阅读说明：本技术 氧化石墨烯药物载体及其制备方法和应用 (Graphene oxide drug carrier and preparation method and application thereof ) 是由 冯晓黎 郭伟洪 陈志安 陈祈月 张雅晴 于 2020-04-03 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种氧化石墨烯药物载体及其制备方法和应用,该氧化石墨烯药物载体的制备方法为：(1)在氧化石墨烯的分散液中加入聚乙二醇双胺,在活化剂的作用下进行酰胺缩合反应得到GO-PEG；(2)将GO-PEG溶于溶剂中配置成GO-PEG分散液,加入氧化海藻酸钠,在活化剂作用下进行席夫碱反应；反应结束后进行纯化、干燥,得到氧化石墨烯药物载体GO-PEG-OSA。将GO-PEG-OSA分散在溶剂中配置成GO-PEG-OSA分散液,加入药物溶液,搅拌10～20h,离心,得到纳米药物。本发明的药物载体和纳米药物对pH和光热敏感,具有“pH/温热”双重智能响应释放特性,具有优良的生物相容性、稳定性和水溶性,可高效快速携带药物进入病灶。(The invention provides a graphene oxide drug carrier and a preparation method and application thereof, wherein the preparation method of the graphene oxide drug carrier comprises the following steps: (1) adding polyethylene glycol diamine into the dispersion liquid of the graphene oxide, and carrying out amide condensation reaction under the action of an activating agent to obtain GO-PEG; (2) dissolving GO-PEG in a solvent to prepare GO-PEG dispersion, adding oxidized sodium alginate, and performing Schiff base reaction under the action of an activating agent; and after the reaction is finished, purifying and drying to obtain the graphene oxide drug carrier GO-PEG-OSA. Dispersing GO-PEG-OSA in a solvent to prepare GO-PEG-OSA dispersion, adding a medicinal solution, stirring for 10-20 h, and centrifuging to obtain the nano-medicament. The drug carrier and the nano-drug are sensitive to pH and photo-thermal, have the characteristics of pH/warm dual intelligent response and release, have excellent biocompatibility, stability and water solubility, and can efficiently and quickly carry the drug to enter a focus.)

氧化石墨烯药物载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，尤其涉及一种氧化石墨烯药物载体及其制备方法和 应用。

背景技术

恶性肿瘤的传统治疗方案，主要包括手术切除、化疗、放射治疗。多数患者诊断时已为 局部中晚期，化疗是不可避免的主要手段之一。除了化疗对患者机体正常组织造成的副作用， 肿瘤耐药是临床上不容忽视的重大问题。一旦患者出现化疗耐药,只能是更换化疗药物或加大 剂量，这无疑加重患者的副作用，降低治疗的依从性,而且疗效仍不确切。为了克服肿瘤耐药、 提高肿瘤治疗效果、延长患者生存周期，临床上提出了靶向治疗、光动力热疗、免疫治疗等 多种方案，但适用群体少、疗效不稳定等缺点限制了其使用，临床上难以实现低价、安全可 靠、高效的综合治疗方案。

紫杉醇(PTX)是针对恶性肿瘤常规化疗药，临床上应用广泛，但紫杉醇由于水溶性差、 口服难以吸收的特点，往往仅限于静脉注射。静注后在血液循环中的紫杉醇缺乏肿瘤靶向性， 不仅病灶难以达到有效可控的药物浓度，且常引起过敏、骨髓抑制、神经毒性等全身系统毒 副作用。不仅如此，由于长期化疗过程中肿瘤耐药性的出现，为达到预期疗效，只能加大紫 杉醇剂量，这样进一步导致毒副作用增大。这是长期困扰临床肿瘤治疗的现实难题。

基于纳米技术的药物递送系统，提供了改善PTX抗肿瘤功效的机会，与常规药物相比， PTX负载纳米药物在提高药物溶解度和生物利用度方面具有优势，通过增强渗透性和保留效 应实现智能药物递送，并减少毒副作用。如白蛋白结合型紫杉醇这一新型制剂，以纳米微粒 白蛋白为载体，优化了紫杉醇水溶性，通过白蛋白受体(Gp60)穿胞途径及肿瘤细胞外间质的 酸性分泌蛋白(SPARC)途径来提高肿瘤部位药效，目前已用于临床。尽管白蛋白结合型紫杉 醇可增加药物在肿瘤细胞的摄取，但肿瘤细胞表面耐药糖蛋白(P-gpprotein)会将胞吞的紫 杉醇重新外泵，因此，目前临床的纳米药物仍没有彻底解决肿瘤对化疗药物耐药的问题。为 了最大化紫杉醇抗肿瘤效益，临床上亟需一种低成本、安全高效、低毒副作用且能针对P-gp 蛋白这一靶点，克服肿瘤耐药的紫杉醇纳米递送新方案。

P-gp蛋白是ATP能量依赖型蛋白家族的一员，而ATP生成在很大程度上是依赖线粒体 氧化还原呼吸链，因此，损伤肿瘤细胞线粒体、阻断ATP的能量供应，是一种抑制P-gp蛋白功能的潜在手段。研究表明，光热疗法可以通过近红外光激发下产生大量活性氧(ROS)代谢物，攻击线粒体促进癌细胞凋亡发生；同时光热疗法也可以加热局部温度、增强化疗药物在癌症局部的渗透和吸收，通过抑制DNA损伤修复，逆转对化疗药物的耐药。因此，基 于纳米药物递送系统的化疗，与近红外光(808nm波长)激发诱导的“光动力/光热”二者的 高效结合，可以增强紫杉醇的细胞内浓度、完成温热条件下智能药物释放，甚至可作为一种有前景的逆转肿瘤耐药的策略。但是目前纳米药物递送系统的材料大部分仅具有装载药物能 力，而材料本身不具有治疗的功能，要达到同步热、化疗的功效则需要同时装载多种药物， 该类方法操作难度相对较高、合成纳米材料亦缺乏生物稳定性。因此，寻找一种具有可携带 化疗药物、本身具有“光敏/温热”双重效应的材料，是解决该临床难题的突破口。

氧化石墨烯(GO)是近年来具有相当潜力的生物材料，由于其独特的片层结构、高药物 负载和质膜穿越能力以及高度的可修饰性能，GO已在生物医学领域得到广泛应用。同时， GO还具有较强的光热转换能力，特别是在近红外光波长区域，对光产生较强的吸收和热转 换效应，产生的热量可以提高肿瘤病灶周围温度，进而间接或直接杀伤肿瘤细胞。因此，理 论上来说，GO与PTX结合形成的纳米药物有望联合热化疗双模式提高肿瘤治疗效果、改善 化疗耐药。但是，目前单纯的GO纳米材料，容易在在富含蛋白质或盐渍的环境(如细胞培 养基和血清)中聚集，进而表现出相应的剂量依赖性毒性。为了改善这种生物材料，最有效 的方法是通过共价或非共价共轭对GO进行表面涂层改性。聚乙二醇双胺(PEG)是生物学中常用的改性试剂，因其在有机溶剂中的高溶解度、最小的毒性和蛋白质抗性。研究发现，PEG修饰的GO(GO-PEG)纳米颗粒可显示出更高的稳定性和更好的生物相容性；而其负载PTX的[email protected]纳米颗粒，可相对单纯PTX产生更加良好的抗肿瘤效应。

在肿瘤机体内，肿瘤病灶的微环境大不同于正常组织，其酸碱度(pH＝5.5)往往远远低 于正常部位(pH＝7.4)。为了在肿瘤区域内实现化疗药物的智能加速给药，可设计具有低pH 触发的药物释放纳米药物，该类具有药物酸性释放性能的材料具有良好的临床应用前景。但 上述[email protected]纳米颗粒缺乏对外部pH刺激的反应能力，如何优化该纳米药物、定制 药物释放形成精确治疗，是目前另一难题。

发明内容

本发明的目在于提供一种氧化石墨烯药物载体及其制备方法和应用，本发明的氧化石墨 烯药物载体以及制作的纳米药物具有pH/温热双重响应。

本发明所采取的技术方案为：

一种氧化石墨烯药物载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)在氧化石墨烯的分散液中加入聚乙二醇双胺，在活化剂的作用下进行酰胺缩合反应 得到GO-PEG；

(2)将GO-PEG溶于溶剂中配置成GO-PEG分散液，加入氧化海藻酸钠，在活化剂作用下进行席夫碱反应；反应结束后进行纯化、干燥，得到氧化石墨烯药物载体GO-PEG-OSA。

步骤(1)和(2)中，所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC) 和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合物。

所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的质 量比为(0.5～1)：(1～2)。

所述酰胺缩合反应的温度为30～40℃。

所述酰胺缩合反应的时间为10～20h。在一些优选的实施例中，所述酰胺缩合反应的时 间为12h。

所述氧化石墨烯的分散液pH为5～6。

所述氧化石墨烯和聚乙二醇双胺的质量比为(0.01～0.05)：(40～50)。

所述氧化石墨烯粒径为50～200nm。

所述席夫碱反应的温度为10～30℃。在一些优选的实施例中，所述席夫碱反应选择在室 温中进行。

所述席夫碱反应的时间为10～20h。在一些优选的实施例中，所述席夫碱反应的时间为 12h。

所述GO-PEG分散液的pH为8～8.5。

所述GO-PEG与氧化海藻酸钠的质量比为(0.01～0.02)：(10～20)。

所述GO-PEG-OSA的分子量≤3500。

所述纯化方法为透析法。

一种氧化石墨烯药物载体，由上述制备方法得到。

上述氧化石墨烯药物载体在制备热疗用药物中的应用。

所述药物为抗肿瘤药物。

一种纳米药物的制备方法，包括如下步骤：将上述GO-PEG-OSA分散在溶剂中配置成 GO-PEG-OSA分散液，加入药物，搅拌10～20h，离心，得到纳米药物。

所述药物为抗肿瘤药物。

所述药物为紫杉醇(PTX)、阿霉素、铂类等疏水性化疗药物。

一种纳米药物，由上述制备方法得到。

本发明首先用双氨基化的聚乙二醇PEG修饰氧化石墨烯GO的表面形成GO-PEG纳米复 合物，进而在温和条件下与氧化海藻酸钠OSA混合，通过席夫碱反应合成GO-PEG-OSA药物载体，最后使用透析方法进一步合成负载药物的纳米药物。

OSA是一种由天然多糖海藻酸钠(SA)经氧化处理后得到的材料，保留了SA优异的生 物降解性、生物相容性和水溶性，同时由于醛基的存在而显示出pH响应性质，并且OSA的亲水性能有助于避免静脉注射后单核吞噬细胞系统的药物清除。因此，本发明将OSA引入药物载体中并用于制备纳米药物可有助于实现pH敏感的药物释放效果并避免药物被清除。结合GO具有的光热性能，可赋予药物载体和纳米药物“pH/温热”双重智能响应释放特性。

相较于现有技术，本发明取得了如下有益效果：

(1)本发明的药物载体和纳米药物对pH和光热敏感，具有“pH/温热”双重智能响应释放特性。

(2)本发明的药物载体和纳米药物具有优良的生物相容性、稳定性和水溶性，可高效快 速携带药物进入病灶。

(3)本发明的药物载体可负载抗肿瘤药物紫杉醇，改善紫杉醇水溶性不足、性质不稳定 等缺点；同时，在近红外照射下具有良好的产热效应及活性氧生成能力，可以通过“光热/光 动力/化疗”结合逆转肿瘤耐药，完成紫杉醇高效低毒的抗肿瘤作用，产生比单药紫杉醇更高 效、更安全的抗肿瘤效果。

(4)本发明的药物载体表面具有丰富的基团，具有高度携带能力，除了紫杉醇外，还可 与其他药物、核素、染料等分子反应，对其进行负载，进行多重化疗、光动力热疗等多功能 化衍生。

附图说明

图1为GO-PEG-OSA的红外光谱图；

图2为GO-PEG-OSA的透射电镜图；

图3为GO与GO-PEG-OSA的人胃正常粘膜上皮细胞毒性图；

图4为[email protected]、[email protected]的pH/温热响应释放曲线；

图5为[email protected]被胃癌细胞摄取的荧光图，其中a表示FITC标记的 [email protected]纳米药物荧光图，b表示被DAPI标记的胃癌细胞荧光图，c表示a和b 叠加后的荧光图；

图6为GO-PEG-OSA、[email protected]对胃癌细胞产生化疗效应图；

图7为GO-PEG-OSA、[email protected]在近红外激发下温热效应、产生活性氧、损 伤线粒体氧化呼吸链、抑制P-gp耐药蛋白能量供应图；

图8为GO-PEG-OSA、[email protected]在近红外激发下对胃癌细胞热化一体治疗的抗肿瘤效应。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。

实施例1

本实施例提供一种氧化石墨烯药物载体GO-PEG-OSA，其制备方法包括如下步骤：

(1)制备氧化石墨烯分散液

称取一定量的微米级氧化石墨烯，分散到蒸馏水中配制成质量浓度为10mg/ml的悬浮液， 然后用超声分散仪在4℃下间歇超声24h，超声功率为600w；然后5000rpm离心10min， 收集上清液，然后冷冻干燥，得粒径约为100nm的纳米氧化石墨烯。

称取一定量的纳米氧化石墨烯，用蒸馏水分散，配制成质量浓度为5mg/ml的纳米氧化 石墨烯分散液。然后加入1mol/L的氢氧化钠溶液，调节分散液的pH至10，室温下磁力搅 拌1小时，然后6000rpm离心，弃去上清。接着加入0.1mol/L的HCl的洗涤沉淀，重悬，6000rpm离心，重复至上清液pH为中性。最后将所收集的纳米氧化石墨烯分散到蒸馏水中配置成质量浓度为1mg/mL的分散液。

(2)制备GO-PEG

取50ml步骤(1)配置所得的1mg/mL纳米氧化石墨烯分散液，加入0.1mol/l的HCl调节pH至5～6。加入50mg的聚乙二醇双胺，搅拌1h后加入100mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和200mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，37℃下磁力搅拌12h。 反应结束后，6000rpm离心，弃去上清，然后用蒸馏水将沉淀重悬，重复离心重悬步骤2～3 次，收集离心冷冻干燥，得GO-PEG。

(3)制备GO-PEG-OSA

称取一定量的GO-PEG，加入蒸馏水配制成质量浓度为1mg/mL的GO-PEG分散液，备用。取20mL的GO-PEG分散液置于圆底烧瓶中，然后用Tris-HCl缓冲溶液将分散液的pH 调节成8～8.5，加入10mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和20mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，搅拌1h后，然后加入20mg的氧化海藻酸钠，室温下搅拌12h， 然后加入到透析袋中蒸馏水透析3天(截留分子量：3500)，然后冷冻干燥，得氧化石墨烯药 物载体GO-PEG-OSA。

对GO-PEG-OSA进行性能测试，结果如下：

(1)红外测试

取少量GO-PEG-OSA粉末与溴化钾粉末混合然后压成薄皮，采用红外测试仪进行分析， 得到GO-PEG-OSA地红外光谱图如图1所示。图1的红外光谱图中，GO-PEG-OSA材料在3400cm^-1(GO的羟基和羧基)、和1400cm^-1(GO的羟基和环氧基)出现了特异吸收峰。同时2960cm^-1(PEG的C-H的基团)和1050cm^-1(PEG的-C-O-基团)亦可见新的峰值，说明PEG 链成功共价接枝到氧化石墨烯片表面。此外，GO-PEG-OSA在1610cm^-1处出现了特殊的峰, 这是由于GO-PEG与OSA之间连接的酰胺键有关(-C＝N-基团)。FI-TR近红外实验结果证实 了GO-PEG-OSA药物载体的合成成功。

(2)透射电镜测试

对GO-PEG-OSA进行透射电镜测试，结果如图2所示。图2的投射电镜图中， GO-PEG-OSA材料呈现特殊的片状结构，这提示GO材料经过PEG、OSA的偶联后仍保持原 来的片层结构。

(3)细胞毒性

将人胃正常粘膜上皮细胞(GES-1)消化重悬后细胞浓度调整为2×10⁴/L，在96孔培养 板内每孔加入培养液体积为100μL。待细胞贴壁后分别加入不同浓度梯度的GO和 GO-PEG-OSA。加药后的48h，吸去上清液，每孔加入PBS清洗，在各组孔内加入10μL CCK-8 工作液(质量浓度为10％，日本同仁)，继续37℃孵育1h。酶标仪测定450nm波长各孔的吸 光度(A)值。实验重复3次，并绘制细胞毒性曲线，进而确定其IC50值。结果如图3所示。

图3的细胞毒性图中，在不同浓度的GO-PEG-OSA处理下，GES-1细胞的细胞存活率均 在85％以上，而GO则呈现浓度依赖性的明细细胞杀伤效应，这提示了PEG与OSA的修饰大大提高了GO纳米载体的生物安全性。

实施例2

本实施例提供一种纳米药物，其制备方法如下：

取一定量实施例1的GO-PEG-OSA分散到蒸馏水中，配制成浓度为5mg/L的 GO-PEG-OSA分散液。取2ml的GO-PEG-OSA分散液，加入200μL的PTX溶液，将混合 物在4℃下搅拌12h，然后以10000rpm离心20min。随后，收集上清液并利用高效液相分析 法(HPLC)测量游离PTX的含量。将沉淀物再次用蒸馏水分散并冷冻干燥，得到负载PTX 的纳米药物[email protected]。

作为对比，在制备纳米药物过程中将GO-PEG-OSA替换成实施例1步骤(2)所制得的GO-PEG，则可以得到另一种纳米药物[email protected]。

性能检测

(1)缓释效果

按释放环境不同将样品组分为血浆模拟组pH＝7.4及肿瘤模拟组pH＝5.5两种。

分别称取10mg的[email protected]或者[email protected]置于离心管中，分别加入 pH为5.5和pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液，然后将离心管置于37℃摇床100rpm振荡。到设 定时间点取出离心管，10000rpm离心，收集上清液，然后补充10ml的磷酸盐缓冲溶液，继 续振荡；将每个时间点收集的上清液，冷冻干燥，然后加入1ml的DMSO，用紫外分光光度 计测量其在265nm处的吸光度值，代入标准曲线的回归方程，算出释放的PTX的含量，计 算累计释放量。

[email protected]或者[email protected]的缓释曲线如图4所示。图4的缓释曲线图中， 在48h的释放周期内，[email protected]组在pH＝7.4或者pH＝5.5的情况下，其药物释放曲线 没有差异。而在[email protected]中，与pH＝7.4相比，pH＝5.5组的药物释放速度明显 加快，这可能是由于GO-PEG与OSA之间的席夫碱结构的酰胺键在酸性环境下降解所致， 提示[email protected]可以呈现pH酸性响应的智能加速释放。与此同时，在12h时间 点进行近红外光激发处理，[email protected]可以呈现温热响应的加速释放，而“pH/温 热”的智能释放则有利于紫杉醇在肿瘤部位顶点产生抗肿瘤作用。

(2)被细胞摄取能力

在共聚焦皿中培养紫杉醇耐药的胃癌细胞(HGC-27/PTX)至70-80％的密度，加用FITC 标记的[email protected]纳米药物共同孵育4h后，用激光共聚焦显微镜观察纳米药物被 胃癌细胞的摄取能力，结果如图5所示，其中a表示FITC标记的[email protected]纳米 药物荧光图，b表示被DAPI标记的胃癌细胞荧光图，c表示a和b叠加后的荧光图。

图5的激光共聚焦图中，可以见到在细胞核周围有大量的荧光聚集(白色箭头)，提示 [email protected]可被HGC-27/PTX细胞大量快速摄取。

(3)抗肿瘤效应

将紫杉醇耐药的胃癌细胞(HGC-27/PTX)消化重悬后细胞浓度调整为2×10⁴/L，在96 孔培养板内每孔加入培养液体积为200μL。待细胞贴壁后将细胞分为四个组：空白对照组 (Blank)、GO-PEG-OSA、PTX以及[email protected]组。加药后的48h，在各组孔内加 入20μLMTT工作液(5g/L)，继续37℃孵育2h。吸去上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO) 200μL，置平板摇床震荡至结晶完全溶解后，酶标仪测定490nm波长各孔的吸光度(A)值。 实验重复3次，并绘制细胞毒性曲线，进而确定其IC50值。结果如图6所示。

图6的细胞毒性图中，Blank、GO-PEG-OSA组的细胞存活率均在85％以上，这提示GO-PEG-OSA对肿瘤细胞相对无毒，而PTX与[email protected]组均可见细胞存活率降 低。但与相同浓度的PTX相比，[email protected]纳米组的抗肿瘤效应更高。

(4)温热效应、活性氧、线粒体膜电位、ATP生成和Rho123吸收性能

在水溶液中加入GO-PEG-OSA，并在近红外光照下检测溶液的温度及单线氧产生能力。 同时将紫杉醇耐药的胃癌细胞(HGC-27/PTX)消化重悬后细胞浓度调整为2×10⁵/mL，在6 孔培养板内每孔加入培养液体积为2mL。待细胞贴壁后将细胞分为三个组：Blank空白组、 近红外光照、GO-PEG-OSA、GO-PEG-OSA+近红外光照(NIR，1W/cm²，5min)。加药后 的48h，消化并收集各组细胞，进行活性氧(ROS)、线粒体膜电位(MTPs)、ATP生成及 Rho123吸收实验(P-gp蛋白外泵功能)检测。结果如图7所示。

图7显示，相对于Blank及GO-PEG-OSA组，GO-PEG-OSA+近红外光照组可在体外产生良好的温热效应及产生活性氧(A、B)，同时该处理组的细胞内ROS(C)、Rho123(F) 的含量显著上升，MTPs(D)、ATP(E)显著下降存活率相对于非光照组的显著降低。这提 示，GO-PEG-OSA在近红外的光照下，可有效诱发“光热/光动力效应”，损伤线粒体、降低 P-gp蛋白的能量供应。

(5)抗肿瘤效应(近红外光照干预)

将紫杉醇耐药的胃癌细胞(HGC-27/PTX)消化重悬后细胞浓度调整为2×10⁴/L，在96 孔培养板内每孔加入培养液体积为200μL。待细胞贴壁后将细胞分为四个组：GO-PEG-OSA、 GO-PEG-OSA+近红外光照、[email protected]、[email protected]+近红外光照(注： 1W/cm²,5min)。加药后的48h，在各组孔内加入20μL MTT工作液(5g/L)，继续37℃孵育 2h。吸去上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)200μL，置平板摇床震荡至结晶完全溶解后， 酶标仪测定490nm波长各孔的吸光度(A)值。实验重复3次，并绘制细胞毒性曲线，进而确 定其IC50值。结果如图8所示。

图8显示，GO-PEG-OSA组的细胞在近红外光照的干预后，其细胞存活率相对于非光照 组显著降低。而[email protected]组的细胞在近红外光照的干预后，其细胞存活率亦相对于非光照组显著降低。这提示[email protected]纳米材料的热、化一体治疗可以大大增加 耐药细胞的杀伤作用，提高抗肿瘤效率。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应 为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。