一种肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的制备方法及用途
阅读说明：本技术 一种肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的制备方法及用途 (Preparation method and application of cinnamic acid modified hydroxypropyl chitosan derivative ) 是由 乐琳 王敏 赵玲玉 彭池方 王周平 于 2021-08-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的制备方法及用途,肉桂酸的取代度为0.23-0.93,肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的制备方法包括,将壳聚糖进行水溶性化学改性,引入羟丙基亲水性基团,得到水溶性羟丙基壳聚糖,再将肉桂酸引入羟丙基壳聚糖上,经纯化得到肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物。本发明制备方法简单,成本低、提纯方法简便、性质稳定,得到的肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物具有良好水溶性和抗菌活性,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均具有很好的抗菌活性,在医药、食品、化妆品和农业等领域具有很好的应用前景。(The invention discloses a preparation method and application of a cinnamic acid modified hydroxypropyl chitosan derivative, wherein the substitution degree of cinnamic acid is 0.23-0.93, and the preparation method of the cinnamic acid modified hydroxypropyl chitosan derivative comprises the steps of carrying out water-soluble chemical modification on chitosan, introducing hydroxypropyl hydrophilic groups to obtain water-soluble hydroxypropyl chitosan, introducing cinnamic acid to the hydroxypropyl chitosan, and purifying to obtain the cinnamic acid modified hydroxypropyl chitosan derivative. The preparation method is simple, the cost is low, the purification method is simple and convenient, the property is stable, the obtained cinnamic acid modified hydroxypropyl chitosan derivative has good water solubility and antibacterial activity, has good antibacterial activity on staphylococcus aureus and escherichia coli, and has good application prospects in the fields of medicines, foods, cosmetics, agriculture and the like.)
技术领域
本发明属于食品添加剂技术领域，具体涉及一种肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的制备方法及用途。
背景技术
随着食品工业的发展，为延长食品的保质期限，抑制微生物的污染，传统的物理防腐方法已经不再满足需求，添加防腐剂的方法因其简单、持久、成本更低得到了快速应用。因化学防腐剂可能具有潜在的累积性毒性，滥用或过量使用都会造成食品安全问题。随着人们生活水平的提高和安全意识的增强，一些安全、无毒、绿色的天然防腐剂更受人们青睐。
壳聚糖是一种从动物相关的物质中提取的天然防腐剂，分布广泛，获取简便，价格低廉，应用前景广阔，具有一定的抗菌活性，能够有效抑制多种微生物的生长繁殖。但当pH大于6.5时，壳聚糖的水溶性并不理想，这在很大程度上限制了其应用范围。
肉桂酸是从肉桂皮或安息香分离出的天然有机酸，对人体安全，具有抗菌、抗炎、抗氧化等作用，可以应用于粮食、蔬菜、水果等食品的防霉防腐杀菌，主要用于香精香料、食品添加剂、医药工业等领域，有多种肉桂酸类化合物。但肉桂酸不溶于水，这大大限制了其在食品工业中的应用和潜在的价值。
然而，由于壳聚糖是天然大分子产物，当作为食品防腐抗菌剂使用时，与传统的常用化学防腐剂相比，仍有抗菌活性低、水溶性差等缺点，所以目前在食品工业中的应用并不是很普遍。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有食品添加剂领域的技术空白，提出了本发明。
本发明的一个目的是提供一种肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物。
因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物，其化学结构式如下所示，
其中，DD为脱乙酰度80％，羟丙基的取代度为1.12，肉桂酸的取代度为0.23-0.93。
作为本发明所述的肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的一种优选方案，其中：所述壳聚糖为分子量为100kDa，脱乙酰度为80％的壳聚糖。
作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的制备方法，其包括，将羟丙基壳聚糖溶解于超纯水，将肉桂酸溶解于二甲基亚砜，然后用恒压滴定漏斗将肉桂酸溶液缓慢加入到羟丙基壳聚糖溶液中，加入一定量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌并调节pH值，将混合液进行磁力搅拌，透析，真空冷冻干燥，即得肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物。
作为本发明所述的肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的制备方法的一种优选方案，其中：所述羟丙基壳聚糖与所述肉桂酸的摩尔比为2：1～3。
作为本发明所述的肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的制备方法的一种优选方案，其中：所述的调节pH值为5.5。
作为本发明所述的肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的制备方法的一种优选方案，其中：所述壳聚糖为分子量为100kDa，脱乙酰度为80％的壳聚糖。
作为本发明所述的肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的制备方法的优选方案，其中：所述的将混合液磁力搅拌在室温下进行，磁力搅拌反应时长为24h。
作为本发明所述的肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的制备方法的一种优选方案，其中：还包括纯化步骤，将磁力搅拌结束后的所得混合液用超纯水透析72h，所用透析袋的截断分子量为1000Da，再进行真空冷冻干燥，最终得到经纯化的肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物。
作为本发明所述的肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的制备方法的一种优选方案，其中：所述羟丙基壳聚糖的制备方法为，向壳聚糖中加入质量分数为50％的氢氧化钠水溶液，室温下搅拌3h使其混合均匀，-20℃下放置24h，将其解冻并转移到含有异丙醇的三颈烧瓶中，室温下剧烈搅拌30min，加入25％四甲基氢氧化铵和环氧丙烷，室温下继续搅拌1h，45℃回流6h，冷却至室温，用超纯水透析纯化，真空冷冻干燥，即得到羟丙基壳聚糖。
本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物在医药、食品、化妆品和农业领域中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明通过将壳聚糖进行水溶性改性，引入羟丙基亲水性基团，得到水溶性羟丙基壳聚糖，再将肉桂酸引入羟丙基壳聚糖上，增强壳聚糖的抗菌活性，制备得到具有优良水溶性和抗菌活性的肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物，在医药、食品、化妆品和农业领域中具有良好的应用前景。
(2)本发明肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有很好的抗菌活性；壳聚糖在pH值大于6.5时溶解性差，肉桂酸在水中不溶解，仅在多种有机溶剂中溶解，而衍生物在水溶液和多数有机溶剂中均溶解，羟丙基的引入使壳聚糖的水溶性明显提高，肉桂酸的引入使壳聚糖的抑菌性大大提高，且与壳聚糖和肉桂酸相比，衍生物溶解范围更广；本发明反应步骤简便，产物的取代度和得率较高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为壳聚糖的红外光谱图；
图2为本发明实施例中制备的肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的红外光谱图；
图3为壳聚糖的1H核磁共振图；
图4为羟丙基壳聚糖的1H核磁共振图；
图5为本发明实施例中制备的肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的1H核磁共振图；
图6为壳聚糖、羟丙基壳聚糖、肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物对金黄色葡萄球菌的抑制表观对比图，其中，(a)空白对照，(b)壳聚糖，(c)羟丙基壳聚糖，(d)肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物1，(e)肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物2，(f)肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物3；
图7为壳聚糖、羟丙基壳聚糖、肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物对大肠杆菌的抑制表观对比图，其中，(a)空白对照，(b)壳聚糖，(c)羟丙基壳聚糖，(d)肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物1，(e)肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物2，(f)肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物3；
图8为肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的合成路线图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明具有良好水溶性和抗菌活性的肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的制备方法如下：
首先以壳聚糖和环氧丙烷为原料，将壳聚糖进行水溶性化学改性，引入羟丙基亲水性基团，得到水溶性羟丙基壳聚糖；
再将肉桂酸引入羟丙基壳聚糖上，经纯化得到肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物，其合成路线如图8。
实施例1：
肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的制备方法包括以下几个步骤：
1.羟丙基壳聚糖的制备
选用分子量为100kDa，脱乙酰度为80％的壳聚糖。
向5g壳聚糖中加入15mL质量分数为50％的氢氧化钠水溶液，室温下搅拌3h使其混合均匀，-20℃冰箱中放置24h，使壳聚糖充分碱化膨胀；将混合物解冻并转移到含有50mL异丙醇的三颈烧瓶中，室温下剧烈搅拌30min，搅拌状态下加入1mL 25％四甲基氢氧化铵和50mL环氧丙烷，室温下继续搅拌1h，45℃回流6h，反应完成后，冷却至室温，用超纯水透析纯化72h(透析袋的截断分子量为1000Da)，真空冷冻干燥，即得到羟丙基壳聚糖。
2.肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的制备
羟丙基壳聚糖和肉桂酸的摩尔比为2:1。
将1mol羟丙基壳聚糖溶解于30mL超纯水，将0.5mol肉桂酸溶解于30mL二甲基亚砜，然后用恒压滴定漏斗将肉桂酸溶液缓慢加入到羟丙基壳聚糖溶液中，加入0.5mol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌，调节pH值为5.5，将混合液在室温下进行磁力搅拌24h，用超纯水透析纯化72h(透析袋的截断分子量为1000Da)，真空冷冻干燥，即得肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物。
使用红外光谱和核磁共振氢谱对其进行表征。
图1为壳聚糖的红外光谱图，其中，3440cm-1为O-H与N-H的伸缩振动吸收峰，2926cm-1为C-H伸缩振动的吸收峰，1658cm-1为C＝O的伸缩振动吸收峰，1519cm-1为NH2的弯曲振动吸收峰，1160cm-1与1030cm-1为C-O伸缩振动的吸收峰，893cm-1为环伸缩振动吸收峰。
图2是本实施例中壳聚糖衍生物的红外光谱图，其中，与原料壳聚糖比较，1519cm-1处氨基的N-H伸缩振动峰减小，在760cm-1和687cm-1处出现肉桂酸中苯环的单取代吸收峰，证明了目标产物成功合成。
图3是本实施例中壳聚糖的1H NMR图，化学位移出现在1.53ppm处的峰对应的是乙酰氨基残基上的-CH3的质子峰。化学位移出现在2.50-2.82ppm处的峰对应的是氨基葡萄糖N的质子峰，多重峰出现在3.82-4.91ppm是氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖上的次甲基氢。
图4是本实施例中羟丙基壳聚糖的1H NMR图，与壳聚糖相比，在1.59ppm处出现了较强的羟丙基的-CH3的特征峰，证明了羟丙基壳聚糖的成功合成。
图5是本实施例中肉桂酸改性羟丙基壳聚糖的1H NMR图，与羟丙基壳聚糖相比，在6.58-8.40ppm处出现了肉桂酸的苯环特征峰，证明了肉桂酸成功引入到羟丙基壳聚糖上，即肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物成功合成。
实施例2：
肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的制备方法包括以下几个步骤：
1.羟丙基壳聚糖的制备
选用分子量为100kDa，脱乙酰度为80％的壳聚糖。
向5g壳聚糖中加入15mL质量分数为50％的氢氧化钠水溶液，室温下搅拌3h使其混合均匀，-20℃冰箱中放置24h，使壳聚糖充分碱化膨胀；将混合物解冻并转移到含有50mL异丙醇的三颈烧瓶中，室温下剧烈搅拌30min，搅拌状态下加入1mL 25％四甲基氢氧化铵和50mL环氧丙烷，室温下继续搅拌1h，45℃回流6h，反应完成后，冷却至室温，用超纯水透析纯化72h(透析袋的截断分子量为1000Da)，真空冷冻干燥，即得到羟丙基壳聚糖。
2.肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的制备
羟丙基壳聚糖和肉桂酸的摩尔比为1:1。
将1mol羟丙基壳聚糖溶解于30mL超纯水，将1mol肉桂酸溶解于30mL二甲基亚砜，然后用恒压滴定漏斗将肉桂酸溶液缓慢加入到羟丙基壳聚糖溶液中，加入1mol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌，调节pH值为5.5，将混合液在室温下进行磁力搅拌24h，用超纯水透析纯化72h(透析袋的截断分子量为1000Da)，真空冷冻干燥，即得肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物。
实施例3：
肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的制备方法包括以下几个步骤：
1.羟丙基壳聚糖的制备
选用分子量为100kDa，脱乙酰度为80％的壳聚糖。
向5g壳聚糖中加入15mL质量分数为50％的氢氧化钠水溶液，室温下搅拌3h使其混合均匀，-20℃冰箱中放置24h，使壳聚糖充分碱化膨胀；将混合物解冻并转移到含有50mL异丙醇的三颈烧瓶中，室温下剧烈搅拌30min，搅拌状态下加入1mL 25％四甲基氢氧化铵和50mL环氧丙烷，室温下继续搅拌1h，45℃回流6h，反应完成后，冷却至室温，用超纯水透析纯化72h(透析袋的截断分子量为1000Da)，真空冷冻干燥，即得到羟丙基壳聚糖。
2.肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的制备
羟丙基壳聚糖和肉桂酸的摩尔比为2:3。
将1mol羟丙基壳聚糖溶解于30mL超纯水，将1.5mol肉桂酸溶解于30mL二甲基亚砜，然后用恒压滴定漏斗将肉桂酸溶液缓慢加入到羟丙基壳聚糖溶液中，加入1.5mol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌，调节pH值为5.5，将混合液在室温下进行磁力搅拌24h，用超纯水透析纯化72h(透析袋的截断分子量为1000Da)，真空冷冻干燥，即得肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物。
实施例4：
将实施例1-3中制得的肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物(分别命名为HPCS-CA1、HPCS-CA2、HPCS-CA3)。
本发明中根据元素分析结果，肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的产率和取代度由如下公式进行计算：
DD＝1-DA
式中，
DA—壳聚糖的乙酰度；
DD—壳聚糖的脱乙酰度；
RC/N—壳聚糖中碳氮质量百分比；
MN—氮原子相对原子质量；
MC—碳原子相对原子质量；
DS'—羟丙基壳聚糖的取代度；
R'C/N—羟丙基壳聚糖中碳氮质量百分比；
DS”—肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的取代度；
R”C/N—肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物中碳氮质量百分比。
元素分析结果如下，见下表1。
表1
实施例5：
测定本发明实例1～3制得的肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物、壳聚糖、羟丙基壳聚糖、肉桂酸在pH值为7.0的水中的溶解性，结果见表2。
表2
实施例6：
肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的抗菌活性：
选择革兰氏阴性和革兰氏阳性菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)作为测试菌。挑取菌株至LB培养基中生长并培养至二代，使菌液浊度与0.5麦氏比浊管相当，用MH液体培养基稀释约100倍至所需要的水平(约106CFU/mL)的细菌悬液。
将壳聚糖、羟丙基壳聚糖、肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物溶于体积分数为1％的乙酸水溶液中，用1mol/L氢氧化钠水溶液调节pH值为6.0，使样品的初始浓度为4096μg/mL，通过二倍稀释法测定样品的最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。
在96孔板每行的第一孔加200μL抗菌样品液，取100μL至第二孔，向第二孔加100μL无菌生理盐水，混合均匀后吸取100μL至第三孔，以此类推，连续稀释至第八孔，丢弃最后100μL，最终得到样品的浓度分别为4096，2048，1024，512，256，128，64和32μg/mL。
向96孔板每孔加入100μL菌液，以无菌生理盐水作为空白，每个样品设置3组平行，实验重复3次。
混合均匀后在37℃培养箱中放置24h。将目测清澈的孔中最小浓度记为该样品的MIC值，将所有目测清澈的孔吸取100μL涂布在MH固体培养基平板上，37℃培养24h后，将无菌落生长的最小浓度记为MBC值。
MIC值和MBC值的结果见表3。
表3
壳聚糖、羟丙基壳聚糖、肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性，分别在图6、7中显示。壳聚糖(b)，羟丙基壳聚糖(c)，肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物(d，e，f)与空白对照相比，可以不同程度抑制大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的生长，证明了改性的材料具有较好的抗菌活性。
本发明提供了一种肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物的制备方法，以壳聚糖和环氧丙烷为原料，将壳聚糖进行水溶性化学改性，引入羟丙基亲水性基团，得到水溶性羟丙基壳聚糖；将肉桂酸引入羟丙基壳聚糖上，经纯化得到肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物；利用红外光谱和核磁共振氢谱对衍生物进行分析确证，肉桂酸与羟丙基壳聚糖有效结合，通过元素分析得到衍生物的羟丙基的取代度为1.124，肉桂酸的取代度为0.232-0.933。
本发明制备方法简单，成本低、提纯方法简便、性质稳定，得到的肉桂酸改性羟丙基壳聚糖衍生物具有良好水溶性和抗菌活性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均具有很好的抗菌活性，在医药、食品、化妆品和农业等领域具有很好的应用前景。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。