用于提取金黄色葡萄球菌总蛋白的方法及试剂盒
阅读说明：本技术 用于提取金黄色葡萄球菌总蛋白的方法及试剂盒 (Method and kit for extracting total protein of staphylococcus aureus ) 是由 聂子梅 黄非 宋乐元 �田润 于 2020-06-03 设计创作，主要内容包括：本发明涉及金黄色葡萄球菌检测,具体涉及一种用于提取金黄色葡萄球菌总蛋白的方法及试剂盒。所述方法包括：培养金黄色葡萄球菌并收集菌体,用反应缓冲液重悬菌体,然后加入由酿酒酵母菌表达的溶葡球菌酶,于37℃温育30-60min,得到酶解产物；用PBS溶液稀释所述酶解产物,即得金黄色葡萄球菌总蛋白提取物。该方法具有简便快捷、蛋白提取效率高的优点,解决了金黄色葡萄球菌全蛋白难提取的问题。(The invention relates to staphylococcus aureus detection, in particular to a method and a kit for extracting total protein of staphylococcus aureus. The method comprises the following steps: culturing staphylococcus aureus, collecting thalli, resuspending the thalli by using a reaction buffer solution, then adding lysostaphin expressed by saccharomyces cerevisiae, and incubating for 30-60min at 37 ℃ to obtain an enzymolysis product; and diluting the enzymolysis product by using a PBS solution to obtain the total protein extract of the staphylococcus aureus. The method has the advantages of simplicity, convenience, rapidness and high protein extraction efficiency, and solves the problem of difficult extraction of whole protein of staphylococcus aureus.)
技术领域
本发明涉及金黄色葡萄球菌检测，具体涉及一种用于提取金黄色葡萄球菌总蛋白的方法及试剂盒。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)也称“金葡菌”，隶属于葡萄球菌属，是革兰氏阳性菌代表，为一种常见的食源性致病微生物；金黄色葡萄球菌对高温有一定的耐受能力，在80℃以上的高温环境下30min才可以将其彻底杀死，另外金黄色葡萄球菌可以存活于高盐环境，最高可以耐受15％浓度的NaCl溶液；金黄色葡萄球菌的细胞壁耐受性非常高，常规物理机械方法和去垢剂等方法破碎其细胞壁释放胞内核酸、蛋白都较为困难，这些都影响了现代分子生物学检测方法在金黄色葡萄球菌低浓度快速检测中的应用。
溶葡球菌酶(Lysostaphin)，又称为溶葡素，可裂解金黄色葡萄球菌。目前通常采用大肠杆菌或毕赤酵母菌表达溶葡球菌酶，但制备的溶葡球菌酶活性较低，无法单独用于金黄色葡萄球菌的破壁，需要与溶菌酶联用或者借助物理的菌体破壁方法才能裂解金黄色葡萄球菌，导致操作步骤十分繁琐，耗费时间长。
当前对于金黄色葡萄球菌的检测主要是培养基生化法，以DNA为检测靶的PCR方法和以菌体表面蛋白为检测靶的免疫学方法都因为方法学的限制没能得到广泛应用，其障碍主要在于：金黄色葡萄球菌的细胞壁对于蛋白酶、去垢剂和高盐渗透的耐受能力高，在破壁阶段耗时且效率不高，难于提取到完整且有相当数量的DNA；总蛋白提取过程中，采用超声波、冻溶等方法破碎细胞获取全蛋白异常困难，往往妥协检测细胞表面蛋白而避免破壁，但金黄色葡萄球菌外膜蛋白proteinA可以特异性的与抗体蛋白结合，削弱免疫检测的效果，造成假阴性。
发明内容
为了解决金黄色葡萄球菌全蛋白难提取的问题，本发明提供用于金黄色葡萄球菌总蛋白提取的方法和试剂盒，具有简便快捷、蛋白提取效率高的优点。
一方面，本发明提供一种金黄色葡萄球菌总蛋白提取方法，包括：培养金黄色葡萄球菌并收集菌体，其特征在于：用反应缓冲液重悬菌体，然后加入由酿酒酵母菌表达的溶葡球菌酶，于37℃温育30-60min，得到酶解产物；用PBS溶液稀释所述酶解产物，即得金黄色葡萄球菌总蛋白提取物。
在本发明所述方法的优选实施例中，所述溶葡球菌酶的制备方法包括如下步骤：在溶葡球菌酶的氨基酸序列的N端添加可溶序列，C端添加酶蛋白稳定性序列，得到重组溶葡球菌酶的氨基酸序列；合成所述重组溶葡球菌酶的编码基因并构建表达载体，然后转化酿酒酵母菌，得到重组酿酒酵母菌；培养重组酿酒酵母菌，诱导蛋白表达并进行蛋白纯化。
在本发明所述方法的优选实施例中，所述溶葡球菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述可溶序列如SEQ ID NO:3所示，所述酶蛋白稳定性序列如SEQ ID NO:4所示；优选地，所述重组溶葡球菌酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在本发明所述方法的优选实施例中，所述反应缓冲液包含如下组分：15-30mM pH7.0-8.0Tris-Cl，0.5％-1.2％g/ml NaCl，5-15mM EDTA，2-8mM MnCl2，0.05％-0.12％g/mlSDS。
在本发明所述方法的优选实施例中，所述反应缓冲液的配方为：20mM pH7.4Tris-Cl，0.9％g/ml NaCl，10mM EDTA，5mM MnCl2，0.1％g/ml SDS。
在本发明所述方法的一些实施例中，所述PBS溶液的配方为：137mM NaCl，2.7mMKCl，8mM NaH2PO4，2mM K2HPO4，pH7.4。
在本发明所述方法的一些实施例中，每毫升金黄色葡萄球菌培养液收集的菌体使用400μL反应缓冲液、10μL溶葡球菌酶溶液和1mL PBS溶液；所述溶葡球菌酶溶液的浓度为1mg/mL，纯度>90％。
另一方面，本发明提供一种金黄色葡萄球菌总蛋白提取试剂盒，其特征在于：包括反应缓冲液以及由酿酒酵母菌表达的溶葡球菌酶；所述反应缓冲液包含如下组分：15-30mMpH7.0-8.0Tris-Cl，0.5％-1.2％g/ml NaCl，5-15mM EDTA，2-8mM MnCl2，0.05％-0.12％g/ml SDS。
在本发明所述试剂盒的优选实施例中，所述溶葡球菌酶的制备方法包括如下步骤：在溶葡球菌酶的氨基酸序列的N端添加可溶序列，C端添加酶蛋白稳定性序列，得到重组溶葡球菌酶的氨基酸序列；合成所述重组溶葡球菌酶的编码基因并构建表达载体，然后转化酿酒酵母菌，得到重组酿酒酵母菌；培养重组酿酒酵母菌，诱导蛋白表达并进行蛋白纯化。
在本发明所述试剂盒的优选实施例中，所述溶葡球菌酶的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示，所述可溶序列如SEQ ID NO:3所示，所述酶蛋白稳定性序列如SEQ ID NO:4所示；优选地，所述重组溶葡球菌酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在本发明所述试剂盒的一些实施例中，还包括PBS溶液，其配方为：137mM NaCl，2.7mM KCl，8mM NaH2PO4，2mM K2HPO4，pH7.4。
在本发明所述试剂盒的优选实施例中，所述反应缓冲液的配方为：20mM pH7.4Tris-Cl，0.9％g/ml NaCl，10mM EDTA，5mM MnCl2，0.1％g/ml SDS；所述溶葡球菌酶的纯度>90％。
发明人发现，在溶葡球菌酶氨基酸序列的N端添加可溶序列、C端添加酶蛋白稳定性序列，并采用酿酒酵母菌表达系统进行蛋白表达，获得的重组溶葡球菌酶的活性(552U/mg)明显高于传统的利用毕赤酵母菌表达的溶葡球菌酶(376U/mg)和利用大肠杆菌表达的溶葡球菌酶(124U/mg)，蛋白稳定性也远远高于毕赤酵母菌和大肠杆菌表达的溶葡球菌酶以及市售的溶葡球菌酶。
针对本发明制备的重组溶葡球菌酶，本发明还开发了与之配套用于金黄色葡萄球菌蛋白提取的反应缓冲液。将本发明的重组溶葡球菌酶和反应缓冲液用于金黄色葡萄球菌的总蛋白提取，具有传统的蛋白提取方法难以达到的高效与便捷。如表3所示，采用本发明的方法提取金黄色葡萄球菌的总蛋白，胞内核酸酶蛋白的释放水平远远高于超声波破碎方法和溶菌酶方法。可见，本发明的蛋白提取方法对于金黄色葡萄球菌的总蛋白提取有非常显著的针对性优势，特别是在细胞裂解过程中呈现极高的效率。本发明的方法具有操作简便快捷、蛋白释放率高、裂解产物黏度低的优点，适用于各种常规的免疫学检测方法，可提高金黄色葡萄球菌的检测效率和检测准确度。
附图说明
图1.利用酿酒酵母菌表达的重组溶葡球菌酶的SDS-PAGE图；
其中，M为蛋白Marker，从上到下依次为116，66.2，45，35，25，18.4，14.4kDa；1：诱导原样(诱导酿酒酵母菌表达蛋白后提取的菌体总蛋白，未经蛋白纯化)，2：穿透样(穿透样是指纯化中柱体饱和过程及饱和后样本流穿的组分)，3：10mM咪唑洗脱液，4：20mM咪唑洗脱液，5：50mM咪唑洗脱液，6：100mM咪唑洗脱液，7：200mM咪唑洗脱液；图中黑色箭头标示重组溶葡球菌酶的蛋白条带，其分子量为28kDa。
图2.利用毕赤酵母菌表达的重组溶葡球菌酶的SDS-PAGE图；
其中，M为蛋白Marker，从上到下依次为116，66.2，45，35，25，18.4，14.4kDa；1：诱导培养基未浓缩，2：诱导培养基浓缩5倍，3：诱导培养基浓缩20倍；图中黑色箭头标示重组溶葡球菌酶的蛋白条带，其分子量为28kDa。
图3.利用大肠杆菌表达的重组溶葡球菌酶的SDS-PAGE图；
其中，M为蛋白Marker，从上到下依次为116，66.2，45，35，25，18.4，14.4kDa；1：表达菌未诱导(没有诱导蛋白表达的大肠杆菌的菌体总蛋白)2：诱导原样(诱导大肠杆菌表达蛋白后提取的菌体总蛋白，未经蛋白纯化)，3：穿透样(穿透样是指纯化中柱体饱和过程及饱和后样本流穿的组分)，4：10mM咪唑洗脱液，5：20mM咪唑洗脱液，6：50mM咪唑洗脱液，7：100mM咪唑洗脱液，8：200mM咪唑洗脱液，9：300mM咪唑洗脱液；图中黑色箭头标示重组溶葡球菌酶蛋白条带，其分子量为28kDa。
图4.采用本发明的DNA提取方法提取的金黄色葡萄球菌总DNA的电泳图。
图5.采用常规的DNA提取方法提取的金黄色葡萄球菌总DNA的电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细阐述，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。
大肠杆菌(Escherichia coli，DH5α)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，菌株编号为1.12873，平台资源编号为1511C0002100009047。
大肠杆菌(Escherichia coli，BL21)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，菌株编号为1.12875，平台资源编号为1511C0002100009049。
酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae，INVSc1)购自赛默飞世尔科技有限公司(Thermo Fisher Scientific)，产品目录号为C81000。
毕赤酵母菌(Pichia pastoris，GS115)购自赛默飞世尔科技有限公司(ThermoFisher Scientific)，产品目录号为C18100。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，Cowan I)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，菌株编号为1.1476，平台资源编号为1511C0002100001789。
上述生物材料本实验室亦有保存，申请人声明，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证试验。
pYES2-NT载体为已知的酵母表达载体，购自赛默飞世尔科技有限公司(ThermoFisher Scientific)，产品目录号为V825220。pYES2-NT载体(6.0kb)的细菌抗性为氨苄青霉素抗性(Ampicillin)，克隆方法为限制性内切酶/多克隆位点，启动子GAL1，蛋白标签为6×His标签、V5表位标签和Xpress表位标签。
pPIC9K载体为已知的毕赤酵母载体，购自赛默飞世尔科技有限公司(ThermoFisher Scientific)，产品目录号为V17520。pPIC9K载体(9.3kb)的细菌抗性为氨苄青霉素抗性(Ampicillin)和庆大霉素抗性(Gentamicin)，克隆方法为限制性内切酶/多克隆位点，启动子AOX1。
pET-28a(+)是一种常用的融合蛋白类型原核高效表达载体，购自北京索莱宝科技有限公司(Solarbio)，货号：P3110。pET-28a(+)大小为5369bp，含有抗卡那霉素基因，表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。
BamH I内切酶(Code No.1010S)、Xho I内切酶(Code No.1094S)，EcoR I内切酶(Code No.1040S)，Not I内切酶(Code No.1166S)，Sac I内切酶(Code No.1078S)，TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(Code No.9762)，T4 DNA Ligase(Code No.2011A)，均购自宝日医生物技术(北京)有限公司(Takara)。质粒小提中量试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号：DP106。透析袋MD25(8000-14000D)购自北京索莱宝科技有限公司(Solarbio)，货号：YA1071。HisPrep FF16/10预装柱购自GEHealthcare Life Sciences，产品编号17-5256-01。Casamino acids(酪蛋白氨基酸，Sigma-Aldrich 70172)、galactose(半乳糖，Sigma-Aldrich V900922)、glucose(葡萄糖，Sigma-Aldrich V900392)、YNB(无氨基酵母氮源，Sigma-Aldrich V900895)。Yeastextract(酵母提取物，OXOID LP0021)、Peptone(蛋白胨，索莱宝P8450)、Biotin(生物素，Sigma-Aldrich V900418)、Tryptone(胰蛋白胨，OXOID LP0042B)、EDTA(乙二胺四乙酸，化学式：C10H16N2O8，CAS登录号：60-00-4，Sigma-Aldrich V900106)、SDS(十二烷基硫酸钠，化学式：C12H25SO4Na，CAS登录号：151-21-3，Sigma-Aldrich V900859)；Sarcosyl(N-月桂酰肌氨酸钠，CAS号137-16-6，线性分子式CH3(CH2)10CON(CH3)CH2COONa)购自Sigma-Aldrich，货号：L9150。4M GuSCN(异硫氰酸胍，CAS号593-84-0，线性分子式NH2C(＝NH)NH2·HSCN)购自Sigma-Aldrich，货号：11685929001。溶菌酶(CAS号12650-88-3，EC编号3.2.1.17)来源于鸡蛋白，购自Sigma-Aldrich，货号L6876。蛋白酶K(CAS号39450-01-6，EC编号3.4.21.64)来源于林伯氏白色念球菌，购自Sigma-Aldrich，货号P6556。
LB培养基
每100mlLB培养基含有：1g胰蛋白胨、0.5g酵母提取物、1g氯化钠，pH 7.4。
配制方法：在950ml ddH2O中溶解10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，然后用NaOH调节pH为7.4，用ddH2O定容至1L。若配制固体培养基，则每升加入15g琼脂。121℃高压蒸汽灭菌20min。
YEPD培养基
配方：酵母膏：蛋白胨：葡萄糖＝1:2:2(质量比)。
配制方法：溶解10g酵母膏，20g蛋白胨于900ml ddH2O中，如制平板需加入20g琼脂；121℃高压蒸汽灭菌20min；冷却后加入100ml单独灭菌(115℃高压蒸汽灭菌15min)的葡萄糖溶液(含20g葡萄糖)。
若未特别说明，以下实施例所使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。若未特别说明，以下实施例所使用的实验方法和实验条件均为本领域常规的实验方法和实验条件，可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
实施例1.溶葡球菌酶的制备
溶葡球菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，由246个氨基酸组成。为了高效表达溶葡球菌酶蛋白，在其氨基酸序列的N端添加可溶序列MGKRKST(SEQ ID NO:3)，C端添加酶蛋白稳定性序列ASVVSKSLEKDGHG(SEQ ID NO:4)，从而获得重组溶葡球菌酶(N-MGKRKST---Lyso---ASVVSKSLEKDGHG-C)的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)(Lyso代表溶葡球菌酶)。该重组溶葡球菌酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。在SEQ ID NO:2所示基因序列的5’端添加BamH I酶切位点序列(GGATCC)和EcoR I酶切位点序列(GAATTC)，3’端添加Xho I酶切位点序列(CTCGAG)和Not I酶切位点序列(GCGGCCGC)，然后委托生工生物工程(上海)有限公司进行全基因合成，得到目的基因(SEQ ID NO:6)。
溶葡球菌酶的氨基酸序列为：
AATHEHSAQWLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMNIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQIGLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFSNSTAQDPMPFLKSAGYGKAGGTVTPTPNTGWKTNKYGTLYKSESASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVLWGTIK(SEQ ID NO:1)
重组溶葡球菌酶的氨基酸序列为：
MGKRKSTAATHEHSAQWLNNYKKGYGYGPYPLGINGGMHYGVDFFMNIGTPVKAISSGKIVEAGWSNYGGGNQIGLIENDGVHRQWYMHLSKYNVKVGDYVKAGQIIGWSGSTGYSTAPHLHFQRMVNSFSNSTAQDPMPFLKSAGYGKAGGTVTPTPNTGWKTNKYGTLYKSESASFTPNTDIITRTTGPFRSMPQSGVLKAGQTIHYDEVMKQDGHVWVGYTGNSGQRIYLPVRTWNKSTNTLGVLWGTIKASVVSKSLEKDGHG(SEQ ID NO:5)
分别利用酿酒酵母表达系统、毕赤酵母表达系统和大肠杆菌表达系统对合成的目的基因进行蛋白表达，比较各表达系统获得的酶蛋白的活性。
(一)利用酿酒酵母表达系统表达重组溶葡球菌酶
1、构建表达载体
将合成的目的基因(SEQ ID NO:6)经由BamH I和Xho I位点插入pYES2-NT载体(Thermo Fisher Scientific，货号V825220)中。使用BamH I内切酶(Takara，货号1010S)和Xho I内切酶(Takara，货号1094S)分别对目的基因和载体进行双酶切，酶切体系如下：
酶切条件：37℃酶切3h。使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA ExtractionKit Ver.4.0(Takara，货号9762)，按照试剂盒说明书进行酶切产物回收，得到pYES2-NT线性化载体和目的基因酶切产物。然后使用T4 DNA Ligase(Takara，货号2011A)，按照如下体系和条件进行连接。
16℃连接过夜，得到连接产物pYES2-NT-Lyso质粒。
用连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。转化步骤如下：将pYES2-NT-Lyso质粒和E.coli DH5α感受态细胞混匀后在冰上孵育半小时，42℃热激90秒，冰上放置2min，然后加入液体LB培养基缓摇1个小时，3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃倒置培养过夜。次日挑取单菌落，接种在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养，采用质粒小提中量试剂盒(天根，货号DP106)提取质粒。委托生工生物工程(上海)有限公司对质粒进行测序，将测序正确的pYES2-NT-Lyso质粒备用。
2、转化酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae，INVSc1)
将在YEPD培养基中培养至对数期的酿酒酵母菌INVSc1(Thermo FisherScientific，货号C81000)冰浴30分钟，6000rpm离心5分钟收集菌体；用1M山梨醇清洗-离心(6000rpm离心5分钟)三次，收集菌体；每5mL起始菌液所得到的清洗后菌体用200μL 1M山梨醇重悬，加入20μL测序正确的pYES2-NT-Lyso质粒，1500V电击5ms；将电击产物涂布于尿嘧啶营养缺陷型培养基(uracil-deficient medium)(Biofeng，M300)平板上，30℃培养72小时，平板上长出的菌落即为阳性子。
3、蛋白表达和纯化
(1)将步骤2得到的阳性子接种于YEPD液体培养基中，30℃，110rpm摇床培养72小时。收集菌液后，6000rpm离心5分钟收集菌体，转移至发酵诱导培养基中，30℃，110rpm继续培养48小时；以6000rpm离心5分钟收集菌体，菌体用预冷到4-8℃的PBS清洗后再用预冷到4-8℃的PBS重悬，然后采用高压匀浆破碎菌体；以12000rpm离心15分钟，取上清液。
其中，发酵诱导培养基的配方为：0.5％(g/ml)Casamino acids(酪蛋白氨基酸)，2％(g/ml)galactose(半乳糖)，0.1％(g/ml)glucose(葡萄糖)，1.4％(g/ml)YNB(无氨基酵母氮源)，0.54％(g/ml)Na2HPO4，0.74％(g/ml)NaH2PO4。PBS的配方为：137mM NaCl，2.7mMKCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，PH7.4。
(2)使用HisPrep FF16/10预装柱(GE，货号17-5256-01)进行蛋白纯化；用结合缓冲液平衡2～5个床体积，流速为2mL/min；将20ml步骤(1)获得的上清液通过0.45μm滤膜过滤后，上样，流速为1mL/min；用结合缓冲液洗2～5个床体积，流速为2mL/min；用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的结合缓冲液洗脱，流速为2mL/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度。结合缓冲液为50mM pH7.4的PBS缓冲液，其配方为：0.5M NaH2PO4 19mL，0.5M Na2HPO4 81mL，NaCl 29.3g，加适量蒸馏水溶解后定容到1000mL。
如图1所示，一步纯化获得成品蛋白,分子量为28kDa，纯度90％以上。使用透析分子量8000-14000D的透析袋MD25(Solarbio，货号YA1071)透析蛋白并保存于20mM Tris-ClpH7.5，50mM NaCl，5％(v/v)甘油中。
(二)利用毕赤酵母表达系统表达重组溶葡球菌酶
1、构建表达载体
将合成的目的基因(SEQ ID NO:6)经由EcoR I和Not I位点插入pPIC9K载体(Thermo Fisher Scientific，货号V17520)中。使用EcoR I内切酶(TaKaRa，货号1040S)和Not I内切酶(TaKaRa，货号1166S)分别对目的基因和pPIC9K载体进行双酶切，酶切体系如下：
酶切条件：37℃酶切16h。使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA ExtractionKit Ver.4.0(Takara，货号9762)，按照试剂盒说明书进行酶切产物回收，得到pPIC9K线性化载体和目的基因酶切产物。然后使用T4 DNA Ligase(Takara，货号2011A)，按照如下体系和条件进行连接。
16℃连接过夜，得到连接产物pPIC9K-Lyso质粒。
用连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。转化步骤如下：将pPIC9K-Lyso质粒和E.coli DH5α感受态细胞混匀后在冰上孵育半小时，42℃热激90秒，冰上放置2min，然后加入液体LB培养基缓摇1个小时，3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃倒置培养过夜。次日挑取单菌落，接种在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养，采用质粒小提中量试剂盒(天根，货号DP106)提取质粒。委托生工生物工程(上海)有限公司对质粒进行测序，将测序正确的pPIC9K-Lyso质粒备用。
2、转化毕赤酵母菌株(Pichia pastoris，GS115)
使用Sac I内切酶(TaKaRa，货号1078S)对载体进行单酶切，酶切体系如下：
酶切条件：37℃酶切16h。使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA ExtractionKit Ver.4.0(Takara，货号9762)，按照试剂盒说明书进行酶切产物回收，得到pPIC9K-Lyso线性化酶切产物。
将在YEPD培养基中培养至对数期的毕赤酵母菌株GS115(Thermo FisherScientific，货号C18100)冰浴30分钟，6000rpm离心5分钟收集菌体；用1M山梨醇清洗-离心(6000rpm离心5分钟)三次，收集菌体；每5mL起始菌液所得到的清洗后菌体用200μL 1M山梨醇重悬，加入20μL pPIC9K-Lyso线性化酶切产物，1500V电击5ms；将电击产物涂布于组氨酸营养缺陷型培养基(histidine-deficient medium)(赫特生物，XJ171)平板上，30℃培养72小时，平板上长出的菌落即为阳性子。
3、蛋白表达和纯化
(1)将步骤2得到的阳性子接种于BMGY液体培养基中，30℃，250rpm摇床培养24小时。6000rpm离心5min收集菌体，然后将菌体转移至发酵诱导培养基中，30℃，110rpm继续培养72小时，每隔24小时补一次甲醇至终浓度为0.5％(v/v)；以6000rpm离心5分钟，收集发酵液上清液备用。
其中BMGY培养基的配方为：1％(g/ml)Yeast extract(酵母提取物)，2％(g/ml)Peptone(蛋白胨)，0.1M K2SO4，1.34％(g/ml)YNB(无氨基酵母氮源)，0.02％(mg/ml)Biotin(生物素)，1％(v/v)甘油。发酵诱导培养基的配方为：1％(g/ml)Yeast extract(酵母提取物)，2％(g/ml)Peptone(蛋白胨)，0.1M K2SO4，1.34％(g/ml)YNB(无氨基酵母氮源)，0.02％(mg/ml)Biotin(生物素)，0.5％(v/v)甲醇。
(2)将100ml步骤(1)获得的上清液通过0.45μm滤膜过滤后，装入透析分子量为8000-14000D的透析袋MD25(Solarbio，货号YA1071)中，用聚乙二醇PEG 20000(Solarbio，货号P8280)浓缩蛋白溶液15～20倍。
如图2所示，一步纯化获得成品蛋白，分子量为28kDa，纯度90％以上，保存于20mMTris-Cl pH7.5，50mM NaCl，5％甘油(v/v)中。
(三)利用大肠杆菌表达系统表达重组溶葡球菌酶
1、构建表达载体
将合成的目的基因(SEQ ID NO:6)经由EcoR I和Xho I位点插入pET-28a(+)载体(Solarbio公司，货号P3110)中。使用EcoR I内切酶(TaKaRa，货号1040S)和Xho I内切酶(Takara，货号1094S)分别对目的基因和pET-28a(+)载体进行双酶切，酶切体系如下：
酶切条件：37℃酶切16h。使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA ExtractionKit Ver.4.0(Takara，货号9762)，按照试剂盒说明书进行酶切产物回收，得到pET-28a(+)线性化载体和目的基因酶切产物。然后使用T4 DNA Ligase(Takara，货号2011A)，按照如下体系和条件进行连接。
16℃连接过夜，得到连接产物pET28a-Lyso质粒。
用连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。转化步骤如下：将pET28a-Lyso质粒和E.coli DH5α感受态细胞混匀后在冰上孵育半小时，42℃热激90秒，冰上放置2min，然后加入液体LB培养基缓摇1个小时，3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有50μg/ml卡那霉素的LB固体平板上，37℃倒置培养过夜。次日挑取单菌落，接种在含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养，采用质粒小提中量试剂盒(天根，货号DP106)提取质粒。委托生工生物工程(上海)有限公司对质粒进行测序，将测序正确的pET28a-Lyso质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞(转化步骤同上述E.coli DH5α)，以pET-28a(+)载体说明书中列出的T7 promoter primer和T7 terminator primer作为验证引物，通过菌落PCR方法鉴定阳性子。
2、蛋白表达和纯化
(1)将步骤1得到的阳性子接种于TB液体培养基中，37℃，180rpm摇床培养至OD600＝0.8时，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，化学式C9H18O5S)至终浓度为500μM，37℃，180rpm继续培养16h。6000rpm离心5分钟收集菌体，用PBS清洗后用PBS重悬菌体，在冰浴的条件下采用超声破碎菌体；以12000rpm离心15分钟，取上清液。
其中，TB液体培养基的配方为：1.2％(g/ml)Tryptone(胰蛋白胨)，2.4％(g/ml)Yeast Extract(酵母提取物)，0.4％(v/v)Glycerol(甘油)，17mM KH2PO4，72mM K2HPO4。PBS的配方为：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，PH7.4。
(2)使用HisPrep FF16/10预装柱(GE，货号17-5256-01)进行蛋白纯化；用结合缓冲液平衡2～5个床体积，流速为2mL/min；将20ml步骤(1)获得的上清液通过0.45μm滤膜过滤后，上样，流速为1mL/min；用结合缓冲液洗2～5个床体积，流速为2mL/min；用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的结合缓冲液洗脱，流速为2mL/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度。结合缓冲液为50mM pH7.4的PBS缓冲液，其配方为：0.5M NaH2PO4 19mL，0.5M Na2HPO4 81mL，NaCl 29.3g，加适量水溶解后定容到1000mL。
如图3所示，一步纯化获得成品蛋白，分子量为28kDa，纯度90％以上。使用透析分子量为8000-14000D的透析袋MD25(Solarbio，货号YA1071)透析蛋白并保存于20mMpH7.5Tris-Cl，50mM NaCl，5％(v/v)甘油中。
(四)酶活测定
测定上述由酿酒酵母表达系统、毕赤酵母表达系统和大肠杆菌表达系统表达的溶葡球菌酶的活性，同时以市售溶葡球菌酶为对照。通过比浊法测定溶葡球菌酶的酶活：
(1)将过夜培养的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，Cowan I)(CGMCCNO：1.1476)离心收集菌体，用buffer A(50mM Tris-HCl，145mM NaCl，pH 7.5)重悬菌体，并调整菌液的A620nm＝1.3～1.5。
(2)将溶葡球菌酶溶液用buffer A稀释到1μg/ml。
(3)将5ml步骤(2)得到的溶葡球菌酶液与1ml步骤(1)得到的菌液混合后，37℃温浴10min，测定A620nmTest(检测)，用5ml buffer A代替溶葡球菌酶溶液测定A620nmBlank(空白)。
ΔA620nm＝A620nmTest-A620nmBlank
Units/ml＝(ΔA620nmT0-ΔA620nmT10)/(0.125)(5)
Units/mg protein＝(Units/ml enzyme)/(mg protein/ml enzyme)
结果如下表所示，由酿酒酵母菌表达的溶葡球菌酶的比活最高。
表1.溶葡球菌酶的比活测定结果
6ml反应体系中，在37℃，pH7.5条件下，反应10min使金黄色葡萄球菌悬液的浊度(A620nm)从0.25变化到0.125定义为一个酶活单位U。酶的比活定义为：每毫克酶蛋白含有的活性单位数，单位为：U/mg。
(五)酶的稳定性测定
测定上述酿酒酵母表达系统、毕赤酵母表达系统和大肠杆菌表达系统表达的溶葡球菌酶的稳定性，同时以市售溶葡球菌酶为对照。
测定方法：将溶葡球菌酶放置于37℃培养箱中2周后，按照步骤(四)中的方法测定酶活，计算残余酶活率，残余酶活率＝酶的比活(T2周)/酶的比活(T0)。
表2.溶葡球菌酶的稳定性测定结果
结果表明，酿酒酵母菌表达的溶葡球菌酶的稳定性远远高于毕赤酵母菌和大肠杆菌表达的溶葡球菌酶以及市售的溶葡球菌酶。
实施例2.利用溶葡球菌酶提取金黄色葡萄球菌总蛋白
(一)总蛋白提取
将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，Cowan I)(CGMCC NO：1.1476)接种于LB液体培养基中，37℃摇床培养至对数期，收集菌液，用于提取菌体总蛋白。采用本发明建立的方法提取金黄色葡萄球菌的总蛋白，同时设置超声波破碎方法和溶菌酶方法为对照，在同等菌体数量的情况下比较目标蛋白释放水平。
1、本发明的金黄色葡萄球菌总蛋白提取方法
(1)取1mL金黄色葡萄球菌的菌液，6000rpm离心3min，弃掉上清液，保留菌体；
(2)用400μL反应缓冲液I重悬菌体，然后加入10μL实施例1中由酿酒酵母菌表达的溶葡球菌酶(1mg/mL，纯度>90％)，37℃温育30min，得到酶解产物；
(3)用pH7.4的PBS溶液稀释酶解产物至1mL，即得金黄色葡萄球菌总蛋白提取物。
2、超声波破碎方法
(1)取1mL金黄色葡萄球菌的菌液，6000rpm离心3min，弃掉上清液，保留菌体；
(2)用1mL PBS溶液(137mM NaCl；2.7mM KCl；8mM NaH2PO4；2mM K2HPO4；pH7.4)重悬菌体；
(3)设置超声条件为功率150W，每超声5s，停2s，总时间10min，产物即为金黄色葡萄球菌总蛋白提取物。
3、溶菌酶方法
(1)取1mL金黄色葡萄球菌的菌液，6000rpm离心3min，弃掉上清液，保留菌体；
(2)加1mL TE(10mM Tris-HCl，pH 8.0；1mM EDTA)缓冲液重悬菌体，然后加入10μL溶菌酶(20mg/mL)(Sigma-Aldrich，货号L6876)，37℃水浴保温1h(期间不断振荡)，产物即为金黄色葡萄球菌总蛋白提取物。
(二)蛋白提取效果检测
利用金黄色葡萄球菌胞内核酸酶蛋白(thermonuclease)为检测靶标。金黄色葡萄球菌胞内核酸酶蛋白的Genebank登录号为CAG40333.1，该蛋白记载在非专利文献：MatthewT.G.Holden,Edward J.Feil etc.Complete genomes of two clinical Staphylococcusaureus strains:Evidence for the rapid evolution of virulence and drugresistance.PNAS.2004 101(26):9786-9791)中。委托四川维度创研生物科技有限公司制备金黄色葡萄球菌胞内核酸酶蛋白并进一步制备该蛋白的兔多克隆抗体，采用间接ELISA方法测定金黄色葡萄球菌胞内核酸酶蛋白的释放水平。
间接ELISA方法测定金黄色葡萄球菌胞内核酸酶蛋白的步骤如下：
(1)在酶标板孔中加入50μL金黄色葡萄球菌总蛋白提取液，50μL包被液(100mMNa2CO3(pH9.6)或者40mM Tris-HCl(pH8.5))，室温孵育2h或4℃过夜。
(2)倒空液体并拍干残留液体，用200μL洗涤液清洗两次。洗涤液的配方为：0.05％(v/v)Tween-20；137mM NaCl；2.7mM KCl；8mM NaH2PO4；2mM K2HPO4；pH7.4。
(3)每个孔中加200μL封闭液(2.5％g/ml脱脂奶粉)，孵育1h。
(4)倒空液体并拍干残留液体，用200μL洗涤液清洗两次。
(5)每个孔中加100μL核酸酶蛋白兔多克隆抗体(由四川维度创研生物科技有限公司制备，抗体稀释比例：1:1000)，37℃孵育1h或室温孵育3h。
(6)倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复3次。
(7)每个孔中加100μL二抗(启泰生物，货号RG01，识别表位：兔IgG，抗体稀释比例：1:5000)，室温孵育1h。
(8)倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复3次。
(9)用洗涤液浸泡5min，拍干残留液体，这次的洗涤步骤对于减少背景信号是很重要的。
(10)每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复5次。
(11)每个孔中加100μL TMB底物(搏铭赛，货号D7537)，显色30min后立即在405-410nm处读数。
表3.ELISA测定核酸酶蛋白释放水平的实验结果
注：每个样品每个稀释度做两个平行检测。
如表3所示，采用本发明的方法提取金黄色葡萄球菌总蛋白的效果最好，金黄色葡萄球菌胞内核酸酶蛋白的释放水平远远高于超声波破碎方法或溶菌酶方法。由此表明，本发明的蛋白提取方法对于金黄色葡萄球菌的总蛋白提取有非常显著的针对性优势，特别是在细胞裂解过程中呈现极高的效率。采用本发明的方法提取金黄色葡萄球菌的总蛋白，操作简便易行，蛋白释放率高，裂解产物黏度低，可适配各种常规免疫学检测方法。
实施例3.利用溶葡球菌酶提取金黄色葡萄球菌总DNA
(一)总DNA提取
将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，Cowan I)(CGMCC NO：1.1476)接种于LB液体培养基中，37℃摇床培养至对数期，收集菌液，用于提取菌体总DNA。采用本发明建立的方法提取金黄色葡萄球菌的总DNA，以常规的金黄色葡萄球菌DNA提取法作为对照。
1、本发明的金黄色葡萄球菌总DNA提取方法
(1)取1mL金黄色葡萄球菌的菌液，6000rpm离心3min，弃掉上清液，保留菌体；
(2)用400μL反应缓冲液II重悬菌体，然后加入10μL实施例1中由酿酒酵母菌表达的溶葡球菌酶(1mg/mL，纯度>90％)，37℃温育15min；
(3)加入400μL核酸释放缓冲液(4M GuSCN)，混合均匀，室温放置15分钟；
(4)将反应物转移至核酸结合小柱(Biocomma，货号RP20-A)，10000rpm离心2min，将滤出液再次转移至小柱中，重复离心；
(5)丢弃滤出液，往小柱中加入700μL核酸清洗液，10000rpm离心2min，将小柱晾干至无乙醇味；
(6)往小柱中加入无菌水40μL，室温放置5min，套上EP管(小型离心管)，10000rpm离心2min，收集提取物。
2、常规的金黄色葡萄球菌DNA提取法
(1)取1mL金黄色葡萄球菌的菌液，6000rpm离心3min，弃掉上清液，保留菌体；
(2)加1mL TE(10mM Tris-HCl，pH 8.0；1mM EDTA)缓冲液重悬菌体，加人10μL溶菌酶(20mg/mL)(Sigma-Aldrich，货号L6876)，37℃水浴保温1h(期间不断振荡)，然后再加入10μL蛋白酶K(20mg/mL)(Sigma-Aldrich，货号P6556)，37℃水浴1h；
(3)加入200μL 10％g/ml SDS，沸水浴10min，然后12000rpm离心5min；
(4)取上清液至干净的EP管中，然后加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，充分混匀后12000rpm离心5min；
(5)取上清至干净的EP管中，加入0.1倍体积的乙酸钠(2.5mol/L，pH 5.4)和2倍体积预冷的无水乙醇，－20℃放置10min后，12000rpm离心5min；
(6)去上清液后加入1mL 75％(v/v)乙醇洗涤，12000rpm离心5min，重复1次洗涤和离心；
(7)去上清液后，晾干残余乙醇，加40μL灭菌超净水溶解DNA，保存。
(二)DNA提取效率检测
将上述两种方法提取的DNA，取相同的上样量进行琼脂糖凝胶电泳，检测核酸得率及核酸完整性。结果显示，采用本发明的DNA提取方法获得的金黄色葡萄球菌总DNA十分完整，电泳条带单一且清晰(图4)；而采用常规的金黄色葡萄球菌DNA提取法获得的金黄色葡萄球菌总DNA出现断裂，电泳结果出现较长的拖尾(图5)。
同时，使用紫外分光光度计检测上述两种方法提取的DNA溶液的浓度和纯度。如表4所示，采用本发明方法获得的金黄色葡萄球菌总DNA的浓度和纯度均明显高于常规方法。由此表明，本发明的DNA提取方法对于金黄色葡萄球菌的总DNA提取有非常显著的针对性优势，特别是在细胞裂解过程中呈现极高的效率。采用本方法提取金黄色葡萄球菌的DNA，耗时少，无需苯酚氯仿，产物中RNA含量低，DNA的纯度高且得率高。
表4.紫外分光光度计测定结果
浓度ng/uL
OD260/OD280
OD230/OD260
本案方法
2117.5
1.9
0.48
常规方法
749.5
2.3
0.49
序列表
<110> 成都正能生物技术有限责任公司
<120> 用于提取金黄色葡萄球菌总蛋白的方法及试剂盒
<130> P200248-ZNS
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Ala Thr His Glu His Ser Ala Gln Trp Leu Asn Asn Tyr Lys Lys
1 5 10 15
Gly Tyr Gly Tyr Gly Pro Tyr Pro Leu Gly Ile Asn Gly Gly Met His
20 25 30
Tyr Gly Val Asp Phe Phe Met Asn Ile Gly Thr Pro Val Lys Ala Ile
35 40 45
Ser Ser Gly Lys Ile Val Glu Ala Gly Trp Ser Asn Tyr Gly Gly Gly
50 55 60
Asn Gln Ile Gly Leu Ile Glu Asn Asp Gly Val His Arg Gln Trp Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Lys Tyr Asn Val Lys Val Gly Asp Tyr Val Lys Ala
85 90 95
Gly Gln Ile Ile Gly Trp Ser Gly Ser Thr Gly Tyr Ser Thr Ala Pro
100 105 110
His Leu His Phe Gln Arg Met Val Asn Ser Phe Ser Asn Ser Thr Ala
115 120 125
Gln Asp Pro Met Pro Phe Leu Lys Ser Ala Gly Tyr Gly Lys Ala Gly
130 135 140
Gly Thr Val Thr Pro Thr Pro Asn Thr Gly Trp Lys Thr Asn Lys Tyr
145 150 155 160
Gly Thr Leu Tyr Lys Ser Glu Ser Ala Ser Phe Thr Pro Asn Thr Asp
165 170 175
Ile Ile Thr Arg Thr Thr Gly Pro Phe Arg Ser Met Pro Gln Ser Gly
180 185 190
Val Leu Lys Ala Gly Gln Thr Ile His Tyr Asp Glu Val Met Lys Gln
195 200 205
Asp Gly His Val Trp Val Gly Tyr Thr Gly Asn Ser Gly Gln Arg Ile
210 215 220
Tyr Leu Pro Val Arg Thr Trp Asn Lys Ser Thr Asn Thr Leu Gly Val
225 230 235 240
Leu Trp Gly Thr Ile Lys
245
<210> 2
<211> 807
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgggcaaac gtaagagcac cgctgcaaca catgaacatt cagcacaatg gttgaataat 60
tacaaaaaag gatatggtta cggtccttat ccattaggta taaatggcgg tatgcactac 120
ggagttgatt tttttatgaa tattggaaca ccagtaaaag ctatttcaag cggaaaaata 180
gttgaagctg gttggagtaa ttacggagga ggtaatcaaa taggtcttat tgaaaatgat 240
ggagtgcatc gtcaatggta tatgcatctg agtaaatata atgttaaagt aggagattat 300
gtcaaagctg gtcaaataat cggttggtct ggaagcactg gttattctac agcaccacat 360
ttacacttcc aacgtatggt taattcattt tcaaattcaa ctgcccaaga tccaatgcct 420
ttcttaaaga gcgcaggata tggaaaagca ggtggtacag taactccaac gccgaataca 480
ggttggaaaa caaacaaata tggcacactg tataaatcag agtcagctag cttcacacct 540
aatacagata taataacacg tacgactggt ccatttcgtt ctatgccgca gtcaggagtc 600
ttaaaagcag gtcaaacaat tcattatgat gaagtgatga aacaagacgg tcatgtttgg 660
gtaggttata caggtaacag tggccaacgt atttacttgc ctgtacgtac atggaataaa 720
tctactaata ctttaggtgt tctttgggga actataaagg cgagcgtggt tagcaaatct 780
ctggaaaagg atggccacgg ttaatga 807
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Gly Lys Arg Lys Ser Thr
1 5
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ala Ser Val Val Ser Lys Ser Leu Glu Lys Asp Gly His Gly
1 5 10
<210> 5
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Gly Lys Arg Lys Ser Thr Ala Ala Thr His Glu His Ser Ala Gln
1 5 10 15
Trp Leu Asn Asn Tyr Lys Lys Gly Tyr Gly Tyr Gly Pro Tyr Pro Leu
20 25 30
Gly Ile Asn Gly Gly Met His Tyr Gly Val Asp Phe Phe Met Asn Ile
35 40 45
Gly Thr Pro Val Lys Ala Ile Ser Ser Gly Lys Ile Val Glu Ala Gly
50 55 60
Trp Ser Asn Tyr Gly Gly Gly Asn Gln Ile Gly Leu Ile Glu Asn Asp
65 70 75 80
Gly Val His Arg Gln Trp Tyr Met His Leu Ser Lys Tyr Asn Val Lys
85 90 95
Val Gly Asp Tyr Val Lys Ala Gly Gln Ile Ile Gly Trp Ser Gly Ser
100 105 110
Thr Gly Tyr Ser Thr Ala Pro His Leu His Phe Gln Arg Met Val Asn
115 120 125
Ser Phe Ser Asn Ser Thr Ala Gln Asp Pro Met Pro Phe Leu Lys Ser
130 135 140
Ala Gly Tyr Gly Lys Ala Gly Gly Thr Val Thr Pro Thr Pro Asn Thr
145 150 155 160
Gly Trp Lys Thr Asn Lys Tyr Gly Thr Leu Tyr Lys Ser Glu Ser Ala
165 170 175
Ser Phe Thr Pro Asn Thr Asp Ile Ile Thr Arg Thr Thr Gly Pro Phe
180 185 190
Arg Ser Met Pro Gln Ser Gly Val Leu Lys Ala Gly Gln Thr Ile His
195 200 205
Tyr Asp Glu Val Met Lys Gln Asp Gly His Val Trp Val Gly Tyr Thr
210 215 220
Gly Asn Ser Gly Gln Arg Ile Tyr Leu Pro Val Arg Thr Trp Asn Lys
225 230 235 240
Ser Thr Asn Thr Leu Gly Val Leu Trp Gly Thr Ile Lys Ala Ser Val
245 250 255
Val Ser Lys Ser Leu Glu Lys Asp Gly His Gly
260 265
<210> 6
<211> 833
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggatccgaat tcatgggcaa acgtaagagc accgctgcaa cacatgaaca ttcagcacaa 60
tggttgaata attacaaaaa aggatatggt tacggtcctt atccattagg tataaatggc 120
ggtatgcact acggagttga tttttttatg aatattggaa caccagtaaa agctatttca 180
agcggaaaaa tagttgaagc tggttggagt aattacggag gaggtaatca aataggtctt 240
attgaaaatg atggagtgca tcgtcaatgg tatatgcatc tgagtaaata taatgttaaa 300
gtaggagatt atgtcaaagc tggtcaaata atcggttggt ctggaagcac tggttattct 360
acagcaccac atttacactt ccaacgtatg gttaattcat tttcaaattc aactgcccaa 420
gatccaatgc ctttcttaaa gagcgcagga tatggaaaag caggtggtac agtaactcca 480
acgccgaata caggttggaa aacaaacaaa tatggcacac tgtataaatc agagtcagct 540
agcttcacac ctaatacaga tataataaca cgtacgactg gtccatttcg ttctatgccg 600
cagtcaggag tcttaaaagc aggtcaaaca attcattatg atgaagtgat gaaacaagac 660
ggtcatgttt gggtaggtta tacaggtaac agtggccaac gtatttactt gcctgtacgt 720
acatggaata aatctactaa tactttaggt gttctttggg gaactataaa ggcgagcgtg 780
gttagcaaat ctctggaaaa ggatggccac ggttaatgac tcgaggcggc cgc 833
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