一致。
具体方案中的步骤（1）乳铁蛋白糖基化产物制备，将一定量的牛乳铁蛋白用去离子水溶解，按照质量比1:0.1-1:3的比例加入单糖、充分溶解后，将该溶液置于水浴锅中，于40-90℃反应12-80 h，反应结束后将溶液置于-30-20℃的环境中10-40 min；步骤（2）糖基化产物预处理，用分子量为5-50 kDa的透析袋，体积为3-5 L的去离子水透析48-96 h。根据BCA试剂盒测定的结果，将糖基化产物的浓度调整至0.5-2.0 mg/mL，0.22 μm滤膜除菌备用。
所述的乳铁蛋白糖基化产物较未修饰的乳铁蛋白的抑制骨质疏松活性显著地提高。
乳铁蛋白和单糖反应至相应时间后，将盛有反应溶液的容器置于-20℃预冻20min是使反应停止，避免多余产物的生成。
乳铁蛋白和单糖反应至相应时间是指乳铁蛋白与果糖反应是24 h、与半乳糖反应是48 h，然后终止反应。
乳铁蛋白糖基化产物比未修饰乳铁蛋白的促成骨细胞增殖活性增加了37.5%，蛋白质印迹结果显示该产物可以使JNK蛋白磷酸化水平升高，并且降低ERK和p38蛋白的磷酸化水平。
乳铁蛋白糖基化产物使成骨细胞增殖途径与天然牛乳铁蛋白和人乳铁蛋白一致。
该方法可以获得促成骨细胞增殖活性好、途径一致，且制备的方法简单有效。
（1）本发明提供了一种预防骨质疏松乳铁蛋白糖基化产物的制备方法，该方法制备牛乳铁蛋白糖基化产物方法简单，促成骨细胞增殖效果好，并且与天然牛乳铁蛋白和人乳铁蛋白的增殖途径一致。
（2）本发明所获得的乳铁蛋白糖基化产物溶解性良好、抑制骨质疏松活性高。
（3）本发明所获得的糖基化产物的MAPK细胞增殖通路分别与天然牛乳铁蛋白和天然人乳铁蛋白一致。
（4）本发明所获得的目标产品是各工序及参数相辅相成、共同协同作用的结果，工序简单仅需一步即可获得目的蛋白。
本发明所获得的乳铁蛋白糖基化产物各项指标均符合食品安全国家标准食品营养强化剂乳铁蛋白国家标准GB 1903.17-2016中理化标准。
实验结果
试验1：不同制备条件对糖基化产物的影响
在水浴条件下制备糖基化产物，将制备的糖基化产物进行SDS-PAGE电泳，观察糖基化产物生成情况，结果见图1。
结果显示：由图1可知，乳铁蛋白与糖以质量比为1:0.5时，反应24 h时生成的糖基化反应产物的量较少，反应48 h时糖基化反应产物的量逐步增多，而反应72 h时糖基化反应产物的量大幅增加。乳铁蛋白与糖以浓度比为1:1时，与乳铁蛋白与糖以质量比为1:0.5时获得糖基化反应产物的量类似，反应48 h糖基化反应产物的量大幅增加，而72 h时糖基化反应产物的量略有下降。乳铁蛋白与糖以质量比为1:2时，反应24 h已经生成了大量的糖基化反应产物，反应继续进行至48 h及72 h，糖基化反应产物的量增加速度不明显。因此，乳铁蛋白与糖在60℃发生糖基化反应时，糖基化反应产物生成量与乳铁蛋白质量比及反应时间各不相同。随着乳铁蛋白与糖质量比的增加，糖基化反应产物生成的速度也增加。
试验2：糖基化产物作用细胞增殖途径
不同的物质可以通过不同的途径使细胞达到相同的生长效果，两种糖基化产物促进成骨细胞增殖MAPK途径，以及调节关键蛋白磷酸化水平结果见图2所示。
结果显示：由图2可知，24F1和牛乳铁蛋白调节MAPK途径的方式一致，都是通过上调p-ERK1/2和下调p-p38和p-JNK来促进成骨细胞增殖；48A1和人乳铁蛋白调节MAPK途径的方式一致，都是通过上调p-ERK1/2、p-p38和p-JNK来促进成骨细胞增殖。
实施例1：一种预防骨质疏松乳铁蛋白糖基化产物的制备方法，具有良好的抑制骨质疏松的活性，按照以下步骤进行：
（1）糖基化产物的制备：将一定量的牛乳铁蛋白用去离子水溶解，按照质量比1:0.1-1:3的比例加入单糖、充分溶解后，将该溶液置于水浴锅中，于40-90℃反应12-80 h，反应结束后将溶液置于-30-20℃的环境中10-40 min；
（2）糖基化产物预处理：用分子量为5-50 kDa的透析袋，体积为3-5 L的去离子水透析48-96 h。根据BCA试剂盒测定的结果，将糖基化产物的浓度调整至0.5-2.0 mg/mL，0.22 μm滤膜除菌备用；
（3）糖基化产物对成骨细胞增殖作用：将100 μL浓度为1×104-1×106个/mL的成骨细胞溶液于96孔板中过夜培养，加入不同的糖基化产物进行检测，糖基化产物比未修饰的乳铁蛋白显著地促成功细胞增殖，其通路与天然牛乳铁蛋白一致。
实施例2：一种预防骨质疏松乳铁蛋白糖基化产品的制备方法，具有良好的抑制骨质疏松的活性，按照以下步骤进行：
（1）糖基化产物的制备：
将一定量的牛乳铁蛋白用去离子水溶解，按照质量比1:1-1:10的比例加入单糖、充分溶解后，将该溶液置于水浴锅中，于40-90℃反应12-80 h，反应结束后将溶液置于-30-20℃的环境中10-40 min；
（2）糖基化产物预处理：用分子量为5-50 kDa的透析袋，体积为3-5 L的去离子水透析48-96 h。根据BCA试剂盒测定的结果，将糖基化产物的浓度调整至0.5-2.0 mg/mL，0.22 μm滤膜除菌备用；
（3）糖基化产物对成骨细胞增殖作用：将100 μL浓度为1×104-1×106个/mL的成骨细胞溶液于96孔板中过夜培养，加入不同的糖基化产物进行检测，糖基化产物比未修饰的乳铁蛋白显著地促成功细胞增殖，其通路与天然人乳铁蛋白一致；
（4）糖基化产物对细胞周期的影响：对糖基化产物作用的细胞进行细胞周期测定，其结果见图3。
从图3可以看出，牛乳铁蛋白、24F1和48A1均可以显著地调节细胞周期（P<0.05），其主要是通过延长细胞周期中G2/M期和S期、同时缩短G1/G0期来实现的。糖基化产物24F1、48A1与牛乳铁蛋白调节细胞周期的方式不同，牛乳铁蛋白主要调节细胞周期中的S期，而糖基化产物24F1和48A1可以同时调节细胞周期中的G2/M期和S期。
附图说明：图1. 乳铁蛋白糖基化产物的电泳图；图2.糖基化产物对MAPK途径关键蛋白表达的作用；图3. 糖基化产物调节成骨细胞细胞周期作用。